专利名称：一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种哺乳动物细胞高效表达载体。
背景技术：
按照宿主细胞的类型，可将基因表达系统大致分为原核、酵母、植物、昆虫和哺乳动物细胞表达系统。与其它系统相比，哺乳动物细胞表达系统的优势在于能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的0型糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。从最开始以裸露DNA直接转染哺乳动物细胞至今的30余年间，哺乳动物细胞表达系统不仅已成为多种基因工程药物的生产平台，在新基因的发现、蛋白质的结构和功能研究中亦起了极为重要的作用。但是动物细胞外源蛋白表达效率低，且成本高，因此提高动物细胞外源蛋白表达效率，降低生产成本是当前急需完成的工作。高水平的哺乳动物细胞表达载体应具有以下特点有高效的启动子，以启动目的基因的转录；有效的转录终止信号，保证转录的正确终止；具有筛选与基因扩增标志，方便筛选染色体中高拷贝整合目的基因的细胞。在外源基因进行表达过程中，选用什么表达载体需要从多方面考虑，同一个表达载体，同一个启动子在不同的细胞类型中效果差异较大， 这和该细胞中转录调控因子的存在状况有关，需要不断的摸索。CHO(中国仓鼠卵巢)细胞是目前表达外源基因最常选用的工程细胞。其中 CHO-dhfr—和CHO-GS是哺乳动物细胞表达的主流细胞株，CHO-dhfr-system是广泛应用的工程细胞株(国外和国内多个保藏机构有售)，它可以在氨甲喋呤(MTX)压力下使外源基因的拷贝数扩增，使外源蛋白得到高水平的表达。而且，此细胞株易于转染，可以进行悬浮培养、无血清培养和高密度发酵。适宜在工业上大量生产重组蛋白。CHO-GS system 是Lonza公司开发的一种高效的外源蛋白表达系统。在哺乳动物细胞内，谷氨酰胺合成酶 (Glutamine synthetase, GS)催化谷氨酸盐(glutamate)和铵盐(ammonium)合成谷氨酰胺(glutamine)，这一反应是细胞内谷氨酰胺的唯一来源。但是，有些体外培养的细胞(如小鼠骨髓瘤细胞)天然不能产生足够的GS分子，它们需要在培养基中添加外源性的谷氨酰胺才能维持正常的生长代谢。因此，GS被认为是理想的转染克隆筛选标记在无外源性谷氨酰胺的条件下，只有整合入外来GS基因的细胞才能生长并形成克隆。在MSX的加压下可以使得CHO-GS细胞高效表达外源基因，通过优化表达载体的方式，可以提高宿主细胞对外源基因的表达，因此，构建一种适用于哺乳动物细胞，尤其是CHO细胞的高效表达载体在工业生产中意义重大。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于哺乳动物细胞并能高效表达外源蛋白的双顺反子表达载体及其应用，以降低外源蛋白的生产成本。本发明一方面公开了一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体，所述载体包括以下5’ -3’方向的连接元件(1)开放阅读框1 包含依次排列的巨细胞病毒(CMV)早期启动子/增强子及内含子序列、多克隆位点、牛生长激素终止子序列；(2)开放阅读框2 包含依次排列的巨细胞病毒(CMV)早期启动子/增强子及内含子序列、多克隆位点、牛生长激素转录终止子及猿猴病毒SV40启动子序列；(3)筛选标记基因、猿猴病毒SV40终止子序列。较优的，所述开放阅读框1和开放阅读框2的巨细胞病毒(CMV)早期启动子/增强子及内含子序列为SEQ ID NO :1。较优的，所述开放阅读框1的牛生长激素转录终止子序列为SEQ ID NO :2。较优的，所述开放阅读框2的牛生长激素转录终止子及猿猴病毒SV40启动子序列为 SEQID NO :3ο较优的，所述猿猴病毒SV40终止子序列为SEQ ID NO :4。较优的，所述开放阅读框1的多克隆位点包括NheI酶切位点和MluI酶切位点；所述开放阅读框2的多克隆位点包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点。较优的，所述筛选标记基因选自二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)基因。较优的，所述适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体是由质粒Pcmob3H改造获得。更优的，所述适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体是在质粒Pcmob3H多克隆位点的MlI酶切位点和NheI酶切位点之间，自5’ -3’方向插入有所述开放阅读框1、开放阅读框2以及筛选标记基因和猿猴病毒SV40终止子序列。较优的，所述动物细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。更优的，所述动物细胞选自CHO-Kl或CHO-dhfr—细胞株。