专利名称：一种水生双顺反子病毒的rt-pcr检测方法
技术领域：
本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种水生双顺反子病毒(Aquatic dicistrovirus, AQDV)的 RT-PCR 检测方法。
发明内容
水生双顺反子病毒(Aquatic dicistrovirus, AQDV)是水生甲壳动物的重要病原，属于双顺反子病毒科，现已发现三个未定种，包括造成对虾套拉综合症的套拉综合症病毒(Taura syndrome virus, TSV)、造成锯缘青蟹“嗜睡症”的锯缘青蟹双顺反子病毒 (Mud crab dicistrovirus，MCDV)和造成罗氏沼虾幼体综合症的罗氏沼虾双顺反子病毒 (Macrobrachium rosenbergii dicistrovirus，MRDV)。而对虾、青蟹和罗氏沼虾都是我国甲壳类动物主要养殖品种，其中罗氏沼虾养殖产量于2008年已成为全球第一。然而在以上三种病毒的困扰下，对虾死亡率达90%以上，青蟹死亡率达80%以上，罗氏沼虾死亡率达80% 以上，这给我国对虾、青蟹和罗氏沼虾育苗及养殖产业造成巨大的经济损失。以上三种病毒除了 TSV的易感宿主已比较明确外，MCDV和MRDV的敏感宿主还未进行研究，这就给疾病的预防，病原传播途径的切断造成了困难。而在养殖业中及时监测水生双顺反子病毒的发病情况，寻找有效的预防和防治方法，是当前水生甲壳动物养殖需要解决的主要问题。目前由于缺乏能同时检测以上三种水生双顺反子病毒的检测方法，这就给需要同时检测以上三种病原造成麻烦。本发明研制的能同时检测以上三种水生双顺反子病毒的 RT-PCR方法和套式RT-PCR检测方法，弥补了该技术领域的缺陷，为以上三种水生双顺反子病毒的同时监测提供有力手段。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种水生双顺反子病毒的 RT-PCR检测方法的技术方案，该方法能同时检测桃拉综合症病毒、锯缘青蟹双顺反子病毒和罗氏沼虾双顺反子病毒基因组。该方法直观优越、敏感性好、特异性高，对检测微量、保存时间久的标本中水生双顺反子病毒基因组的效果良好，可用于水生双顺反子病毒感染的实验室检测和水生双顺反子病毒的分子流行病学调查。所述的一种水生双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤 1)用水生双顺反子病毒特异性引物PO对待测RNA样品进行逆转录得到CDNA第一链，cDNA 用水生双顺反子病毒通用引物组P1/P0进行PCR扩增；2)上述得到的扩增产物用电泳鉴定；
所述的水生双顺反子病毒特异性引物PO为5’ -TACTCCACATRCACATATCTTC-3’ ； 所述的水生双顺反子病毒通用引物组P1/P0中上游引物Pl为5’ -GTKTATTCKTATGATTGGWC-3'，下游引物 PO 为 5，-TACTCCACATRCACATATCTTC-3，。所述的一种水生双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于所述的步骤1)中逆转录反应条件为:37 V反应60min，9(TC 5min终止反应，置冰上冷却5min，得到cDNA第一链。所述的一种水生双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于所述的步骤1)中 PCR反应条件为95°C预变性3min，94°C变性40s，50°C复性40s，72°C延伸1 min，循环35 次，最后72°C延伸IOmin0所述的一种水生双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于所述的步骤1)中当待测RNA样品所含病毒RNA量过低而未检出时，再以PCR扩增产物为模板，采用水生双顺反子病毒通用引物组P2/P3进行套式PCR ；
所述的水生双顺反子病毒通用引物组P2/P3中上游引物P2为5’ -GRWGATGATGMRGARAATGGT-3'，下游引物 P3 为 5，-RAACCACTCACWMACYTTATC-3'。所述的一种水生双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于所述的套式PCR反应条件为95°C预变性3min，94°C变性40s, 52°C复性40s，72°C延伸1 min，循环35次，最后 72°C延伸 IOmin0本发明中所设计的两对水生双顺反子病毒通用引物，是GenBank中获得Taura syndrome virus isolate ZHZC3TSV, Taura syndrome virus isolate Th04Lv> Taura syndrome virus from USA、Mud crab dicistrovirus 共 3 株桃拉综合症病毒(Taura syndrome virus, TSV)、1 株锯缘青蟹双顺反子病毒(Mud crab dicistrovirus, MCDV) 的基因组序列，禾口罗氏沼虫下双顺反子病毒(ifecro^racAi腫rosenbergiidicistrovirus, MRDV)的基因组全序列。输入ClustalX2. 1软件进行排列，寻找核苷酸序列保守区域作为引物设计区，设计对三种病毒通用的引物(见表1)。国内外尚未见此水生动物源双顺反子病毒通用引物设计的研究报道。
