一种表达il12的多顺反子慢病毒载体及其制备与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种表达IL12的多顺反子慢病毒载体、慢病毒颗粒，以及其制备与应用。本发明在2A序列的上游接入IL12a基因，在2A序列的下游接入了IL12b基因，构建为pLVTH-IL12a-2A-IL12b慢病毒载体；该载体与pCMV-dR8.2dvpr、pCMV-VSV-G载体共同转染宿主细胞后，在宿主细胞中包装获得带有2A多肽的多顺反子慢病毒颗粒。本发明为基于FMDV2A多肽的多顺反子慢病毒载体，通过2A多肽的自剪切功能同时表达IL12的两个亚基，IL12a和IL12b，得到有活性的IL12，为基于IL12的基因治疗研究提供了新手段。
【专利说明】一种表达I LI 2的多顺反子慢病毒载体及其制备与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种表达IL12的多顺反子慢病毒载体、慢病毒颗粒，以及其制备与应用。
【背景技术】
[0002]慢病毒(Lentivirus)是逆转录病毒科(Retrovirus)的一个亚科，是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别于一般的逆转录病毒载体，它可以感染分裂细胞及非分裂细胞。慢病毒作为外源基因表达载体有以下优点，慢病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达；转移基因片段容量较大；目的基因表达时间长；不易诱发宿主免疫反应等。慢病毒克服了其它逆转录病毒载体的一些缺陷，因而成为最理想的基因转移载体之一，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。
[0003]口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus, FMDV)属于小 RNA病毒科口蹄疫病毒属(Peter W Mason, Marvin J Grubman, Barry Baxt.Molecular basis of pathogenesisof FMDV.Virus Research.2003; I (91):9-32.)。FMDV 基因组编码的蛋白酶 2A 可在翻译过程中形成的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间位阻，导致无法形成正常的肽链连接，但同时核糖体却能继续翻译下游蛋白，从而形成一种类似蛋白水解酶的作用将前后两个蛋白顺式“切开”。剪切位点位于高度保守的“NPGP”序列的“G”和“P”之间。2A则由于其独特的“剪切”机制，导致最终，2A能起到类似蛋白水解酶的作用，在该位点将一个启动子控制下的氨基酸序列顺式“切开”，分别得到一个融合有2A多肽尾巴的上游蛋白和一个N端带有一个脯氨酸的下游蛋白，独立行使功能。故FMDV 2A自我剪切序列与内部核糖体进入位点(IRES)—样都被应用于多顺反子表达载体的构建，以达到独立表达两段非融合外源蛋白的目的。与IRES相比，FMDV 2A在多顺反子载体构建上有明显的优势，比如，FMDV 2A因结构比较短小对插入的多顺反子序列的容量无苛刻要求，且2A元件所连接的上下游基因的表达平衡性好。这些多顺反子表达系统与不同的病毒载体结合被应用于多种疾病的基因治疗。
[0004]白细胞介素-12 (IL12)是能够调控固有及适应免疫反应的多活性细胞因子(Grufman P, K rre K.1nnate and adaptive immunity to tumors:1L-12 is required foroptimal responses.Eur J Immunol.2000; 30:1088-1093.),主要来源于单核 / 巨卩遼细胞、抗原递呈细胞和B细胞，是由相对分子质量为40 X IO3 (p40)和35X 103 (p35)两个亚单位经二硫键连接形成的异二聚体糖蛋白，P35和p40两个亚基单独存在时无生物学活性，只有两个亚基以1:1比例结合获得的p70蛋白才具有功能作用(Gubler U, Chua A0, SchoenhautDS, et al.Coexpression of two distinct genes is required to generate secretedbioactive cytotoxic lymphocyte maturation factor.Proc Natl Acad Sci USA.1991 ；88:4143-4147.)。IL-12 的受体 IL-12R 由 β I 链和 β 2 链构成(D.Sieburth, E.ff.Jabs, J.A.Warrington, X.Li, et al.Assignment of genes encoding a unique cytokine(IL12)composed of two unrelated subunits to chromosomes 3 and 5.Genomics.1992 ；14