本发明第二方面公开了一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体在哺乳动物细胞表达蛋白中的应用。 较优的，所述蛋白为抗体，包括一条重链和一条轻链。更优的，所述抗体为全人TNF α单克隆抗体，包括全人TNF α单克隆抗体的轻链和全人TNF α单克隆抗体的重链。最优的，所述全人TNF α单克隆抗体的轻链序列为SEQ ID NO 5 ；所述全人TNF α 单克隆抗体的重链序列为SEQ ID NO :6。本发明适用于哺乳动物细胞并能高效表达外源蛋白的双顺反子表达载体，在其两个开放阅读框中分别设有多克隆酶切位点，可以通过双酶切、连接的方法将外源蛋白的基因序列插入到所述多克隆位酶切点处将本发明中的表达载体经限制性内切酶双酶切、电泳，回收片段大小符合要求的表达载体片段，将大小符合要求的表达载体片段与经过相同的限制性内切酶处理的外源蛋白的基因进行连接，获得相对应蛋白的高效表达载体。本发明第三方面公开了一种装载有全人TNFa单克隆抗体基因的双顺反子表达载体，所述载体为在本发明所述适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体的基础上构建， 其中，所述开放阅读框1的多克隆位点插入有全人TNF α单克隆抗体轻链DNA序列，所述开放阅读框2的多克隆位点插入有全人TNF α单克隆抗体重链DNA序列。
较优的，所述全人TNF α单克隆抗体的轻链DNA序列为SEQ ID NO :5，全人TNF α 单克隆抗体的重链DNA序列为SEQ ID NO :6。较优的，所述开放阅读框1的多克隆位点包括NheI酶切位点和MluI酶切位点，所述全人TNF α单克隆抗体轻链DNA序列插入于NheI酶切位点和MluI酶切位点之间；所述开放阅读框2的多克隆位点包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，所述全人TNF α单克隆抗体重链DNA序列插入于EcoRI酶切位点和NotI酶切位点之间。本发明的有益效果为(1)具有巨细胞病毒(CMV)的早期启动子与增强子序列， 可高效进行外源基因的转录；( 含有一段内含子序列，可提高信使RNA(mRNA)的稳定性， 延长其半衰期；C3)含有牛生长激素多聚腺苷酸转录终止信号，保正mRNA转录的及时终止； (4)含有二氢叶酸还原酶(DHFR)，作为筛选及扩增标志，可筛选得到稳定整合目的基因的细胞株，并使细胞在MTX选择压力下，提高目的基因的表达。(5)将轻链和重链区放在同一载体中共同转录和表达，使重链、轻链能保证1 1的比例表达，组成全分子抗体。因此，本发明的载体具有高效的启动子，以启动目的基因的转录；有效的转录终止信号，保证转录的正确终止；具有筛选与基因扩增标志，方便筛选染色体中高拷贝整合目的基因的细胞。抗体的表达量的测定结果表明，与现有动物细胞双顺反子表达载体相比，本发明的双顺反子表达载体的抗体表达量获得大幅提升，表达水平提高了约10-20倍，提高了动物源性抗体的制备效率，降低生产成本。
图1 双顺反子表达载体的结构图2 :pHAI-H质粒的构建过程图3 :pHAI-DH质粒的构建过程图4 :pHAI-N-DH质粒的构建过程
具体实施例方式下述实施例详细说明本发明，但并不对其发明范围进行限制。实施例lpCMV-intron-L-BGH PA 片段的扩增(l)pCMV启动子与内含子的PCR扩增质粒pCI-neo为真核表达质粒载体，以pCI-neo质粒为模板，以巨细胞病毒(CMV) 早期启动子/增强子及内含子序列(SEQ ID NO 1)为参考，设计含McI酶切位点或NheI 酶切位点的引物P1/P2进行PCR反应，扩增两端带有酶切位点的巨细胞病毒(CMV)早期启动子/增强子及内含子序列，PCR反应条件如表1。上游引物(Pl):5' -GCGGAGCTCGGGCTATTGGCCATTGCATACGC-3 ‘(下划线为 SacI 酶切位点)(SEQ ID NO 7)下游引物(P2)5' -TGAACTGGGAGTGGACACCTGTGGAGAGAAAGGCAAGCTAGCGC-3'(下划线为 NheI 酶切位点)(SEQ ID NO 8)于100 μ 1薄壁离心管建立以下反应体系
6质粒 pCI-neo2 μ (1 η;IOxPCR反应缓冲液5 μ dNTP (IOmM)2μ1上游引物(Pl) (5 pmol/μ )1 μ 下游引物(P2) (5 pmol/μ )1 μ Pfu DNA聚合酶(3υ/μ1)0.5 μ
加灭菌重蒸水至终体积50 μ
权利要求
1.一种适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体，所述载体包括以下5’-3’方向的连接元件(1)开放阅读框1包含依次排列的巨细胞病毒早期启动子/增强子及内含子序列、多克隆位点、牛生长激素转录终止子序列；(2)开放阅读框2包含依次排列的巨细胞病毒早期启动子/增强子及内含子序列、多克隆位点、牛生长激素转录终止子及猿猴病毒SV40启动子序列；(3)筛选标记基因、猿猴病毒SV40终止子序列。
