专利名称：锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1及其单克隆抗体和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及青蟹养殖生物技术领域，尤其涉及锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1
及其单克隆抗体和应用。
背景技术：
锯缘青蟹(Scylla serrata，学名为Mud crab)，俗称青蟹，主要分布于印度洋-太
平洋的热带、亚热带海域，是经济价值很高的食用蟹类，为名优养殖品种之一。 病毒病是锯缘青蟹养殖过程中的主要病原，其造成青蟹养殖业的严重经济损失，
因此锯缘青蟹养殖过程中，对各类病毒病的研究是当前的重要课题。 2004年始在珠海发现患"嗜睡病"(SD)的锯缘青蟹同时存在两种病毒锯缘青蟹 双顺反子病毒(Mud crab dicistrivirus，MCDV)禾口呼肠孤病毒(mudcrab reovirus，MCRV)。
MCDV是水生甲壳动物中发现的单股正链RNA病毒ssRNA(+)，其单独存在就可以使 锯缘青蟹致病，而且死亡率可达80%以上，因此对MCDV的感染机制和致病性进行研究，在 青蟹养殖业中及时监测MCDV的发病情况，寻找有效的预防和防治方法，是当前锯缘青蟹养 殖需要解决的重要问题。 双顺反子病毒(dicistrivirus)是一个新分类的病毒属，随着海洋病毒学的不断 深入，越来越多的水生生物的双顺反子病毒被发现，但是其结构蛋白还未见研究，有关锯缘 青蟹双顺反子病毒(MCDV)的结构蛋白的研究也未见有相关报道。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种锯缘青蟹双顺反子病毒的结构 蛋白1。 本发明的另一个目的在于提供上述锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1的单克隆 抗体。 本发明的另一个目的在于提供上述单克隆抗体在制备检测MCDV病毒试剂盒或胶 体金试纸中的应用。 本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的 本发明人从同时存在于锯缘青蟹的两种病毒(MCDV和MCRV)中分离纯化出MCDV， 电镜观察发现其直径为20 30nm，球形，无囊膜，呈二十面体对称，在CsCl中的浮力密度为 1. 32 1. 36g/cm3，核酸性质分析发现此病毒基因组为单股正链RNA病毒ssRNA(+)。
本发明人对MCDV的基因组分析发现其包含有被基因间非编码区(IGR)隔开的两 个开放读码框0RF1和0RF2，其中，0RF1编码非结构蛋白，0RF2编码结构蛋白。
本发明人对0RF2进行进一步地研究发现，0RF2由三个结构蛋白组成，分别是分子 量为53KD的结构蛋白1 (简称VP1)、分子量为35KD的结构蛋白2 (简称VP2)和分子量为 22KD的结构蛋白3 (简称VP3)。 接着，本发明人对结构蛋白1进行了一系列的研究分析，如下所示
1 、氨基酸序列及其编码核苷酸序列
结构蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示；
编码结构蛋白1的核苷酸序列，如SEQ ID NO :1所示。
2、单克隆抗体的获得 本发明人首先采用全病毒(MCDV)作为抗原，进行体内免疫试验，然后采用HAT与 HT选择杂交瘤细胞、间接ELISA法筛选阳性单克隆抗体，接着利用Western blot方法从阳 性单克隆抗体中将结构蛋白1的单克隆抗体筛选出来，最终获得能识别MCDV结构蛋白1的 单克隆抗体。 3、结构蛋白1的定位 本发明人在MCDV病毒分离纯化的基础上，对其三个结构蛋白的N端氨基酸进行了 测序，并与MCDV的基因组序列对比和结构分析，在MCDV基因组中找到了三个结构蛋白的相 应位置。 为了进一步对结构蛋白1精确定位，本发明人采用免疫电镜方法，观察上述 Western blot结果中，结构蛋白1的单克隆抗体所识别的抗原决定簇的位置，电镜结果显 示，该抗原决定簇定位于病毒粒子的边缘，从而实现了对MCDV结构蛋白1的精确定位。