(I):59-62.),有多种存在形式，与IL-12有很高的亲和力。p40与IL-12 β 2链结合，介导Ρ35与β I链结合，后者发挥生物活性。IL-12R存在于激活的T细胞以及静息或激活的NK细胞上，B细胞和静息的T细胞则没有IL-12R表达。IL12的生物学活性表现在其能够促进被激活T细胞的增殖，CD4T细胞向辅助效应Thl细胞的分化及CD8T细胞向CTL细胞的分化。另外，IL12能够增强NK细胞的细胞杀伤活性，并刺激NK细胞和T细胞分泌IFN- Y (Trinchieri G.1nterleukin-12 and the regulation of innate resistance andadaptive immunity.Nat Rev Immunol2003 ;3:133-146.)。IL-12 还能够平衡 Thl/Th2 的应答。IL-12直接激活Thl并抑制Th2 ;IL-12还可以诱导NK细胞和T细胞产生IFN-Y间接调节Thl/Th2 的应答平衡(Manetti R, Parronchi P, Giudizi MG, et al.Natural killer cellstimulatory factor(interleukin 12[IL-12]) induces T helper type I (Thl)-specificimmune responses and inhibits the development of IL-4-producing Th cells.J ExpMed.1993;177:1199-1204.) 0在一些临床肿瘤模型中，IL12疗法能够实现原发肿瘤的消退，抑制肿瘤的远端转移，并且延长荷瘤小鼠的寿命(Noguchi Y, Jungbluth A, RichardsEC, et al.Effect of interleukin 12 on tumor induction by 3-methylcholanthrene.Proc Natl Acad Sci USA.1996;93:11798-11801.Brunda MJ, Luistro L, Warrier RR, etal.Antitumor and antimetastatic activity of interleukin 12 against murinetumors.J Exp Med.1993;178:1223-1230.)。
[0005]IL12被应用于多种的治疗，IL12也被应用于T细胞，B细胞及NK细胞增殖的治疗。IL12与集落刺激因子GM-CSF结合 可以用于加强多发性骨髓瘤病的治疗。
[0006]科学家们尝试用重组表达的人IL-12 (rhIL-12)治疗多种B细胞恶性肿瘤实体肿瘤，包括血液相关恶性肿瘤患者在接受自体干细胞移植后。临床前实验结果表明，IL-12疗法治疗小肿瘤的效果比较理想，而对大量而扩散的肿瘤疗效较差。患有血液相关恶性肿瘤的病人在接受高剂量的化疗或自体干细胞移植后，少量的遗留肿瘤病灶，尤其适用于IL-12疗法。临床一期实验表明，适当剂量的IL-12能够显著增强病人外周血主要的淋巴细胞亚群如CD4T细胞，CD8T细胞，B细胞及NK细胞的增殖。接受自体干细胞移植后的病人外周血单核细胞也实现了正常增殖。IL-12与集落刺激因子GM-CSF共同作用还能协助特异性抗原疫苗用于多发性骨髓瘤的预防与治疗，激活特异性T细胞的反应并与调节性T细胞共同作用，使病人产生抗肿瘤的免疫反应(Combined IL-12 and GM-CSF gene therapyfor murine hepatocellular carcinoma.Wang Z, Qiu SJ, Ye SL,et al.Cancer GeneTherapy.2001;8(10):751-758.)。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于构建一种表达IL12的多顺反子慢病毒表达载体及病毒颗粒，用于IL12的工业化制备。
[0008]本发明首先公开了一种表达IL12蛋白的多顺反子表达载体，含有IL12蛋白表达序列，所述IL12蛋白表达序列含有5’至3’方向连接的IL12a基因序列，自剪切多肽2A基因序列，以及IL12b基因序列。
[0009]较优的，所述表达IL12蛋白的多顺反子表达载体由前述IL12蛋白表达序列插入到慢病毒载体获得。
[0010]更优的，所述慢病毒载体为pLVTH。
[0011]最优的，所述IL12蛋白表达序列插入到pLVTH载体的的BamH I酶切位点和EcoRI酶切位点之间。
[0012]最优的，所述IL12蛋白表达序列如SEQ ID NO: 10所不。
[0013]本发明第二方面公开了前述表达IL12蛋白的多顺反子慢病毒载体的构建方法，为采用自剪切多肽2A连接IL12的两个亚基IL12a与IL12b，构建IL12蛋白表达序列，并插入慢病毒载体获得。
