用于细菌的多顺反子表达系统的制作方法【专利摘要】本发明涉及革兰氏阳性菌中的多顺反子表达，并且特别地涉及多顺反子表达单元，所述多顺反子表达单元包含与对革兰氏阳性菌外源的一个或更多个基因转录偶联的对所述细菌内源的一个或更多个基因。【专利说明】用于细菌的多顺反子表达系统【
技术领域：
】[0001]本发明属于生物学和医学的领域，更特别地属于分子和细胞生物学的领域，并且涉及通过微生物重组改造和表达产物，例如肽、多肽或蛋白质。更特别地，本发明涉及用于通过微生物表达这样的产物的多顺反子表达构建体或盒，并且还涉及载体、经转化宿主、用途和应用，例如向患者递送(尤其是治疗性递送)如此表达的产物。【
背景技术：
】[0002]迄今为止，已开发了重组蛋白的多种表达系统用于多种生物技术应用。在原核生物、酵母和真菌中并且在哺乳动物细胞中已建立了用于异源或同源基因表达的系统。[0003]使用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为宿主系统表达了酵母中产生的大多数重组蛋白。尽管如此，还是在酿酒酵母系统中发现了一些限制。例如产率通常低和分泌效率低(发现许多酿酒酵母蛋白质在培养基中不是游离的，而是保留在周质空间中或者与细胞壁缔合)(Dominguez等.1nt.Microbiol.，1998,vol.1(2)，131-142)。由于在酵母中进行生产的限制，对于在细菌中表达蛋白质产生了很大的兴趣，细菌易于在廉价培养液中生长并经常用于生产重组蛋白。在原核系统中，使用大肠杆菌(E.coli)中的重组表达通常得到最高的蛋白质水平(Jana&Deb.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2005,vol.67(3),289-298)。但是，在大肠杆菌中，最常用的生产策略是细胞内的(在周质或胞质中)，因此涉及昂贵且经常产生问题的下游纯化过程。[0004]作为用于在体外重组表达异源多肽(例如，US5,559,007)以及用于在体内或原位表达并递送抗原和/或治疗相关多肽(例如，WO97/14806)的宿主，乳酸菌(LacticAcidBacteria,LAB)变得越来越重要。这些革兰氏阳性菌宿主中产生的异源蛋白质可容易地分泌到培养基中，从而有助于其纯化以及其向对象的直接递送。[0005]大多数表达系统可非常好地处理单一蛋白质的表达(由单一基因序列引起)。但是，在一些情况下期望存在这样的表达系统，其能够表达多种蛋白质或多基因蛋白质复合体，例如，不仅在体外表达抗体或蛋白质复合体，而且在体内或原位表达并递送对具体疾病具有协同效应的两种或更多种蛋白质，或者在体内或原位表达并递送抗体或其功能性(多基因)片段。在这些情况下，由于必须严格共同调控多个基因，所以期望存在在一个启动子控制下编码期望蛋白质或抗体的多个基因。[0006]产生重组蛋白质复合体的两种最常见途径是使单独表达并纯化的亚基进行体外重组，或者通过在适当宿主中共表达亚基来实施体内重组(Selleck&Tan,“RecombinantproteincomplexexpressioninE.coli，，，Curr.Protoc.ProteinSc1.,2008,第5章:第5单元，21)。虽然体外重组已被成功使用，但是该方法是繁琐的(必须表达并纯化每个亚基，并且在重组之后必须进一步纯化复合体)并且重组产率通常较低。相比之下，通过共表达进行体内重组提供了效率的益处(仅一轮表达和纯化)以及期望复合体的潜在较高产率和质量(复合体的再折叠和装配在细胞环境中在蛋白质折叠酶存在下发生)(SelleCk&Tan2008，见上)。通过用表达各蛋白质亚基的杆状病毒共感染昆虫细胞(Tirode等.Mol.Cell,1999,vol.3(I)，87-95)，以及在细菌中由多个质粒(Johnston等.ProteinExpr.Purif.,2000,vol.20(3)，435-443；McNally等.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,1988,vol.85(19),7270-7273)或专门化的多顺反子质粒(Henricksen等.J.Biol.Chem.,1994，vol.269(15)，II121-1I132;Ishiai等?J.Biol.Chem.1996，vol.271(34)，20868-20878；Li等?Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,1997,vol.94(6)，2278-2283)成功进行了体内重组。[0007]已描述了用于在大肠杆菌中产生蛋白质复合体的一般多顺反子表达系统(Selleck&Tan2008,见上；Tan.Protein.Expr.Purif.,2001,vol.21(1),224-234；Tan等?ProteinExpr.Purif.,2005,vol.40(2),385-395)。这些系统利用了翻译盒的概念,所述翻译盒由具有需要的起始密码子和终止密码子的编码区以及之前的翻译起始信号例如夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno(SD))序列和翻译增强子(Tan2001，Tan等?2005，见上)构成。当转录成mRNA时,翻译盒包含使大肠杆菌翻译机构启动并维持mRNA翻译成期望多肽的必需且足够的信息(Selleck&Tan2008，见上)。[0008]虽然在大肠杆菌中已描述了用于白细胞介素18的双顺反子表达载体，但是两个基因之间的基因间区域由合成接头组成，并且其具有明显的基因特异性因为胱天蛋白酶-4的表达比ICE的表达高得多。