本发明筛选到的MCDV结构蛋白1的单克隆抗体可用于MCDV的感染机制和致病性 研究，用于青蟹养殖业中及时监测MCDV的发病情况，用于锯缘青蟹双顺反子病毒(MCDV)活 体的中和作用，以及用于制备体外检测样品中是否存在MCDV病毒的试剂盒或胶体金试纸 条。 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果 1.本发明通过对MCDV进行研究分析，首次获得其结构蛋白1的氨基酸序列、核苷 酸序列和单克隆抗体，并对该结构蛋白1进行了定位，为锯缘青蟹的病毒病研究提供了新 的研究方向； 2.本发明筛选到结构蛋白1的单克隆抗体可用于MCDV监控和检测的多个方面。
图1为实施例1中纯化MCDV的SDS-PAGE电泳图； 其中，M为蛋白marker, 1 5为纯化的MCDV粒子，6为53KD的MCDV-VP1 ， 7为35KD 的MCDV-VP2， 8为22KD的MCDV-VP3 ; 图2为实施例3中抗体识别蛋白的Western-blot鉴定电泳图； 其中，1 5为识别MCDV-VP1的阳性单克隆抗体，M为蛋白marker,箭头所指为
53KD的MCDV-VP1 ; 图3为实施例3筛选的识别MCDV-VP1的阳性单克隆抗体间接免疫电镜图；
图4为实施例3筛选的识别MCDV-VP1的阳性单克隆抗体间接免疫电镜图；
图5为实施例4中阴性对照免疫电镜图。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任 何限定。
实施例1MCDV结构蛋白1的获得 本实施例通过对MCDV纯化、N端测序与分析，得到结构蛋白1的氨基酸序列和核 苷酸序列，并对结构蛋白1进行生物学分析，预测其理化性质及保守功能结构域，为MCDV结 构蛋白的功能研究奠定基础，其具体步骤如下所示。
1. MCDV的纯化 (1)称量病蟹的鳃样品约15g，液氮下迅速研磨至粉末状；
(2)将研好的粉末倒入250ml离心管中，按20倍体积的量加入PBS，匀浆；
(3)将匀浆后的病毒液4。C离心除渣1000rpm离心20min ;转向后3000rpm离心 3min ;上清转入新管，平衡后，12000 15000rpm高速离心1小时； (4)收集上述离心上清液，再次44000rpm(200000 Xg)离心2小时或者
33000rpm(150000Xg)离心7 10小时，沉淀病毒; (5)将沉淀的病毒粒子中加入0. 5ml PBS分散过夜； (6)制备CsCl密度梯度分别用质量百分比浓度为15%、25%、35%和45%的 CsCl溶液先轻后重依次加入SW41透明离心管中； (7)将分散过夜的病毒粒子加入CsCl梯度的最上层，35000rpm超速离心10小时 左右； (8)吸出病毒条带，在35质量X蔗糖垫上，用PBS洗涤，35000rpm超速离心2小 时； (9)初步纯化的每条带的病毒液分别上第二次CsCl梯度，重复步骤(7)， (S)，所述 CsCl梯度同步骤(6); (10)收集纯化病毒液，取其中5 10 ill fC保存，以备及时测定病毒浓度和电镜 观察，其余-S(TC保存备用。 2.纯化MCDV的浓度测定、电镜观察和SDS-PAGE鉴定 取2 5 iU上述新鲜纯化的病毒液，用紫外分光光度计粗略测定病毒浓度，结果 为2. 56ii g/iU。 取5iU病毒悬液滴到喷有碳粉的铜网上，吸附lmin，用滤纸吸干悬液；然后，用 2%的磷钨酸溶液染色40秒，再用滤纸吸去多余染液；灯照烘干，用Philips-CMIO透射电子 显微镜观察病毒的形态、数量和种类，通过统计多个视野中两种病毒粒子的数量计算其纯 度，本实施例纯化所得MCDV病毒液的纯度为99. 99% 。 取lOiU上述新鲜纯化的病毒液，进行常规的SDS-PAGE电泳，观察电泳结果中的 蛋白带型，结果如图1所示，纯化的MCDV经SDS-PAGE电泳，可见清晰的VP1、 VP2、 VP3三条 蛋白带，与预期的MCDV的三个结构蛋白质相一致，分别命名为VP1、VP2和VP3，分子量分别 为53KD、35KD和22KD。 实施例2MCDV结构蛋白1的序列测定及生物学分析 根据实施例1中的SDS-PAGE电泳结果，MCDV含有分子量为53KD的结构蛋白1 (简 称VP1)、分子量为35KD的结构蛋白2(简称VP2)和分子量为22KD的结构蛋白3 (简称VP3)。
本实施例对结构蛋白1进行N端测序以及生物学分析。 按照本领域进行蛋白质N端氨基酸测序的常规操作，首先制备MCDV的PVDF膜上， 选择PVDF膜上的结构蛋白l，进行N端氨基酸测序。