表1水生动物源双顺反子病毒引物设计
引物序列(5，一3，)极性退火Sl度 CO目的片段长度POTACTCCACATRCACATATCTTC—PlGTKTATTCKTATGATTGGWC+50634P2GRWGATGATGiRGARMTGGT+P3RAACCACTCACW1ACYTTATCI52297 I
为保证各种株型的水生双顺反子病毒RNA都能有效地逆转录为cDNA，本发明选用了水生双顺反子病毒特异性引物PO为共同逆转录引物，PU P2和P3引物的设计参照水生双顺反子病毒中仅有3个种的病毒核酸序列比对后的保守区。为了增强引物的特异性，在保守区筛选引物的基础上，应用了简并引物，这样可以用一对简并引物扩增所有3种不同双顺反子病毒。同时考虑到目的基因序列越长，其扩增的敏感性越低，故引物设计时选择了扩增短片段的引物，以增加水生双顺反子病毒RNA检测的阳性率。 为了能进一步增加本法检测水生双顺反子病毒RNA的敏感性，以用于病毒低拷贝样本的检出率，引物组P0/P1和P2/P3可以用于套式PCR反应，在用引物组P0/P1检测阴性的情况下，再利用引物组P2/P3对引物组P0/P1扩增产物进行二次PCR，这样可以显著提高低拷贝样品的检出率，防止假阴性。
由于双顺反子病毒RNA极易因为长时间保存环境中RNA酶的存在而发生降解，导致样本中的双顺反子病毒RNA含量少，因此在提取RNA试剂的选择上，选用了专门从样本中提取总RNA的提取试剂盒OiIAGEN公司的RNeasy Plus Kit)，该试剂盒通过gDNA去除柱有效地去除基因组DNA，并基于离子吸附原理可有效地提取样本中的总RNA，去蛋白质污染， 同时又因具备无需低温操作、离心时间短等优点可尽量减少RNA降解和破坏，得到高品质的RNA样品。另外，本发明选用了针对低拷贝样本中RNA含量少，进行逆转录Wknsiscript 逆转录酶，该酶能将少于50ng的总RNA高效逆转录为cDNA，可达到单细胞cDNA合成灵敏度，且具有RNase H活性，能降解RNA:DNA杂合子中的RNA，为PCR反应提供纯品的cDNA模板。本发明中引物PO序列如SEQ ID NO: 1所示，引物Pl序列如SEQ ID N0:2所示，引物P2序列如SEQ ID NO: 3所示，引物P3序列如SEQ ID NO: 4所示，罗氏沼虾双顺反子病毒序列如SEQ ID NO:5所示。本发明与现有技术相比，具有下列优点
1、本发明中所设计的两对水生双顺反子病毒通用引物针对水生双顺反子病毒保守序列设计，可扩增出已发现的任何一种水生动物源双顺反子病毒，阳性检出率高，适用于临床检测未知种的水生双顺反子病毒样本。2、本发明中所设计的两对水生动物源双顺反子病毒通用引物可以用于套式PCR， 灵敏度相当于普通PCR的IO3倍，减少了水生双顺反子病毒检测假阴性的可能。3、本发明中所设计的水生双顺反子病毒通用引物PI、P2和P3采用了简并引物的设计方法，增加了检测水生双顺反子病毒的广谱性，减少了假阴性的可能，大大提高了水生双顺反子病毒的阳性检出率。4、本发明中所确立的水生双顺反子病毒基因组检测方法，选用了专门针对微量 RNA的RNA提取试剂盒和knsiscript逆转录酶，对低拷贝病毒样本、保存条件较差的水生双顺反子病毒RNA亦有良好的检测效果，对冻融次数多达20次的带毒样本依然具有100% 的检出率，可用于临床、实验室检测以及流行病学研究。
图1为本发明检测水生双顺反子病毒基因组的特异性对照图； 图2为本发明检测水生双顺反子病毒基因组的敏感性对照图3为本发明用于水生双顺反子病毒反复冻融组织样本的扩增图。图 1 中 M =DLlOOO DNA Marker ；1 =MRDV ；2 =TSV ；3 =MCDV ；4 =MRNV ；5 =WSSV ；6 GCRV ； 7 :ddH20 对照。图 2 中 M =DLlOOO DNA Marker ； 1-8 =MRDV RNA 自 0. 27ug 开始 10 倍稀释后扩增； 9-12 5-8中第一轮PCR产物再进行套式PCR扩增；13 :ddH20对照。图3 中 M =DLlOOO DNA Marker ； 1-8 分别冻融 8，12，16，…，36 次的样品。
具体实施例方式以下结合实施例来进一步说明本发明。实施例1 RT-PCR方法检测水生双顺反子病毒阳性模板的基因组RNAA、合成两对水生双顺反子病毒通用引物，交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行 A =AQDV P1/P0，上游引物 Pl 为 5，- GTKTATTCKTATGATTGGffC-3'，