Smolke等之前证实了可使用合成基因间区域序列来差异性控制由操纵子的两种或更多种基因编码的蛋白质水平(Smolke等.Appl.Environ.Microbiol.，2000,vol.66(12)，5399-5405；SmoIke&Keasling.Biotechnol.Bioeng.，2002,vol.80(7),762-776)。但是，该途径依赖于随机组合，并且需要将合成序列引入表达宿主中。[0009]近些年来对新的改良抗体生产系统的需求增加。在原核生物、酵母和真菌中并且在哺乳动物细胞中已建立了用于抗体表达的系统。虽然由细菌更容易产生单链抗体和单结构域抗体，但是全尺寸抗体一般具有更高的结合亲和力和更小的在注射时形成中和抗体的风险。[0010]可由细菌产生全尺寸抗`体(Mazor等.Nat.Biotechnol.,2007,vol.25(5)，563-565；Simmons等?J.1mmunol.Methods,2002，vol.263(1-2)，133-147)。关于重组原核表达的大多数报道描述了抗体片段的产生，虽然几乎仅由大肠杆菌产生。虽然多种经改造LAB能够发生正确的二硫键连接，但是文献仅包含由LAB产生的抗体样分子的有限个数的实例(Kruger等.NatureBiotechnology,2002,vol.20(7),702-706；Beninati等.NatureBiotechnology,2000,vol.18(10),1060-1064；Chancey等?J.1mmunol.,2006，vol.176(9),5627-5636；Hultberg等.BMCBiotechnol.,2007,vol.7,58；Yuvarai等?Mol.Nutr.Food.Res.，2008，vol.52(8)，913-920)。这些报道仅描述了在乳杆菌(Lactobacillus)物种、乳酸乳球菌(LactococcusIactis)和格氏链球菌(Streptococcusgordonii)中表达的单链抗体片段，而没有描述多基因的双链抗体片段或全尺寸抗体。[0011]多顺反子表达系统在得到复杂蛋白质如抗体的有效原核合成和表达中可以是至关重要的。自从FDA在1986年批准了莫罗单抗-⑶3(Muromonab-⑶3)(仍然是可用于控制移植排斥的最有效免疫抑制药之一)(Hooks等.Pharmacotherapy,1991,vol.11(1),26-37)以来，全尺寸抗体和抗体片段成为了医药中越来越重要和通用的工具。[0012]虽然现有技术水平揭示了细菌细胞中多顺反子表达系统的几个实例，但是这些是相当有限的，突出了对用于引入和表达多个基因的更有效系统的需要。因此，有需要提供可有利地用于蛋白质表达，优选异源蛋白质表达，并且甚至更优选地多种异源蛋白质表达的另外的序列。[0013]除以上之外，产生更高量的重组蛋白(对于通过重组微生物的直接蛋白质递送以及大量(bulk)蛋白质生产和下游纯化二者)的尝试代表了大的技术努力方向。增加异源蛋白质产量的一种现有途径是使用所选择的强启动子(参见例如WO2008/084115)。在这种途径中，进行蛋白质组学分析以鉴定由微生物表达的最丰富的内源蛋白质。通过使用基因组序列，可鉴定和分离各基因和启动子。这些强启动子(例如，乳酸乳球菌hllA基因启动子，PhllA)可定位在异源基因之前，并且通过这种方式可实现高表达。但是，损害宿主生理机能的表达水平可对宿主构成生长负担并导致反选择(counter-selection)。这固有地将表达宿主中任意给定异源蛋白质的最高可能表达限制在某一特定水平。这是染色体定位表达单元的开发中特别麻烦的障碍。[0014]传统地通过提供选择标志物来解决反选择的问题。的确，阳性选择或阴性选择(例如，通过提供抗生素抗性基因)可防止引入的异源基因丢失。可替代地或者除使用选择标志物之外，可采用诱导型基因表达系统，其允许使宿主繁殖与异源蛋白质的表达的解偶联，从而在异源基因不表达时防止繁殖期期间可能的反选择。在该背景下，EP0569604描述了嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)中的诱导型表达系统,其中异源基因强制性定位在LacZ基因的5’。通过这种方式，异源基因的表达不仅是诱导型的，而且另外通过使细菌在其自然栖息地乳中以乳糖作为碳源生长(这需要表达LacZ基因)来选择异源基因的保持。[0015]清楚的是，以上描述的用于异源基因表达的系统在应用中受到限制。例如，使用选择标志物例如抗生素抗性基因不太容易为食品生产中的应用或药剂应用所接受。此外，在自然栖息地生长或使用来自生长自然栖息的碳源生长的限制显著减少了用于异源基因表达的任意系统的多功能性。另外，诱导型系统的使用固有地取决于宿主的生长条件，使得需要应添加诱导物的限定培养基以确保异源蛋白质的表达。[0016]因此，本领域中还存在对增加异源蛋白质表达的需要，并且需要可实现高表达水平的序列、克隆系统和策略，以得到工业和/或治疗环境下以足够量表达并且同时在多种不同条件下是通用的并且可广泛使用的异源蛋白质。在这些环境中，还特别有用的是得到多种蛋白质的表达，每一种具有其自身的生物学活性和治疗性作用。【
