专利名称：一种以1,2-丁二醇为底物生产R-α-羟基丁酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产R-a-羟基丁酸的方法，具体地说，涉及一种利用氧化葡萄糖杆菌DSM 2003的完整细胞作为生物催化剂催化1，2- 丁二醇生产R- a -羟基丁酸的方法。
背景技术：
a-羟基丁酸是一种重要的工业中间体，可以用来合成异亮氨酸和某些药物。a -羟基丁酸分为R和S两种构型。高纯度手性R- a -羟基丁酸可以用来合成可生物降解的高聚物聚Ct-轻基丁酸[P(2HB)]⑴。另外,R-a -轻基丁酸可用来制备azinothricin家
族抗癌抗生素2’3。经过文献检索，用于高纯度R-a -羟基丁酸生产的起始底物通常有两种。一种是a -酮基丁酸，通过立体选择性的酶还原生成R-a -羟基丁酸4;另一种是外消旋a -羟基丁酸，通过乙酰化反应5或者氧化反应6’7立体特异性拆分，得到高纯度R-a-羟基丁酸。无论是a-酮基丁酸还是外消旋a-羟基丁酸，其价格均较为昂贵且难以获得。鉴于此，R- a -羟基丁酸的大量生产中迫切需要选择一种合适而廉价的起始底物。1,2- 丁二醇具有I位和2位羟基，I位羟基氧化为羧基可产生a -羟基丁酸，因而1，2-丁二醇可作为R-a-羟基丁酸生产的潜在底物；氧化葡萄糖杆菌DSM 2003能够不完全性的立体选择性氧化糖类、醇类以及酸类8，因而其有可能催化1，2_ 丁二醇生产R-a-羟基丁酸。然而，目前的检索结果表明:利用氧化葡萄糖杆菌生产R-a-羟基丁酸的方法未见报道。参考文献:1Tsuji，H.，Okumura, A.，2009.Stereocomplex formation betweenenantiomeric substituted poly (Iactide) s:blends of poly [ (S)-2-hydroxybutyrae]and poly[(R)-2-hydroxybutyrate].Macromolecules 42，7263-7266.
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6Adam，W.，Lazarus,M.，Saha-Mol Ier, C.R.，Schreier, P.，1998.Quantitative transformation of racemic2~hydroxy acids mto(R)-2-hydroxy acids byenantioselective oxidation with glycolate oxidase and subsequent reduction of2—keto acids with D-1actate dehydrogenase.Tetrahedron:Asymmetry 9，351—355.
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发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种以1，2_ 丁二醇为底物生产R-a -羟基丁酸的方法，以克服R-a -羟基丁酸制备中底物外消旋a -羟基丁酸和a-酮基丁酸价格较高的缺陷。本发明所述以1，2_ 丁二醇为底物生产R-a -羟基丁酸的方法，步骤是:(I)制备生物催化剂选取氧化葡萄糖杆菌DSM 2003，常规方法培养，分离并收集菌体，用pH 72 7.5磷酸钾缓冲液洗涤菌体2 4次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到的完整细胞悬液即为生物催化剂，4°C储存备用；其中，上述氧化葡萄糖杆菌使用如下培养基配方培养:D-山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸铵5克/升；磷酸二氢钾2克/升；硫酸镁5克/升；碳酸钙10克/升。⑵转化将步骤(I)中制得的生物催化剂即完整细胞与底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化剂 的浓度为5 120克湿细胞/升、1，2_ 丁二醇的浓度为5 60克/升，并加入乙二胺四乙酸二钠至终浓度5 40毫摩尔/升；在20 50°C，pH 4.0 10.0条件下，以50 180转/分钟振荡I 30小时，得到转化液。(3)制取含R-a -羟基丁酸溶液将步骤(2)中制得的转化液以5，000 10，000转/分离心5 25分钟，或者用