[0014]本发明第三方面公开了一种表达IL12蛋白的病毒颗粒，为前述表达IL12蛋白的多顺反子慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
[0015]较优的，所述慢病毒包装质粒为pCMV-dR8.2dvpr和pCMV_VSV_G包装辅助载体。
[0016]较优的，所述细胞系为293T细胞。
[0017]将pLVTH-1L12a-2A-1L12b 载体、pCMV_dR8.2 dvpr 载体和 pCMV-VSV-G 载体共同转染宿主细胞后，即可在宿主细胞中包装获得基于FMDV2A多肽的多顺反子慢病毒颗粒。
[0018]本发明利用口蹄疫病毒2A多肽自剪切功能同时表达IL12蛋白的两个独立亚基，通过慢病毒颗粒将表达IL12蛋白IL12a亚基和IL12b亚基的IL12a_2A_IL12b基因高效转导入细胞进行表达，经2A多肽自剪切后，两个亚基独立表达，2个亚基通过二硫键连接且以1:1比例形成有活性的IL12。
[0019]本发明最核心的技术关键是通过分子克隆的方法将IL12a-2A_IL12b序列接入慢病毒载体，经过包装获得的慢病毒在感染细胞后，表达该多顺反子，并经由2A多肽自剪切，形成两个独立的蛋白，产生有活性的IL12。
[0020]本发明第四方面公开了前述表达IL12蛋白的病毒颗粒的制备方法，步骤如下:
[0021]1)合成 IL12 蛋白表达序列 IL12a-2A-1L12b (SEQ ID NO:10 所示)；
[0022]2)采用IL12蛋白表达序列IL12a_2A_IL12b替换pLVTH慢病毒载体中GFP基因，获得表达IL12蛋白的重组慢病毒载体pLVTH-1L12a-2A-1L12b ；
[0023]3)将多顺反子表达载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下进行病毒包装，转染并培养；
[0024]4)从含有病毒颗粒的细胞培养液中分离纯化病毒颗粒。
[0025]优选的，步骤3)具体为:将重组慢病毒载体、pCMV-dR8.2 dvpr载体和pCMV_VSV_G载体共同转染宿主细胞；培养宿主细胞，收获含有病毒颗粒的细胞培养液。
[0026]本发明第五方面公开了一种IL12蛋白的表达系统,含有前述表达IL12蛋白的病毒颗粒以及宿主细胞。
[0027]较优的，所述宿主细胞为293T细胞。
[0028]本发明的基于FMDV 2A多肽的多顺反子慢病毒颗粒，该病毒颗粒感染宿主细胞后，能够在宿主细胞中同时独立表达IL12a和IL12b。
[0029]pLVTH-1L12a-2A-1L12b载体在pLVTH慢病毒载体的基础上改造而成，通过分子克隆的方法，将IL12a-2A-1L12b替换原载体中的GFP基因序列。pLVTH载体中含有HIV的基本兀件5，LTR和3，LTR以及其他辅助兀件，例如WRE (woodchuck hepatitis virusposttranscript ional regulatory element)。通常根据不同的实验目的针对pLVTH载体进行改造，例如:通过分子克隆的方法在该载体中插入特殊启动子序列以进行启动子活性研究，插入特殊的基因序列进行基因表达的研究，插入特殊的RNA干扰序列进行RNA干扰实验研究等。pLVTH载体可以通过addgene网站购得。
[0030]pCMV-dR8.2 dvpr载体中含有HIV病毒的gag基因，编码病毒主要的结构蛋白；pol基因，编码合成160kD的gag-pol前体蛋白，从N端至C端分别产生蛋白酶、逆转录酶、核糖核酸酶H及整合酶；rev基因:编码一种96kD的磷蛋白，主要定位于核内，rev结合于RRE,促使病毒转录出各种mRNA，由细胞核进入胞浆，并使其保持稳定；RRE元件，为Rev反应元件，能够明显地增加报告基因的表达。pCMV-dR8.2 dvpr载体可以通过addgene网站购得。
[0031]pCMV-VSV-G载体中含有单纯疱疹病毒来源的VSV-G基因，提供病毒包装所需要的包膜蛋白。pCMV-VSV-G载体可以通过addgene网站购得。
[0032]本发明最后一方面，公开了前述表达IL12蛋白的多顺反子表达载体，表达IL12蛋白的病毒颗粒，以及表达系统在IL12蛋白制备中的应用。
[0033]本发明为基于FMDV 2A多肽的多顺反子慢病毒载体，通过2A多肽的自剪切功能同时表达IL12的两个亚基，IL12a和IL12b，产生有活性的IL12，为基于IL12的基因治疗研究提供了新手段。并且本发明的IL12a-2A-1L12b慢病毒载体中的IL12a基因和IL12b基因序列可以通过分子克隆的方法被其他基因所替代，这为基因功能的研究提供了新手段。
【专利附图】