发明内容】[0017]本发明的方面和实施方案解决了以上所讨论的本领域需要中的至少一些需要，例如一种或更多种需要。[0018]本发明人出乎意料地发现，革兰氏阳性菌可通过也包含这些细菌的内源基因的多顺反子表达单元有效地表达外源或异源基因。因此，当外源或异源基因与革兰氏阳性菌的内源基因转录或翻译偶联时，这些细菌可由多顺反子表达单元有效地表达所述外源或异源基因。出乎意料地，本发明人发现，多顺反子表达单元中内源基因与外源基因的转录和/或翻译偶联(transcriptionaland/ortranslationalcoupling)导致了革兰氏阳性菌中外源基因的高表达水平。特别地，发现跟不与革兰氏阳性菌内源基因转录或翻译偶联的外源基因的表达水平相比，与革兰氏阳性菌内源基因转录和/或翻译偶联的外源基因的表达水平至少与其相当并且有利地更高。[0019]因此，在本发明的一方面涉及包含多顺反子表达单元的革兰氏阳性菌，所述多顺反子表达单元包含一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因。因此，多顺反子表达单元也可表示为包含内源基因(例如但不限于一个内源基因)和一个或更多个外源基因。优选地，多顺反子表达单元连续地包含一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因。因此，这样的多顺反子表达单元也可表示为连续地包含内源基因(例如但不限于一个内源基因)和一个或更多个外源基因。多顺反子表达单元被构造成实现一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因转录为多顺反子mRNA。因此，本发明革兰氏阳性菌可另外地表示为包含与一个或更多个外源基因转录或翻译偶联的一个或更多个内源基因。因此，还提供了包含与一个或更多个外源基因转录或翻译偶联的一个或更多个内源基因的革兰氏阳性菌。[0020]另一个方面提供了包含多顺反子表达单元的重组核酸，所述多顺反子表达单元包含对革兰氏阳性菌内源的基因和一个或更多个对革兰氏阳性菌外源的基因。优选地，多顺反子表达单元连续地包含一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因。因此，还提供了包含多顺反子表达单元的的重组核酸，所述多顺反子表达单元包含与一个或更多个对革兰氏阳性菌外源的基因转录和/或翻译偶联的一个或更多个对革兰氏阳性菌内源的基因。[0021]优选地，如本说明书全文所意图的，所述一个或更多个外源基因可与所述一个或更多个内源基因的3’末端转录或翻译偶联。本发明人出乎意料地发现，这样的构造在异源蛋白质表达水平，多顺反子表达单元的维持和/或基因组稳定性方面是有益的。而且发现其他的下游基因组布置的重要性较小或不重要。[0022]转录或翻译偶联的一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因的转录可被能够在革兰氏阳性菌中实现转录的启动子合适地调节或控制，并且优选地可被所述革兰氏阳性菌的内源启动子调节或控制。因此，还提供了这样的革兰氏阳性菌，其包含与位于其天然染色体基因座的一个或更多个`内源基因转录或翻译偶联的一个或更多个外源基因。因此，优选地，这些转录或翻译偶联的一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因的转录被所述一个或更多个内源基因的天然启动子控制或调节。合适地，转录或翻译偶联可通过将一个或更多个外源基因染色体整合到所述基因座来实现，例如通过将一个或更多个外源基因染色体整合到所述基因座中所述一个或更多个内源基因的3’来实现。[0023]因此，在一个方面中，本发明涉及包含多顺反子表达单元的重组核酸或革兰氏阳性菌，所述多顺反子表达单元连续地包含内源基因和与所述一个或更多个内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个外源基因，优选地，其中所述一个或更多个外源基因是多顺反子表达单兀的最3’基因。[0024]本发明人出乎意料地发现，转录偶联到天然基因(其自身可以是多顺反子基因，例如操纵子)3’的外源或异源基因(或多个异源基因)的染色体整合产生稳定的表达单元，其中针对(一个或更多个)外源基因的反选择不存在或最小，这与预期的相反。[0025]本发明人出乎意料地发现，当在某些条件下(特别是通过某些类型的启动子)实现多顺反子表达单元的表达时，更加体现出本文描述的优点。本发明人出乎意料地发现，本文所述的多顺反子表达系统(其中通过常规方法例如使用选择标志物或通过使用诱导型系统没有解决针对异源蛋白质的反选择)可以仍稳定维持并以高水平表达，从而在不需要选择剂或诱导物的多种不同条件下广泛应用。如本文所述的多顺反子表达模块因此允许使用非选择性(non-selectable)内源基因和/或外源基因。[0026]在一个方面中，本发明涉及包含多顺反子表达单元的重组核酸或革兰氏阳性菌，所述多顺反子表达单元连续地包含内源基因和与所述内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个外源基因，其中所述多顺反子表达单元的表达通过组成型启动子实现。[0027]在另一个方面中，本发明涉及包含多顺反子表达单元的重组核酸或革兰氏阳性菌，所述多顺反子表达单元连续地包含内源基因和与所述内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个外源基因，其中所述多顺反子表达单元的表达通过中心代谢基因启动子(centralmetabolismgenepromoter)实现。[0028]在另一个方面中，本发明涉及包含多顺反子表达单元的重组核酸或革兰氏阳性菌，所述多顺反子表达单元连续地包含内源基因和与所述内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个外源基因，其中所述多顺反子表达单元的表达通过管家基因启动子实现。