200 400目滤布过滤，去除生物催化剂即完整细胞，所得清液即为含R-a-羟基丁酸溶液。(4)产物R-a -羟基丁酸的检测R-a -羟基丁酸含量检测采用AgilentllOO高压液相色谱系统，色谱柱为AminexHPX-87H ;分析条件为以10毫摩尔/升硫酸为流动相，柱温55°C，流速为0.4毫升/分钟，进样量5微升，采用示差折光检测器。R-a -羟基丁酸对映体过量值测定采用AgilentllOO高压液相色谱系统，色谱柱为手性柱(50X4.6毫米，MCIGEL CRS10W,日本三菱化学)，以2毫摩尔/升硫酸铜水溶液作为流动相，柱温25°C，流速为0.5毫升/分钟，进样量5微升，紫外检测器波长为254纳米。待测样品用两倍体积的高氯酸(5% )酸化，4°C静置2小时后，12000转/分钟离心15分钟，离心上清用0.22微米的水相滤膜过滤，然后色谱分析。对映体过量值=(R-a-羟基丁酸含量-S- a -羟基丁酸含量)+ (R- a -羟基丁酸含量+S- a -羟基丁酸含量)X 100 %。
上述以I，2- 丁二醇为底物生产R-a -羟基丁酸的方法中:步骤⑵所述的1，2- 丁二醇浓度优选为10 50克/升。步骤⑵所述生物催化剂即完整细胞的浓度优选为40 100克湿细胞/升。步骤⑵所述的乙二胺四乙酸二钠浓度优选为10 30毫摩尔/升。步骤⑵所述的温度优选为25 40°C。步骤⑵所述的pH优选为5.0 8.0。步骤(2)所述振荡时间优选为4 25小时。本发明利用生物催化剂即氧化葡萄糖杆菌DSM 2003的完整细胞，选择性地氧化1，2_ 丁二醇的I位羟基，成功实现R-a-羟基丁酸的立体特异性合成。本发明方法具有以下特点:(I)采用生物催化的方法，反应体系简单，反应条件温和，步骤简短，操作简便。生物催化剂可以容易地除去，便于后续产物分离纯化。(2)反应周期较短，产物R-a -羟基丁酸可积累到较高浓度。(3)底物1，2- 丁二醇价格低廉，易于获得。(4)产物对映体过量率高,可达到99%以上。
图1R- a -羟基丁酸标准品高压液相色谱检测结果。图2S- a -羟基丁酸标准品高压液相色谱检测结果。图3R- a -羟基丁酸产品高压液相色谱检测结果。图4R- a -羟基丁酸产品质谱检测结果。
具体实施例方式实施例1:(I)制备生物催化剂选取氧化葡萄糖杆菌DSM 2003 (购买自德国微生物保藏中心)，常规方法培养，分离并收集菌体，用pH 7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体3次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到的完整细胞悬液即为生物催化剂，4°C储存备用；其中，上述氧化葡萄糖杆菌使用如下培养基配方培养:D-山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸铵5克/升；磷酸二氢钾2克/升；硫酸镁5克/升；碳酸钙10克/升。(2)转化将步骤(I)中制得的生物催化剂即完整细胞与底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化剂的浓度为60克湿细胞/升、1，2_ 丁二醇的浓度为40克/升，并加入乙二胺四乙酸二钠至终浓度20毫摩尔/升；在37°C，pH 6.0条件下，以180转/分钟振荡25小时，得到转化液。(3)制取含R-a -羟基丁酸溶液将步骤(2)中制得的转化液以10，000转/分离心15分钟，去除生物催化剂即完整细胞，所得清液即为含R-a -羟基丁酸溶液。(4)产物R-a -羟基丁酸的检测
经HPLC检测，通过比较R-2-羟基丁酸标准品高压液相色谱结果(图1)和S_2_羟基丁酸标准品高压液相色谱结果(图2)及R-2-羟基丁酸产品高压液相色谱结果(图3)，发现步骤(3)所得上清液中产物保留时间与R-2-羟基丁酸标准品一致，质谱检测其分子量与R-2-羟基丁酸相符(图4)。由此确认生物催化剂即氧化葡萄糖杆菌DSM 2003完整细胞转化1，2_ 丁二醇的产物为R-2-羟基丁酸，并测定其浓度为18.2克/升，对映体过量值为99.7%。实施例2:(I)制备生物催化剂选取氧化葡萄糖杆菌DSM 2003，常规方法培养，分离并收集菌体，用pH 7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体3次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到的完整细胞悬液即为生物催化剂，4°C储存备用；其中，上述氧化葡萄糖杆菌使用如下培养基配方培养:D-山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸铵5克/升；磷酸二氢钾2克/升；硫酸镁5克/升；碳酸钙10克/升。(2)转化将步骤(I)中制得的生物催化剂即完整细胞与底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化剂的浓度为100克湿细胞/升、1，2- 丁二醇的浓度为50克/升，并加入乙二胺四乙酸二钠至终浓度30毫摩尔/升；在40°C，pH 4.0条件下，以180转/分钟振荡15小时，得到转化液。(3)制取含R- α -羟基丁酸溶液将步骤⑵中制 得的转化液以10，000转/分离心15分钟，去除生物催化剂即完整细胞，所得清液即为含R-α -羟基丁酸溶液。(4)产物R- α -羟基丁酸的检测经检测，步骤(3)中所含R-2-羟基丁酸的浓度为11.2克/升，对映体过量值为