【附图说明】[0034]图1:PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱[0035]条带A:PCR扩增2A基因；[0036]条带B:PCR扩增IL12b基因；[0037]条带C:PCR扩增IL12a基因[0038]条带 M:Marker (5kb, 3kb, 2kb, 1.5kb, 1Kb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)[0039]图2:PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱[0040]条带 A:PCR 扩增 IL12a-2A-1L12b 产物[0041]条带 M:Marker (5kb, 3kb, 2kb, 1.5kb, 1Kb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)[0042]图3:PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱[0043]条带1-8: PCR鉴定IL12重组质粒1-8号转化子[0044]条带 M:Marker (5kb, 3kb, 2kb, 1.5kb, 1Kb, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)[0045]图4:ffestern blot方法检测IL12重组蛋白的表达[0046]条带 M:蛋白 marker，从上到下大小依次为 250KD, 130KD, 95KD, 72KD, 55KD, 36KD,28KD,17KD[0047]条带1:Western阳性对照标准品-SURVIVIN-3FLAG-GFP (分子大小:48KD)[0048]条带2:对照慢病毒感染293T细胞样品[0049]条带3:IL12慢病毒感`染293T细胞样品[0050]图5 =MTT法测定IL12蛋白对PHA活化的人PBMC细胞增殖的影响[0051]图6:pLVTH载体结构图【具体实施方式】[0052]下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如[美]Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京:科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
[0053]实施例1表达IL12的双顺反子慢病毒的制备
[0054]1.PCR法分别扩增IL12a、IL12b和2A片段
[0055]引物序列如下表1所示，PCR引物由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。
[0056]表1引物序列
[0057]
【权利要求】
1.一种表达IL12蛋白的多顺反子表达载体，含有IL12蛋白表达序列，其特征在于，所述IL12蛋白表达序列含有5’至3’方向连接的IL12a基因序列，自剪切多肽2A基因序列，以及IL12b基因序列。
2.如权利要求1所述的多顺反子表达载体，其特征在于，该多顺反子表达载体由所述IL12蛋白表达序列插入到慢病毒载体获得。
3.如权利要求2所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述慢病毒载体为pLVTH。
4.如权利要求3所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述IL12蛋白表达序列插入到pLVTH载体的BamH I酶切位点和EcoR I酶切位点之间。
5.如权利要求1所述的多顺反子表达载体，其特征在于，所述IL12蛋白表达序列如SEQID NO:10 所示。
6.权利要求1-5任一权利要求所述表达IL12蛋白的多顺反子慢病毒载体的构建方法,为采用自剪切多肽2A连接IL12的两个亚基IL12a与IL12b，构建IL12蛋白表达序列，并插入慢病毒载体获得。
7.一种表达IL12蛋白的病毒颗粒，为权利要求1-5任一权利要求所述表达IL12蛋白的多顺反子慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
8.权利要求7所述表达IL12蛋白的病毒颗粒的制备方法，步骤如下:1)合成SEQID NO:10所示的IL12蛋白表达序列；2)采用IL12蛋白表达序列替换pLVTH慢病毒载体中GFP基因，获得表达IL12蛋白的多顺反子表达载体；·3)将多顺反子表达载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下进行病毒包装，转染并培养;4 )从含有病毒颗粒的细胞培养液中分离纯化病毒颗粒。
9.一种IL12蛋白的表达系统，含有权利要求7所述表达IL12蛋白的病毒颗粒以及宿主细胞。
10.权利要求1-5任一权利要求所述表达IL12蛋白的多顺反子表达载体，权利要求7所述表达IL12蛋白的病毒颗粒，以及权利要求9所述表达系统在IL12蛋白制备中的应用。
【文档编号】C12N7/01GK103589752SQ201310369582
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年8月22日 优先权日:2013年8月22日
【发明者】曹跃琼, 朱向莹, 金杨晟 申请人:苏州吉凯基因科技有限公司