[0029]在另一个方面中，本发明涉及包含多顺反子表达单元的重组核酸或革兰氏阳性菌，所述多顺反子表达单元连续地包含内源基因和与所述内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个外源基因，其中所述多顺反子表达单元的表达通过必需基因启动子(essentialgenepromoter)实现。[0030]在另一个方面中，本发明涉及包含多顺反子表达单元的重组核酸或革兰氏阳性菌，所述多顺反子表达单元连续地包含内源基因和与所述内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个外源基因，其中所述多顺反子表达单元的表达不通过诱导型基因启动子实现。[0031]在另一个方面中，本发明涉及包含多顺反子表达单元的重组核酸或革兰氏阳性菌，所述多顺反子表达单元连续地包含内源基因和与所述内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个外源基因，其中所述多顺反子表达单元的表达通过核糖体基因启动子实现。[0032]在另一个方面中，本发明涉及包含多顺反子表达单元的重组核酸或革兰氏阳性菌，所述多顺反子表达单元连续地包含内源基因和与所述内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个外源基因，其中所述多顺反子表达单元的表达通过糖酵解基因启动子实现。[0033]如以上所示的，在一个优选实施方案中，如上所述的启动子是内源基因启动子。如以下进一步详细描述的，优选地，本文使用的启动子是强启动子。优选地但非限制地，所述内源启动子可选自eno、usp45、gapB、pyk、rpmB和rplS的启动子。非常优选地,翻译偶联的内源基因和一个或更多个外源基因的转录可被所述内源基因(之一)的天然启动子调节或控制。[0034]应理解，本文所述启动子的特征可根据本发明进行组合。因此，在一些实施方案中，本发明涉及包含多顺反子表达单元的重组核酸或革兰氏阳性菌，所述多顺反子表达单元连续地包含内源基因和与所述内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个外源基因，其中所述多顺反子表达单元的表达通过例如以下来实现:(内源)组成型管家基因启动子、(内源)组成型中心代谢基因启动子、(内源)组成型必需基因启动子、(内源)组成型核糖体基因启动子、(内源)组成型糖酵解基因启动子、(内源)中心代谢管家基因启动子、(内源)必需中心代谢基因启动子、(内源)必需中心代谢管家基因启动子、(内源)必需管家基因启动子、(内源)组成型中心代谢管家基因启动子、(内源)组成型必需中心代谢管家基因启动子、(内源)必需核糖体基因启动子、(内源)必需糖酵解基因启动子、(内源)组成型必需核糖体基因启动子、(内源)组成型必需糖酵解基因启动子。[0035]优选地，如贯穿本说明书所意图的，所述一个或更多个外源基因可与所述一个或更多个内源基因的3’末端转录或翻译偶联，其中所述一个或更多个内源基因存在于其细菌染色体上的天然位置处。在这种构造中，一个或更多个内源基因5’末端的序列(最少包含内源基因启动子)与野生型菌株中的相同，并且一个或更多个外源基因3’末端之后的区域与野生型菌株中一个或更多个内源基因3’区域的序列相同。[0036]外源蛋白质表达的许多应用例如通过重组微生物递送治疗性蛋白质可得益于在具体选择的宿主微生物中表达所述治疗性蛋白质。可基于其定殖能力进行选择这些微生物，例如选择来源于人或动物微生物群(microbiota)的菌株。也可基于加强任何具体递送的治疗性蛋白质的活性的能力选择微生物，例如因其细胞壁、细胞表面或细胞内容物与宿主免疫系统的相互作用，例如通过与toll样受体、Ig家族成员、补体、细胞因子等的相互作用。可根据坚持在具体的严苛递送位点(例如肿瘤内、皮肤、具有高胆汁含量的位点，PH低的位点等)中或其上的其稳健性来选择具体的微生物。贯穿本说明书所引述的革兰氏阳性菌可优选是乳酸菌(LAB),更优选是乳球菌属(Lactococcussp.)、甚至更优选是乳酸乳球菌(LactococcusIactis)或其亚种或菌株。可替代地，所述LAB可优选是肠球菌属(^Enterococcussp.),更优选是屎肠球菌或粪肠球菌(^Enterococcusfecium或Enterococcusfaecalis)或其亚种或菌株。[0037]为了避免侧向基因转移(lateralgenetransfer)至内源生物群落(microflora)，由嵌入染色体的表达单元进行表达对于将重组微生物群落用作医药中治疗性蛋白质的递送工具是高度有利的。另外，可证明位于染色体上的表达单元在后代中更为稳定地遗传，因此位于染色体上的表达单元可以是用于大量蛋白质生产的生产菌株的期望结构。在现有技术水平下，通过使用条件性非复制并且在允许同源重组的侧翼区之间包含异源基因的敲入(KI)型载体进行染色体插入。在常规途径(参见，例如W02008/084115)中，在同源宿主中构建KI质粒(用`于乳酸乳球菌的KI质粒在乳酸乳球菌中建立)。对于需要蛋白质分泌的异源表达尤其是如此，原因是许多分泌信号不适用于其他宿主。表达构建体中旨在放置在细菌染色体上的强启动子的使用被来自KI质粒中间体的异源基因的表达阻碍。异源基因之前紧接强启动子，使得来自KI质粒的表达(虽然不是所意图的也不是需要的)固有地限制了最强启动子的使用，在许多情况下，KI质粒的拷贝数是宿主中染色体数目的多倍，使得整合后表达将减少几倍。