检测转基因玉米t4-1-1外源基因纯合/杂合状态的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及一种对转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的检测方 法，本发明还涉及针对上述检测所用的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 转基因作物的检测中，不仅需要知道样品中是否含有转基因成分，含有何种转基 因成分，有时还需要确认外源DNA插入的纯合或杂合状态。这种转基因成分的定性检测亦 称为筛选检测。
[0003] 转基因成分检测中，可以将外源DNA看作一个基因座位。纯合体的2倍体基因组 中检测靶标核酸序列，即外源DNA插入特征序列的拷贝数为2;杂合体的2倍体基因组中外 源DNA插入特征序列的拷贝数为1;非转基因材料中则为0。因此，转基因检测过程中，必需 对原材料中靶标核酸序列的遗传特性进行确认，即确认外源DNA插入所产生的特征序列是 纯合还是杂合状态。此外，在转基因作物遗传育种过程中，往往需要将转基因材料与其它材 料进行杂交、转育以获得适合的栽培品种，利用分子生物学手段快速、简便鉴定纯合体/杂 合体育种材料，也有利于缩短育种进程。
[0004] 迄今未止，国内外还没有针对转基因玉米T4-1-1外源基因纯合/杂合状态的检测 方法，只能确定转基因玉米T4-1-1样品中是否含有转基因成分或含有何种转基因成分。
[0005] 因此，找到能直接鉴别玉米T4-1-1样品中外源DNA插入的纯合或杂合状态的方法 并开发相应的检测试剂，很有必要。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种针对转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状 态的检测方法，并开发针对上述检测所用的试剂盒。
[0007] 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
[0008] 本发明首先设计了一种用于检测转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合 状态的PCR检测引物。根据转基因玉米T4-1-1外源插入片段旁侧序列信息，在玉米染色体 部分设计出一对能够准确检测转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR 检测引物，其核苷酸序列分别为SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示。
[0009] 本发明提供了一种针对转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的检 测方法，其步骤为：
[0010] (1)提取待检测水稻样品的DNA;
[0011] (2)以上述提取的DNA为模板，以SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列 为扩增引物，建立PCR扩增体系，并进行PCR扩增；
[0012] 如果仅扩增出一条SEQIDNo. 3所示核苷酸序列的片段，鉴定为纯合转基因玉米 T4-1-1；
[0013] 如果扩增出分别为SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4所示核苷酸序列的两条片段，鉴 定为杂合转基因玉米T4-1-1 ;
[0014] 如果仅扩增出一条SEQIDNo. 4所示核苷酸序列的片段，鉴定为不是转基因玉米 T4-1-1。
[0015] 其中，所述的从待检测玉米样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA 的各种常用方法，例如可以是CTAB法、SDS法或经验证适用于植物DNA提取的试剂盒等各 种方法。
[0016] 本发明中所述的PCR扩增体系可参考以下方法建立：反应体系的总体积为 25.〇4 1^，其中，10\1^丁&9 811打6111(]\%2卞1118)缓冲液2.5 4 1^丁&1^1^11^丁&9(51]/^1) 聚合酶0·25μL，dNTPMixture(2·5mMeach)4·0μL，10μmol/LSEQIDNo·l所示的引物 lμL，10μmol/LSEQIDNo·2所示的引物lμL，25ng/μLDNA模板2μL，余量为双蒸水。
[0017] 所述的PCR扩增条件优选为：94°C变性lmin;(94°C20s，65°C5min)30个循环； 72°C延伸 5min。
[0018] 本发明还提供了一种用于转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的 PCR检测试剂盒，其特征是包括有一对PCR检测引物，所述引物的核苷酸序列分别为SEQID No. 1 和SEQIDNo. 2 所示。
[0019] 本发明检测方法能够准确的检测出转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂 合状态，为转基因玉米T4-1-1成分检测标准物质研制、转基因定量检测、样品鉴定奠定了 基础。
【附图说明】
[0020] 图1PCR方法鉴定转基因玉米T4-1-1纯合体琼脂糖凝胶电泳图；其中
[0021] M:Trans2KplusIIDNAMarker;1 :空白对照；2 :T4-1-1 纯合体；3 :T4-1-1 受 体和Τ4-1-1纯合体混合样品；4 :阴性对照。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，这些实施例仅是范例性的，本领域技 术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形 式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0023] 实施例1转基因玉米Τ4-1-1外源基因纯合/杂合状态的PCR检测方法的建立
[0024]1、引物设计及序列
[0025] 该转化体外源整合结构位于玉米基因组1号染色体上，其中，引物T4-1-1-F位于 5'端玉米基因组上；引物T4-1-1-R位于3'端玉米基因组上。
[0026] 引物序列