2.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述开放阅读框1和开放阅读框2的巨细胞病毒早期启动子/增强子及内含子序列为SEQ ID NO :1。
3.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述开放阅读框1的牛生长激素转录终止子序列为SEQ ID NO :2。
4.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述开放阅读框2的牛生长激素转录终止子及猿猴病毒SV40启动子序列为SEQ ID NO :3。
5.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述猿猴病毒SV40终止子序列为 SEQ ID NO :4ο
6.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述开放阅读框1的多克隆位点包括NheI酶切位点和MluI酶切位点；所述开放阅读框2的多克隆位点包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点。
7.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述筛选标记基因选自二氢叶酸还原酶基因。
8.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体是由质粒Pcmob3H改造获得。
9.如权利要求8所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体是在质粒PcmobIBH多克隆位点的Mil酶切位点和NheI酶切位点之间， 自5’-3’方向插入所述开放阅读框1、开放阅读框2、筛选标记基因以及猿猴病毒SV40终止子序列。
10.如权利要求1所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
11.如权利要求10所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述中国仓鼠卵巢细胞选自CHO-Kl或CHO-dhff细胞株。
12.如权利要求1-11任一权利要求所述适用于哺乳动物细胞的双顺反子表达载体在哺乳动物细胞表达蛋白中的应用。
13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述蛋白为抗体，包括一条重链和一条轻链。
14.如权利要求13所述的应用，其特征在于，所述抗体为全人TNFα单克隆抗体，包括全人TNF α单克隆抗体的轻链和全人TNF α单克隆抗体的重链。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述全人TNFα单克隆抗体的轻链的DNA 序列为SEQ ID NO :5，全人TNFa单克隆抗体的重链的DNA序列为SEQ ID NO :6。
16.一种装载有全人TNFa单克隆抗体基因的双顺反子表达载体，所述载体为在权利要求1-11任一权利要求所述双顺反子表达载体的基础上构建，其中，所述开放阅读框1的多克隆位点插入有全人TN α单克隆抗体轻链DNA序列，所述开放阅读框2的多克隆位点插入有全人TNF α单克隆抗体重链DNA序列。
17.如权利要求16所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述全人TNFα单克隆抗体的轻链DNA序列为SEQ ID NO :5，全人TNFa单克隆抗体的重链DNA序列为SEQ ID NO :6。
18.如权利要求16所述的双顺反子表达载体，其特征在于，所述开放阅读框1的多克隆位点包括NheI酶切位点和MluI酶切位点，所述全人TNF α单克隆抗体轻链DNA序列插入于NheI酶切位点和MluI酶切位点之间；所述开放阅读框2的多克隆位点包括EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，所述全人TNF α单克隆抗体重链DNA序列插入于EcoRI酶切位点和 NotI酶切位点之间。
全文摘要
本发明公开了一种适用于哺乳动物细胞并能高效表达外源基因的双顺反子表达载体及其应用。该双顺反子表达载体包括5’-3’方向的连接元件(1)开放阅读框1包含依次排列的巨细胞病毒的早期启动子/增强子及内含子序列、多克隆位点、牛生长激素转录终止子序列；(2)开放阅读框2包含依次排列的巨细胞病毒的早期启动子/增强子及内含子序列、多克隆位点、牛生长激素转录终止子及猿猴病毒启动子序列；(3)筛选标记基因、猿猴病毒SV40终止子序列。本发明的双顺反子载体具有高效的启动子，有效的转录终止信号，具有筛选与基因扩增标记，具有两个开放阅读框，提高了外源蛋白的表达效率，降低生产成本。
文档编号C12N15/85GK102392047SQ20111035513
公开日2012年3月28日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者倪健, 梁辉 申请人:苏州工业园区晨健抗体组药物开发有限公司