因此，染色体表达单元本质上比可实现的最高的弱。通过本文所述的本发明避免了这个问题。在该途径中，异源基因定位在细菌染色体上(强表达)内源基因的下游并且与其转录和/或翻译偶联。该策略不需要KI质粒上存在内源(强)启动子。相反地，(强表达)内源基因的不含启动子的3’末端定位在异源基因的上游。这种类型的KI质粒是沉默的并且不限制强启动子的使用。[0038]如本文所述的一个或更多个外源基因与一种或更多种其他基因的转录或翻译偶联可借助在革兰氏阳性菌中有活性(即，功能性、有效)的基因间区域(优选地借助革兰氏阳性菌中的内源基因间区域)来实现。因此，另一个方面提供了这样的重组核酸，其包含与对革兰氏阳性菌外源之基因可操作连接的在所述革兰氏阳性菌中有活性的基因间区域，优选革兰氏阳性菌的内源基因间区域。可操作连接确保了与外源基因转录物一起存在于mRNA上的基因间区域转录物能够在革兰氏阳性菌中提供外源基因的翻译起始位点。优选地，基因间区域可设置在外源基因的5’。核酸可包含以多顺反子布置的两种或更多种外源基因，每个外源基因的前面具有基因间区域。基因间区域可相同或不同。例如，当基因间区域不同时，其可对应于来源于相同或不同物种之不同基因或者来源于不同物种之相同基因的基因间区域。这些核酸可用于构建包含一个或更多个外源基因的多顺反子表达单元，其中一个或更多个其他基因与一个或更多个外源基因通过基因间区域转录或翻译偶联。例如，这些核酸可用于构建如本文教导的多顺反子表达单元，其中一个或更多个内源基因与一个或更多个外源基因通过基因间区域转录或翻译偶联。优选地，多顺反子表达单元的第一顺反子是强表达的内源基因。[0039]本发明的重组核酸可包含在复制子上。因此，一个方面涉及包含如本文教导的核酸的复制子或载体。例如，载体可以是原核表达载体，优选是原核多顺反子表达载体。但是，开发这样的质粒表达系统可以是繁琐的，因为某些复制子与强启动子的组合可以是不稳定的。另外，因为天然质粒的存在，所以可能不能用重组质粒转化所选择的微生物并在微生物中稳定维持所述重组质粒，在表达质粒中不可包含抗生素选择标志物的情况下(如在用于治疗性蛋白质递送的应用中的情况)尤其可能不能。这个问题可通过将异源基因定位在细菌染色体上的(强表达)内源基因下游并与其转录或翻译偶联来避开。由于该策略不需要基于质粒的表达系统，所以其可用作适用于遗传改造任意类型的所选微生物群体的一般途径。所需的唯一菌株特异性信息可通过本领域现有技术水平快速建立。将高通量测序与丰富表达的蛋白质的蛋白质组学分析相组合将快速产生编码丰富存在之蛋白质的区域的核苷酸序列。因此，最优选地，如本文所述的载体可构造成实现革兰氏阳性菌中的同源重组，例如产生外源基因的染色体整合。[0040]还提供了如本文所述的重组核酸或载体在革兰氏阳性菌中多顺反子表达一个或更多个外源基因或者多顺反子表达一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因的用途。另外，公开了包含如本文所教导的重组核酸或载体(例如，用其转化)的革兰氏阳性菌，其中所述革兰氏阳性菌能够多顺反子表达一个或更多个外源基因或者多顺反子表达一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因。还提供了在革兰氏阳性菌中实现多顺反子表达一个或更多个外源基因或者实现多顺反子表达一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因的方法，其包括将如本文`所教导的重组核酸或载体引入所述革兰氏阳性菌中的步骤。另外，提供了能够多顺反子表达一个或更多个外源基因或者能够多顺反子表达一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因的革兰氏阳性菌的产生方法，其包括将如本文所教导的重组核酸或载体引入所述革兰氏阳性菌中的步骤。[0041]本发明允许在革兰氏阴性菌中表达(优选强(高度)表达)单一外源基因或多个(例如，两个、三个或更多个)不同的外源基因。所述单一外源基因或多个外源基因可编码单一表达产物或多种表达产物，例如，有利地为蛋白质、多肽和/或肽。例如而非限制，这样的蛋白质、多肽和/或肽可涵盖抗原(例如，用于诱导免疫或免疫耐受性)、变应原、非致疫苗作用的(non-vaccinogenic)治疗性多肽(细胞因子、生长因子、创伤愈合因子......)、抗体或其功能性片段(例如，Fab片段)、融合蛋白、多聚蛋白等及其任意组合。[0042]多顺反子结构可使如本文所教导的表达单元特别适合于表达包含两条或更多条多肽链的蛋白质(例如，多聚蛋白、蛋白质复合体)。因此，如本说明书所意图的两个或更多个外源基因可优选地编码多聚体蛋白质的不同单体或亚基，借此使基因共转录为多顺反子mRNA并且由该mRNA翻译各单体或亚基。这可允许严格调控外源基因的共表达，例如以实现各单体或亚基至多聚体蛋白质的平衡且最优的组装。[0043]抗体或其功能性片段的表达特别有利地阐明了该原理。因此，如本文所教导的两个或更多个外源基因可优选地编码抗体或其功能性片段的不同链。例如，一个外源基因可编码抗体的轻链(\)或其功能性片段，另一个外源基因可编码抗体的重链(Vh)或其功能性片段。优选地，抗体的功能性片段可以是Fab。在一些具体但非限制性的实施方案中，所述Fab可与细胞因子、细胞因子受体、趋化因子或免疫/炎性活化分子结合和/或抑制其生物作用。在一个优选实施方案中，Fab可与TNFa结合和/或抑制其生物作用，例如但不限于，所述Fab可以是cA2抗TNF或CDP870抗TNF。[0044]因此，使编码抗体或其片段各链的外源基因转录或翻译偶联以在革兰氏阳性菌中进行多顺反子表达。