95.3%。实施例3:(I)制备生物催化剂选取氧化葡萄糖杆菌DSM 2003，常规方法培养，分离并收集菌体，用pH 7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体3次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到的完整细胞悬液即为生物催化剂，4°C储存备用；其中，上述氧化葡萄糖杆菌使用如下培养基配方培养:D_山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸铵5克/升；磷酸二氢钾2克/升；硫酸镁5克/升；碳酸钙10克/升。(2)转化将步骤(I)中制得的生物催化剂即完整细胞与底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化剂的浓度为120克湿细胞/升、1，2- 丁二醇的浓度为60克/升，并加入乙二胺四乙酸二钠至终浓度40毫摩尔/升；在40°C，pH 5.0条件下，以180转/分钟振荡30小时，得到转化液。(3)制取含R- α -羟基丁酸溶液将步骤⑵中制得的转化液以10，000转/分离心15分钟，去除生物催化剂即完
整细胞，所得清液即为含R-α -羟基丁酸溶液。
(4)产物R- α -羟基丁酸的检测经检测，步骤(3)中所含R-2-羟基丁酸的浓度为21.2克/升，对映体过量值为
97.6%。实施例4:(I)制备生物催化剂选取氧化葡萄糖杆菌DSM 2003，常规方法培养，分离并收集菌体，用pH 7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体3次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到的完整细胞悬液即为生物催化剂，4°C储存备用；其中，上述氧化葡萄糖杆菌使用如下培养基配方培养:D_山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸铵5克/升；磷酸二氢钾2克/升；硫酸镁5克/升；碳酸钙10克/升。(2)转化将步骤(I)中制得的生物催化剂即完整细胞与底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化剂的浓度为5克湿细胞/升、1，2-丁二醇的浓度为5克/升，并加入乙二胺四乙酸二钠至终浓度20毫摩尔/升；在50°C，pH 8.0条件下，以180转/分钟振荡I小时，得到转化液。(3)制取含R- α -羟基丁酸溶液`将步骤(2)中制得的转化液以10，000转/分离心15分钟，去除生物催化剂即完整细胞，所得清液即为含R-α -羟基丁酸溶液。(4)产物R- α -羟基丁酸的检测经检测，步骤(3)中所含R-2-羟基丁酸的浓度为0.2克/升，对映体过量值为96.6%。实施例5:(I)制备生物催化剂选取氧化葡萄糖杆菌DSM 2003，常规方法培养，分离并收集菌体，用pH 7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体3次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到的完整细胞悬液即为生物催化剂，4°C储存备用；其中，上述氧化葡萄糖杆菌使用如下培养基配方培养:D_山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸铵5克/升；磷酸二氢钾2克/升；硫酸镁5克/升；碳酸钙10克/升。(2)转化将步骤(I)中制得的生物催化剂即完整细胞与底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化剂的浓度为60克湿细胞/升、1，2- 丁二醇的浓度为40克/升，并加入乙二胺四乙酸二钠至终浓度10毫摩尔/升；在20°C，pH 10.0条件下，以180转/分钟振荡24小时，得到转化液。(3)制取含R- α -羟基丁酸溶液将步骤⑵中制得的转化液以10，000转/分离心15分钟，去除生物催化剂即完整细胞，所得清液即为含R-α -羟基丁酸溶液。(4)产物R- α -羟基丁酸的检测经检测，步骤(3)中所含R-2-羟基丁酸的浓度为2.2克/升，对映体过量值为