5
测序方法EDMAN降解法。测序仪器美国Applied Biosystems公司的PR0CISE491测序仪。
测序结果 结构蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示。
编码结构蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO:l所示。
实施例3MCDV结构蛋白1的单克隆抗体的制备 本实施例首先采用全病毒也就是MCDV作为抗原，进行体内免疫试验，然后采用 HAT与HT选择杂交瘤细胞、间接ELISA法筛选阳性单克隆抗体，接着利用Western blot方 法从阳性单克隆抗体中将结构蛋白1的单克隆抗体筛选出来，最终获得5株能识别MCDV结 构蛋白1的单克隆抗体，具体步骤如下所示。
1.体内免疫试验 体内免疫试验的抗原采用MCDV，其操作采用本领域技术人员进行体内免疫试验 时的常规操作，分别对BalB/C鼠和新西兰大白兔进行体内免疫试验，最后分别收集血液 (BalB/C鼠和新西兰大白兔)，在室温下放置30min，待其凝固后，放置4t:过夜使血块收縮， 有血清析出。次日，吸出血清，其余的血液于4t: 1500g离心10min，取上清液即为抗血清， 与前面的血清混合，分装，置-S(TC保存。 上述制备的抗血清中含有多种抗体，下面采用HAT与HT选择杂交瘤细胞、和间接 ELISA法将其中的阳性单克隆抗体筛选出来，也就是将MCDV的单克隆抗体筛选出来。
2.阳性单克隆抗体的筛选 本实施例的HAT与HT选择杂交瘤细胞、和间接ELISA法均采用本领域技术人员的
常规操作，结果筛选到7株强阳性克隆。 3.抗体识别蛋白的Western-blot鉴定 本实施例采用本领域技术人员的常用的Western-blot方法，从上述7株强阳性克 隆，筛选出能够识别MCDV-VP1的阳性克隆，最终得到5株可识别MCDV-VP1的阳性克隆。
Western-blot采用本领域技术人员的常规操作，5株可识别MCDV-VP1阳性克隆的 Western-blot电泳图如图2所示。
实施例4MCDV结构蛋白1的免疫电镜定位 为了确定MCDV结构蛋白1在病毒粒子上的定位，本实施例采用实施例3制备所得 MCDV结构蛋白1单克隆抗体作为一抗(1 : 2000)，胶体金为二抗，对结构蛋白1进行间接 免疫电镜的细胞定位。 本实施例只是选择了实施例3筛选到的可识别MCDV结构蛋白1的单克隆抗体中 的任意两株，进行免疫电镜定位。 如图3和4所示(bars = 20nm)，负染后电镜下可以清楚的看到，高电子密度的黑 色金颗粒有规律的围绕在病毒粒子的边缘，说明胶体金在MCDV单抗作为一抗的标记是特 异性标记，而不是假阳性结果，此外从图上可以看出，MCDV结构蛋白1单克隆抗体其作用的 抗原决定簇在病毒衣壳上。 阴性血清作为一抗或者直接用PBS作阴性对照，阴性对照如图5所示，没有金颗粒 标记在病毒粒子上。 锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1及其单克隆抗体和应用序列表
SEQUENCE LISTING 〈110>中山大学 〈120〉锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1及其单克隆抗体和应用 〈130〉 〈160>3 〈170>PatentIn version 3. 5 〈210>1 〈211〉1344 〈212>DNA 〈213>锯缘青蟹(Scylla serrata) 〈400〉 1tcteaggatcgtgatctttcteaagtttctccctetgagaatettcctgcteagggtttc60ttggttttgattetggtgtetccactttcgcttttcctgateacgctett120gatcctectettgcteatcctgagtccattgatg卿tgtctettcaatetttggcttct180cggccgtetetgttggateggteteccatca皿ggtgg皿atectccctcgccgtcaggt240actgttgttgctgatetccctettegtcctgtcaattectctctctetggtegtettetc300cgtgattetegaaccatttttggtgctcctgtcagtctegctgttgcgatggcttcatgg360tggcgagcteaaattcacctteatcttcagttcgc皿3gaccagtgtcgt420ttecttgttcagtetcttccctetggttctgatgttcaatctcttgaaaatgttctttcc■caaattettgatetetcccatgttgatgagagtggtettgatttetgctttccttctett540皿tggatgcgttcttetgatcctgccactg皿ggctecactgctgggtgc600gcgcctgg皿gaattcttetttctgtgcttaatcctcteatttctgctegtectgtteat660gatgacattgttetgatgccatggcttecttggg皿皿tcttgaacttgctgagcctggc720tctcttgcteaggctgctettggttttgactetcctgctgatgctgttgaCg3g3皿tgg780acatctcgtgagttgcctgtcaccggttcttctttteatctttttcgtgateccactett840gttcttggtgcctctecteatetttcteatcttgttcttecteatgatgacactgggggt■gatteccagategtttctectectcctectggctcttetgtttctgctgtcacatgtcct960ateccatcactcatgatggtgtgggtgctectettettegcaattttcct1020attcttggtgctggtg郷gtccttcttttcagatttccgctttgcgtcatggtgat^g1080gtcacgateacagaggatcctecteagate皿tgttegtggtgttegttttctcactggc1140accaattcttgga皿gctegtttg皿ggatagttctgg皿ctttgtteggacgcttegag1200tetgatggtecttctttttctegtgattcacctgctegctteattcctggteagteteat1260gtggagcttgatcctgctgateattctgccgtegtcaccattgttgcteacaattcattt1320ggaactgcttctcttgatec1344〈210>2 〈211>1344 〈212>DNA 〈213>锯缘青蟹(Scylla serrata) 〈220〉
7
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一种锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1，其氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。
2. —种编码权利要求1所述结构蛋白1的DNA序列，其核苷酸序列如SEQID NO :1所
3. —种与权利要求1所述结构蛋白1特异性结合的单克隆抗体。
4. 权利要求3所述单克隆抗体在制备检测MCDV病毒试剂盒中的应用。
5. 权利要求3所述单克隆抗体在制备检测MCDV病毒胶体金试纸条中的应用。
全文摘要
本发明公开一种锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1及其单克隆抗体和应用，该锯缘青蟹双顺反子病毒结构蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本发明通过对MCDV进行研究分析，首次获得其结构蛋白1的氨基酸序列、核苷酸序列和单克隆抗体，并对该结构蛋白1进行了定位，为锯缘青蟹的病毒病研究提供了新的研究方向。本发明筛选到结构蛋白1的单克隆抗体可用于MCDV的监控，制备检测MCDV的病毒试剂盒，以及制备检测MCDV的病毒胶体金试纸。
文档编号G01N33/577GK101717434SQ200910213699
公开日2010年6月2日 申请日期2009年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者何建国, 区宇洁, 张锐, 翁少萍, 董传甫 申请人:中山大学