优选地，编码\或其功能性片段的外源基因可与编码Vh或其功能性片段的外源基因的3’末端转录或翻译偶联。该基因结构产生了抗体或其功能性片段的特别有效的表达和组装。[0045]多顺反子结构还可使如本文所教导的表达单元特别适合于共表达这样的产物(例如蛋白质)，所述产物在例如通过细菌原位递送时配合以实现协同效应，例如协同的治疗性或预防性作用。[0046]另一个方面提供了如本文所教导的革兰氏阳性菌，其中一个或更多个外源基因编码在对象中具有治疗性或预防性作用的一种或更多种产物，例如蛋白质、多肽或肽。特别地提供这样的细菌用作药剂，更特别地用于将所述一种或更多种产物施用或递送至对象，甚至更特别地用于治疗可得益于所述一种或更多种产物之施用或递送的疾病。因此，还提供了包含这样的革兰氏阳性菌的药物组合物。[0047]另外，提供了用于将`一种或更多种产物(例如蛋白质、多肽或肽)递送至对象的方法，其包括向对象施用如本文所教导的革兰氏阳性菌，其中一个或更多个外源基因编码所述一种或更多种产物。优选地，所述一种或更多种产物在对象中可具有治疗性或预防性作用。[0048]为了将本发明革兰氏阳性菌原位递送至对象，有利的是通过除用于外源表达产物的序列之外不引入或引入更少的外源或甚至致病性序列使细菌更接近地保留其内源特征。从而，尽可能多地维持GRAS规则或“一般认为安全的(GenerallyRecognizedAsSafe)”状态，从而方便获得将改造菌株用于人或动物的临床批准或市场许可的过程。[0049]下文中的(i)至(xxii)项示出了根据本发明的另一些方面和实施方案。[0050](i)包含多顺反子表达单元的革兰氏阳性菌，所述多顺反子表达单元连续地包含内源基因和与所述一个或更多个内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个外源基因。[0051](ii)包含多顺反子表达单元的重组核酸，所述多顺反子表达单元连续地包含对革兰氏阳性菌内源的基因和与所述一个或更多个内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个对革兰氏阳性菌外源的基因。[0052](iii)根据(i)的革兰氏阳性菌或者根据(ii)的重组核酸，其中所述一个或更多个外源基因编码在对象中具有治疗性或预防性作用的蛋白质、多肽和/或肽，或者用于诱导免疫或免疫耐受性的抗原，非致疫苗作用的治疗活性多肽，抗体或其功能性片段如Fab，融合蛋白或多聚体蛋白质。[0053](iv)根据⑴的革兰氏阳性菌或者根据(ii)的重组核酸，其中所述一个或更多个外源基因编码产物，例如蛋白质、多肽或肽，所述产物在对象中具有治疗性或预防性作用，所述革兰氏阳性菌或重组核酸用作药物，优选地用于将所述产物施用或递送至所述对象。[0054](V)根据或(iv)的革兰氏阳性菌或者根据(ii)至(iv)的重组核酸，其中所述一个或更多个外源基因是多顺反子表达单元的最3’基因。[0055](vi)根据(i)、(iii)、(iv)或(V)中任一项的革兰氏阳性菌或者根据(ii)至(V)中任一项的重组核酸，其中所述内源基因和所述一种或跟多种外源基因被对革兰氏阳性菌内源的启动子转录控制。[0056](vii)根据(Vi)的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中所述启动子是必需基因启动子、组成型启动子、中心代谢基因启动子和/或管家基因启动子。[0057](viii)根据(Vi)的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中所述启动子是核糖体基因启动子。[0058](ix)根据(Vi)的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中所述启动子是糖酵解基因启动子。[0059](x)根据(Vi)的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中所述启动子选自所述革兰氏阳性菌的eno、usp45、gap、pyk、rpmB和rplS的启动子。[0060](xi)根据⑴或(ii)至(X)中任一项的革兰氏阳性菌，其中所述内源基因位于革兰氏阳性菌的其天然染色体基因座中。[0061](xii)根据(Xi)的革兰氏阳性菌，其中通过将一个或更多个外源基因染色体整合至所述基因座、优选地通过将一个或更`多个外源基因染色体整合至所述基因座中内源基因的3’来将所述内源基因与一个或更多个外源基因转录偶联。[0062](xiii)根据⑴或(iii)至(xii)中任一项的革兰氏阳性菌或者根据(ii)至(X)中任一项的重组核酸，其中所述内源基因与所述一个或更多个外源基因通过在革兰氏阳性菌中有活性的一个或更多个基因间区域转录偶联，优选地，其中所述一个或更多个基因间区域对于所述革兰氏阳性菌是内源的。[0063](xiv)根据(xiii)的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中所述基因间区域选自在rplff>rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplE和rplF之前的基因间区域。[0064](XV)重组核酸，其包含与对革兰氏阳性菌外源的基因可操作连接的在所述革兰氏阳性菌中有活性的基因间区域，优选地，其中所述基因间区域是革兰氏阳性菌的内源基因间区域。[0065](xvi)根据(xiv)的重组核酸，其中所述基因间区域选自在rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplE和rplF之前的基因间区域。