下游引物 PO 为 5’ - TACTCCACATRCACATATCTTC-3，； B: AQDV P2/P3，上游引物 P2 为 5，- GRWGATGATGMRGARAATGGT-3'， 下游引物 P3 为 5，- RAACCACTCACWMACYTTATC-3'。B、水生双顺反子病毒基因组检测方法 1、阳性模板的制备
称取病毒阳性罗氏沼虾幼体，用总RNA提取试剂盒OiIAGEN公司的RNeasy Plus Kit) 提取样本总RNA作为阳性模板。同时设置阴性对照(正常无病毒罗氏沼虾幼体)。2、RNA的纯度和浓度
分别测量RNA标本在260nm和280nm波长下的光密度值0D260和0拟80，通过计算 0拟60/0拟80，确定RNA纯度，结果显示所有RNA标本0拟60/0D280 ^ 1. 9，表明RNA纯度较高，无DNA和蛋白质污染；同时读取并记录各个RNA样本浓度，取50ng进行RT-PCR反应。3、RT-PCR 反应
在DEPC (焦碳酸二乙酯)处理的PCR管中分别加入50ng模板RNA，200U Sensiscript 逆转录酶 ^liagen 公司产品)、2 μ 10XRT BuffeHQiagen 公司产品)，1 μ 10mmol/L WdNTP Mix、40U RNasin和10 pmol引物P0，无RNase水补足体积至20μ 。充分混勻，短暂离心收集反应液。37°C反应lhr，然后90°C 5min终止反应，迅速置冰上冷却，-80°C保存待用，得到cDNA第一链。取上述反应cDNA产物5 μ ,加入总体积50 μ 的反应体系中，其中含 IU Taq DNA 聚合酶(Fermentas)、5μ 10XPCR Buffer,0. 5mmol dNIPs 和通用引物 (AQDV P1/P0)各IOpmol。充分混勻后，放入PCR扩增仪反应。循环反应参数为95°C预变性 3min，94°C变性40s，50°C复性40s，72°C延伸lmin，循环；35次，最后72°C延伸IOmin0整个实验从RNA提取开始设置阴性对照和阳性对照。4、琼脂糖凝胶电泳
取PCR扩增产物在含5 Pg/ml嗅化乙啶(EB)的1. 5%琼脂糖凝胶上电泳，5V/ cm, 30min后紫外透射反射仪上观察结果，目的扩增片段为634bp。5、RT-PCR方法的特异性
结果显示TSV、MCDV和MRDV核酸扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在634bp处出现一条特异性核酸带；而罗氏沼虾诺达病毒(MRNV)、白斑综合症病毒(WSSV)、草鱼呼肠孤病毒 (GCRV)和阴性对照扩增产物电泳后未见特异性核酸带(见图1所示)。本发明所设计引物经DNA STAR I^rimerklect软件检测其特异性，结果显示上述两对通用引物(AQDV P1/P0和 AQDV P2/P3)对已知全序列的3株桃拉综合症病毒(TSV)、1株青蟹双顺反子病毒(MCDV)和 1株罗氏沼虾双顺反子病毒(MRDV)的cDNA序列进行扩增时均只产生一个目的片段产物，无非特异性扩增。6、RT-PCR方法的敏感性
将0. Ig阳性样品提取的总RNA在核酸分析仪上进行定量为0. 27ug，经10倍系列稀释， 本法可检出的最高稀释度为10_4，即相当于27pg核酸中的病毒RNA;对稀释度过高，采用引物P1/P0进行RT-PCR反应未检出目的条带时，再采用P2/P3进行套式PCR，目的扩增片段为 297bPo取采用引物P1/P0进行RT-PCR反应的产物1 μ ，加入总体积50 PL的反应体系中，其中含 IU Taq DNA 聚合酶(Fermentas)、5μ 10XPCR Buffer,0. 5mmol dNTPs 和通用引物(AQDV P2/P;3)各IOpmol。充分混勻后，放入PCR扩增仪反应。循环反应参数为95°C预变性3min，94°C变性40s，52°C复性40s，72°C延伸lmin，循环35次，最后72°C延伸IOmin0 结果套式PCR灵敏度比单次PCR高100倍，最高稀释度可达为10_6 (见图2所示)。
实施例2: RT-PCR方法检测反复冻融样本中AQDV RNA
取病毒阳性样本分装EP管后分别-80°C 30分钟/室温30分钟反复冻融。对不同冻融次数的样品进行RNA提取，通过使用AQDV新型引物(AQDV P1/P0)对每一份提取的核酸标本进行分管平行扩增。1、RNA 提取
取反复冻融样本0. lg，用总RNA提取试剂盒OiIAGEN公司的RNeasy Plus Kit)，按试剂盒说明提取总RNA。2、RNA的纯度和浓度测定