96.4%。
实施例6:(I)制备生物催化剂选取氧化葡萄糖杆菌DSM 2003，常规方法培养，分离并收集菌体，用pH 7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体3次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到的完整细胞悬液即为生物催化剂，4°C储存备用；其中，上述氧化葡萄糖杆菌使用如下培养基配方培养:D_山梨醇80克/升；酵母粉24克/升；硫酸铵5克/升；磷酸二氢钾2克/升；硫酸镁5克/升；碳酸钙10克/升。(2)转化将步骤(I)中制得的生物催化剂即完整细胞与底物I，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化剂的浓度为60克湿细胞/升、1，2_ 丁二醇的浓度为60克/升，并加入乙二胺四乙酸二钠至终浓度20毫摩尔/升；在30°C，pH 6.0条件下，以180转/分钟振荡24小时，得到转化液。(3)制取含R- α -羟基丁酸溶液将步骤⑵中制得的转化液以10，000转/分离心15分钟，去除生物催化剂即完整细胞，所得清液即为含R-α -羟基丁酸溶液。(4)产物R- α -羟基丁酸的检测经检测 ，步骤(3)中所含R-2-羟基丁酸的浓度为23.2克/升，对映体过量值为
98.4%。
权利要求
1.一种以I，2-丁二醇为底物生产R-a-羟基丁酸的方法，步骤是: (1)制备生物催化剂 选取氧化葡萄糖杆菌DSM 2003，常规方法培养，分离并收集菌体，用pH 7.2 7.5磷酸钾缓冲液洗涤菌体2 4次，菌体重悬于去离子水中，使菌体浓度达到200克湿细胞/升，得到的完整细胞悬液即为生物催化剂，4°C储存备用； (2)转化 将步骤(I)中制得的生物催化剂即完整细胞与底物1，2-丁二醇水溶液混合，使混合物中生物催化剂的浓度为5 120克湿细胞/升、1，2- 丁二醇的浓度为5 60克/升，并加入乙二胺四乙酸二钠至终浓度5 40毫摩尔/升；在20 50°C，pH 4.0 10.0条件下，以50 180转/分钟振荡I 30小时，得到转化液； (3)制取含R-a -羟基丁酸溶液 将步骤(2)中制得的转化液以5，000 10，000转/分离心5 25分钟，或者用200 400目滤布过滤，去除生物催化剂即完整细胞，所得清液即为含R-a-羟基丁酸溶液。
2.如权利要求1所述以1，2_丁二醇为底物生产R-a-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤⑵所述的1，2- 丁二醇浓度为10 50克/升。
3.如权利要求1所述以1，2_丁二醇为底物生产R-a-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(2)所述生物催化剂即完整细胞的浓度为40 100克湿细胞/升。
4.如权利要求1所述以1，2_丁二醇为底物生产R-a -羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(2)所述的乙二胺四乙酸二钠浓度为10 30毫摩尔/升。
5.如权利要求1所述以1，2_丁二醇为底物生产R-a-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤⑵所述的温度为25 40°C。
6.如权利要求1所述以1，2_丁二醇为底物生产R-a-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤⑵所述的pH为5.0 8.0。
7.如权利要求1所述以1，2_丁二醇为底物生产R-a-羟基丁酸的方法，其特征在于，步骤(2)所述振荡时间为4 25小时。
全文摘要
本发明公开了一种以1，2-丁二醇为底物生产R-α-羟基丁酸的方法，是以常规方法培养氧化葡萄糖杆菌DSM 2003制得生物催化剂，再将生物催化剂与底物1，2-丁二醇水溶液混合，并加入乙二胺四乙酸二钠在20～50℃，pH 4.0～10.0条件下，振荡1～30小时，得到转化液；再由转化液制取含R-α-羟基丁酸溶液。本发明方法具有以下特点(1)采用生物催化的方法，反应体系简单，反应条件温和，步骤简短，操作简便；生物催化剂可以容易地除去，便于后续产物分离纯化；(2)反应周期较短，产物R-α-羟基丁酸可积累到较高浓度；(3)底物1，2-丁二醇价格低廉，易于获得；(4)产物对映体过量率高，可达到99％以上，为实现R-α-羟基丁酸的高效生产奠定了基础。
文档编号C12P7/42GK103103222SQ20111035517
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日
发明者许平, 高超, 张文, 马翠卿 申请人:山东大学