[0066](xvii)根据⑴或(iii)至(xiv)中任一项的革兰氏阳性菌或者根据(ii)至(X)或(Xiii)至(XVi)中任一项的重组核酸，其中一个外源基因编码抗体的轻链或其功能性片段，另一个外源基因编码抗体的重链(Vh)或其功能性片段，更优选地，其中所述功能性片段是Fab。[0067](xviii)根据(xvii)的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中编码'或其功能性片段的外源基因与编码Vh或其功能性片段的外源基因的3’末端转录偶联。[0068](xix)根据⑴、(iii)至(xiv)、(xvii)或(xviii)中任一项的革兰氏阳性菌或者根据Qi)至(X)或(xiii)至(xviii)中任一项的重组核酸,其中所述革兰氏阳性菌是乳酸菌，优选乳球菌、乳杆菌或肠球菌，更优选是乳酸乳球菌或屎肠球菌，或者其中所述革兰氏阳性菌是双歧杆菌(Bifidobacterium)。[0069](XX)药物组合物，其包含根据(i)、(iii)至(xiv)或(xvii)至(xix)中任一项的革兰氏阳性菌。[0070](xxi)根据(XX)的药物组合物，其中所述一个或更多个外源基因编码产物，例如蛋白质、多肽或肽，所述产物在对象中具有治疗性或预防性作用。[0071](xxii)载体,其包含根据(ii)至(X)或(xiii)至(xix)中任一项的重组核酸。[0072]在以下部分和所附权利要求书中描述了本发明的以上和另一些方面和优选实施方案。所附权利要求书的主题具体地引入本说明书中。【专利附图】【附图说明】[0073]图1:乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactisssp.Cremoris)菌株MG1363对数期结束(end-log)培养物的细胞蛋白质的考马斯亮蓝染色。主要的蛋白质带标示为I至12。[0074]图2:参照的单顺反子表达构建体(上图，SAGX0090)和根据本发明一个实施方案的多顺反子(双顺反子(bicistronic)、双重顺反子(dualcistron))构建体(下图)的图示，其中基因X表示内源基因。两种表达构建体旨在用于由大肠杆菌UidA基因表达P-葡萄糖醛酸酶，其在这里充当示例性外源基因。[0075]图3:在参照宿主(单顺反子:PhllA>>uidA,sAGX0090)中和包含根据本发明一个实施方案的多顺反子(双顺反子)构建体(如图2所构造)的宿主(内源基因X>>rpmD>>uidA)中的相对P-葡萄糖醛酸酶(CTS)活性。在该实施例中，内源基因X是usp45、enoA、rplS、rpmB、pyk和gapB。在该实施例中，rpmD基因间区域提供了内源基因与外源基因的转录偶联。外源大肠杆菌uidA基因编码3-葡萄糖醛酸酶。所有的表达构建体都嵌在细菌染色体中。单顺反子构建体存在于thyA基因座中，双顺反子构建体嵌在基因X的天然位置处。数据表明所有的双顺反子构建体具有优于单顺反子PhllA>>uidA构建体的b-半乳糖苷酶活性。[0076]图4:在参照宿主(SAGX0122)和根据本发明一个实施方案的宿主(sAGX0121和sAGX0164)中通过乳酸乳球菌的人胰岛素原(ins)分泌的定量。(A)ins表达模块的概述图。菌株sAGX0122携带单顺反子表达构建体,其中thyA启动子驱动分泌前导物(secretionleader)-人胰岛素原融合物(SS::ins)的表达,所述构建体在thyA基因座处嵌在乳酸乳球菌MG1363染色体中。SAGX0121和sAGX0164中的双顺反子表达构建体由内源usp45和enoA分别与SS::1ns通过rpmD基因间区域转录偶联组成。这些构建体分别位于乳酸乳球菌MG1363染色体上usp45和enoA基因的天然位置处。(B)在多种菌株的上清液中检测到的胰岛素原水平。分别指示这些菌株的上清液中的人胰岛素原水平的柱下面标示出菌株代码(SAGX0122、SAGX0121和sAGX0164)。数据表明携带双顺反子构建体的两种菌株具有优于携带单顺反子PthyA>>ins构建体的菌株的人胰岛素原水平。[0077]图5:乳酸乳球菌中的cA2抗TNFFab表达。编码VLCL(L)与VHCHl⑶片段的基因通过rpmD、rplB、rpsG、rpsE和rplN基因间区域转录偶联。制备了其中L或H定位为双顺反子构建体第一基因的构建体。所有的抗TNA表达构建体都是基于质粒的并且受PthyA启动子控制。在多种菌株的上清液中测量抗TNF活性。数据表明在H是双顺反子构建体第一基因的所有构建体中抗TNF活性较高。[0078]图6:乳酸乳球菌中的⑶P870抗TNFFab表达。(A)将与usp45分泌前导物编码序列融合的CDP870轻链和重链(SS::CDP870VLCL和SS::CDP870VHCH1)作为第二和第三顺反子插入乳酸乳球菌MG1363染色体中usp45(sAGX0219、sAGX0220)的下游。在sAGX0219和SAGX0220中，rpmD用于偶联SS::⑶870基因与usp45。为了避免遗传不稳定，轻链与重链基因通过在rplN前面的基因间区域偶联。在SAGX0219中，轻链基因在重链基因之前，而在SAGX0220中，重链基因在轻链基因之前。⑶粗制培养物上清液中抗人TNF活性的定量。双顺反子构建体高度表达了重链和轻链二者，产生了高水平的功能性⑶P870抗TNFFab。当重链定位在轻链之前时CDP870抗TNF表达大幅度增加。