分别测量RNA标本在260nm和280nm波长下的光密度值0D260和0拟80，通过计算 0拟60/0拟80，确定RNA纯度，结果显示所有RNA标本0拟60/0D280 ^ 1. 9，表明RNA纯度较高，无DNA和蛋白质污染；同时读取并记录各个RNA样本浓度，取50ng进行RT-PCR反应。3、RT-PCR 反应
取 50ng 模板 RNA，加入 200U Sensiscript 逆转录酶(Qiagen 公司产品)、2 μ 10XRT BuffeHQiagen 公司产品)，1μ 10mmol/L 的 dNTP Mix、40U RNasin 禾Π IOpmol PO 引物，无 RNase水补足体积至20μ 。充分混勻，短暂离心收集反应液。37°C反应lhr，然后90°C 5min 终止反应，迅速置冰上冷却，-80°C保存待用。取上述反应cDNA产物5 μ ,加入总体积50 PL 的反应体系中，其中含 IU Taq DNA聚合酶(Fermentas)，5μ 10XPCR Buffer、0. 5mmol dNIPs和特异性引物(AQDV P1/P0)各10 pmoL·充分混勻后，放入PCR扩增仪反应。循环反应参数为95°C预变性3 min, 94°C变性40s, 50°C复性40s, 72°C延伸1 min,循环35次，最后72°C延伸IOmin。整个实验从RNA提取开始设置阴性对照和阳性对照。4、琼脂糖凝胶电泳
取PCR扩增产物在含5 Pg/ml嗅化乙啶(EB)的1. 5%琼脂糖凝胶上电泳，5V/ cm, 30min后紫外透射反射仪上观察结果，目的片段大小为634bp。经琼脂糖凝胶电泳可见， 反复冻融20次的样本采用本法也可检出(见图3所示)。
权利要求
1.一种水生双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤1)用水生双顺反子病毒特异性引物PO对待测RNA样品进行逆转录得到cDNA第一链，cDNA用水生双顺反子病毒通用引物组P1/P0进行PCR扩增；2)上述得到的扩增产物用电泳鉴定；所述的水生双顺反子病毒特异性引物PO为5’ -TACTCCACATRCACATATCTTC-3’ ；所述的水生双顺反子病毒通用引物组P1/P0中上游引物Pl为5’ -GTKTATTCKTATGATTGGWC-3'，下游引物 PO 为 5，-TACTCCACATRCACATATCTTC-3，。
2.如权利要求1所述的一种水生双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于所述的步骤1)中逆转录反应条件为37°C反应60min，90°C 5min终止反应，置冰上冷却5min，得到cDNA第一链。
3.如权利要求1所述的一种水生双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于所述的步骤1)中PCR反应条件为95°C预变性3min，94°C变性40s，50°C复性40s，72°C延伸1 min，循环35次，最后72°C延伸IOmin0
4.如权利要求1所述的一种水生双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于所述的步骤1)中当待测RNA样品所含病毒RNA量过低而未检出时，再以PCR扩增产物为模板，采用水生双顺反子病毒通用引物组P2/P3进行套式PCR ；所述的水生双顺反子病毒通用引物组P2/P3中上游引物P2为5’ -GRWGATGATGMRGARAATGGT-3'，下游引物 P3 为 5，-RAACCACTCACWMACYTTATC-3'。
5.如权利要求4所述的一种水生双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，其特征在于所述的套式PCR反应条件为95°C预变性3min，94°C变性40s，52°C复性40s，72°C延伸1 min，循环35次，最后72°C延伸IOmin0
全文摘要
一种水生双顺反子病毒的RT-PCR检测方法，属于病毒检测技术领域。其包括以下步骤1)用水生双顺反子病毒特异性引物P0对待测RNA样品进行逆转录得到cDNA第一链，cDNA用水生双顺反子病毒通用引物组P1/P0进行PCR扩增；2)上述得到的扩增产物用电泳鉴定；并且本发明设计了特异性引物P0、通用引物组P1/P0和通用引物组P2/P3。本发明能同时检测桃拉综合症病毒、锯缘青蟹双顺反子病毒和罗氏沼虾双顺反子病毒基因组。本发明直观优越、敏感性好、特异性高，对检测微量、保存时间久的标本中水生双顺反子病毒基因组的效果良好，可用于水生双顺反子病毒感染的实验室检测和水生双顺反子病毒的分子流行病学调查。
文档编号C12Q1/68GK102329896SQ20111031572
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者姚嘉赟, 尹文林, 徐洋, 沈锦玉, 潘晓艺, 蔺凌云, 袁雪梅, 郝贵杰 申请人:浙江省淡水水产研究所