[0027]T4-1-1-F：TTAGCAGAGTCGTGAGAGTTTAG(SEQIDNo. 1)
[0028]T4-1-1-R：TAGTAAATGTGATGAAACCATGAA(SEQIDNo. 2)
[0029] 2、PCR扩增反应体系及反应程序：
[0030]反应体系：10XLATaqBufferII(Mg2+Plus)缓冲液2. 5yL，TaKaRaLATaq(5U/ μ1)聚合酶 0· 25μL，dNTPMixture(2. 5mMeach) 4. 0μL，10μmol/LSEQIDNo. 1 所示的 引物lμL，10μmol/LSEQIDNo.2所示的引物lμL，25ng/μLDNA模板2μL，用去离子水 补至25μL。
[0031]PCR扩增程序：94°C变性lmin;(94°C20s，65°C5min)30 个循环；72°C延伸 5min。
[0032] 3、结果判定
[0033] 纯合转基因玉米T4-1-1中仅能扩增出一条4419bp的片段；杂合转基因玉米 T4-1-1同时扩增出两条片段，一条为4419bp，另一条为386bp;而非转基因玉米中只能扩增 出一条386bp片段。
[0034] 实施例2转基因玉米T4-1-1外源基因纯合/杂合状态的PCR检测的应用实验
[0035] 一、植物材料
[0036] 1、转基因玉米T4-1-1纯合体；
[0037] 2、非转基因水稻：T4-1-1受体；
[0038] 3、Τ4-1-1受体和转基因玉米Τ4-1-1纯合体混合样品。
[0039] 二、实验方法
[0040] (一）、植物基因组DNA的提取与检测
[0041] 1.植物材料DNA提取
[0042] 采用植物基因组DNA提取试剂盒DP305 (天根生化科技有限公司）进行转基因玉 米Τ4-1-1及其受体玉米基因组DNA提取和纯化。提取步骤参见试剂盒说明书。
[0043] 2.DNA检测
[0044] 采用紫外分光光度计检测DNA浓度与纯度时，DNA应在0D260处有显著吸收峰， 0D260/0D280 比值应为L7-L9。
[0045](二）、PCR反应体系及反应程序的建立
[0046] 按照实施例1所述的PCR扩增反应体系及反应程序进行。
[0047] 三、实验结果
[0048] 实验结果如图1所示；纯合体Τ4-1-1仅能扩增出一条4419bp的片段；Τ4-1-1受 体和T4-1-1纯合体混合样品扩增出两条片段，一条为4419bp，另一条为386bp;非转基因玉 米只能扩增出一条386bp片段。
【主权项】
1. 一种用于检测转基因玉米T4-1-1外源基因纯合/杂合状态的PCR检测引物对，其核 苷酸序列分别为SEQIDNo. 1、SEQIDNo. 2所示。2. -种用于测定转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测试剂 盒，其特征是包括有权利要求1所述的PCR检测引物对。3. -种检测转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的方法，其步骤为： (1) 提取待检测水稻样品的DNA; (2) 以上述提取的DNA为模板，以SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列为引 物，建立PCR扩增体系，并进行PCR扩增； ⑶根据扩增出的DNA片段，确定外源基因插入的纯合/杂合状态： 如果仅扩增出一条SEQIDNo.3所示核苷酸序列的片段，鉴定为纯合转基因玉米T4-1-1 ； 如果扩增出分别为SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4所示核苷酸序列的两条片段，鉴定为 杂合转基因玉米T4-1-1 ; 如果仅扩增出一条SEQIDNo.4所示核苷酸序列的片段，鉴定为不是转基因玉米T4-1-1。4. 权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增体系按照以下方式建立：反应 体系的总体积为25.〇4 1^，其中，10\1^丁&9 811打6111(]\%2卞1118)缓冲液2.5 4 1^了&1^1^ LATaq(5U/μl)聚合酶0·20μL，dNTPMixture(2·5mMeach)4·0μL，10μmol/LSEQID No. 1 所示的引物 1yL，10ymol/LSEQIDNo. 2所示的引物 1yL，25ng/yLDNA模板2yL， 余量为双蒸水。5. 权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件为：94°C变性lmin; (94°C，20s，65°C，5min) 30 个循环；72°C延伸 5min。 6. SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示序列的核苷酸在制备检测转基因玉米T4-1-1外源 基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测试剂中的应用。 7. SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2所示序列的核苷酸在检测转基因玉米T4-1-1外源基因 插入的纯合/杂合状态中的应用。 8. SEQIDNo. 3和SEQIDNo. 4所示序列的核苷酸在检测转基因玉米T4-1-1外源基因 插入的纯合/杂合状态中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种针对转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的检测方法。本发明设计了PCR检测引物。以从待检测样品提取的DNA为模板，用所述引物进行PCR扩增，根据扩增出的DNA片段，可以确定出外源基因插入的纯合/杂合状态。本发明还提供了用于测定转基因玉米T4-1-1外源基因插入的纯合/杂合状态的PCR检测试剂盒。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68
【公开号】CN105274229
【申请号】CN201510728614
【发明人】张维, 周正富, 余桂容, 郭翠, 徐利远, 林敏
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年10月30日