[0079]图7:在参照宿主(SAGX0085)和根据本发明一个实施方案的宿主(sAGX0276)中通过乳酸乳球菌的人三叶因子I(hTFFl)分泌的定量。(A)hTFFl表达模块的概述图。菌株SAGX0085携带单顺反子表达构建体，其中PhllA启动子驱动分泌前导物-hTFFl融合物(SS::hTFFl)的表达，所述构建体嵌在乳酸乳球菌MG1363染色体中的thyA基因座处。SAGX0276中的双顺反子构建体由gapB与SS::hTFFl通过rpmD基因间区域的转录偶联组成。该构建体位于乳酸乳球菌MG1363染色体上gapB基因的天然位置处。(B)在多种菌株的上清液中检测到的hTFFl的水平。分别指示这些菌株上清液中的人hTFFl水平的柱下面标示出菌株代码(SAGX0085和SAGX0276)。数据表明携带双顺反子构建体的sAGX0276产生hTFFl的水平优于具有单顺反子构建体的SAGX0085。[0080]图8:屎肠球菌菌株LMG15709对数期结束培养物的细胞蛋白质的考马斯亮蓝染色。主要的蛋白质带标示为I至12。[0081]图9:根据本发明一个实施方案的多顺反子(双顺反子、双重顺反子)构建体的图示，其中基因X表示内源基因。表达构建体旨在用于由大肠杆菌uidA基因表达(6-葡萄糖醛酸酶，其在这里充当示例性外源基因。Gap和eno是代表性的“第一”内源基因。[0082]图10:在参照宿主(单顺反子:PhllA>>uidA,sAGX0090)中和包含根据本发明一个实施方案的多顺反子(双顺反子)构建体(如图9所构造)的宿主(内源基因X>>rpmD>>uidA)中的相对P-葡萄糖醛酸酶(CTS)活性。在该实施例中，内源基因X是gapB和eno。在该实施例中，rpmD基因间区域提供了内源基因与外源基因的转录偶联。外源大肠杆菌uidA基因编码3-葡萄糖醛酸酶。所有的表达构建体均嵌在细菌染色体中。单顺反子构建体存在于thyA基因座中，双顺反子构建体嵌在基因X的天然位置处。数据表明所有的双顺反子构建体具有优于单顺反子PhllA>>uidA构建体的P-半乳糖苷酶活性。[0083]图11:在参照宿主(SAGX0270)和根据本发明一个实施方案的宿主(sAGX0279)中通过屎肠球菌的人白细胞介素10(hIL-10)分泌的定量。(A)hIL-10表达模块的概述图。SAGX0279中的双顺反子表达构建体由内源gap与SS::hIL10通过rpmD基因间区域的转录偶联组成。(B)在多种菌株的上清液中检测到的hIL-10水平。[0084]图12:在参照宿主(SAGX0270)和根据本发明一个实施方案的宿主(sAGX0317)中通过屎肠球菌的人白细胞介素27(hIL-27)分泌的定量。(A)hIL-27表达模块的概述图。SAGX0317中的双顺反子表达构建体由内源gap与SS::hIL27通过rpmD基因间区域的转录偶联组成。(B)在多种菌株的上清液中检测到的hIL-27水平。[0085]图13:屎肠球菌中的CDP870抗TNFFab表达。(A)将与usp45分泌前导物编码序列融合的⑶P870轻链和重链(SS::⑶P870VHCHl和SS::⑶P870VLCL)作为第二和第三顺反子插入gap(sAGX0278)的下游。为了避免遗传不稳定，轻链与重链基因通过来自乳酸乳球菌(LL)的在rpmD前面的基因间区域偶联，而来自屎肠球菌(EF)的rpmD用于偶联gap与重链基因。(B)粗制培养物上清液中抗人TNF活性的定量。双顺反子构建体高度表达了重链和轻链二者，产生了高水平的功能性⑶P870抗TNFFab。[0086]图14:产生抗hTNF之乳酸乳球菌(sAGX0220)在A20?小鼠中对hTNF诱导毒性和炎性细胞因子产生的作用，(a)用载剂、SAGX0220或MG1363将A20IEG_K°小鼠(n=5/组)预处理I小时后注射2iig(左图)和6iig(右图)重组hTNF，并且随时间追踪体温。向一组A20iE_小鼠注射类克(Remicade)后注射6ughTNF。(b)注射2yghTNF5小时后回肠、近端结肠和血清中的MCP-1水平。(c)注射2iighTNF5小时后回肠匀浆中的KC和IL-6水平。⑷注射6iighTNF5小时后回肠、近端结肠和血清中的MCP-1水平。(e)注射6yghTNF5小时后回肠匀浆中的KC和IL-6水平。误差线表示SEM。*，p<0.05。[0087]图15:根据本发明一个实施方案的菌株中的⑶P870产生。(A)整合在usp45基因座、enoA基因座或gapB基因座中的CDP870重链和轻链。(B)表明在根据本发明一个实施方案的不同菌株中⑶P870表达的Western印迹分析。(C)和(D)表明在根据本发明一个实施方案的不同菌株中CDP870表达的ELISA分析。(E)根据本发明一个实施方案的不同菌株的TNF中和活性。[0088]图16:与用野生型乳酸乳球菌菌株处理的小鼠和用Cimzia处理的小鼠相比，患有诱导型TNBS结肠炎的Tgl278小鼠用根据本发明一个实施方案的菌株(分泌抗hTNF的乳酸乳球菌菌株SAGX0309)处`理后的存活。[0089]图17:与用野生型乳酸乳球菌菌株处理的小鼠和用Cimzia处理的小鼠相比，患有诱导型TNBS结肠炎的Tgl278小鼠用根据本发明一个实施方案的菌株(分泌抗hTNF的乳酸乳球菌菌株SAGX0309)处理后的体重演变。上图:绝对体重(g);下图:相对于初始体重的体重(%)。[0090]图18:与用野生型乳酸乳球菌菌株处理的小鼠和用Cimzia处理的小鼠相比，患有诱导型TNBS结肠炎的Tgl278小鼠用根据本发明一个实施方案的菌株(分泌抗hTNF的乳酸乳球菌菌株SAGX0309)处理后结肠组织的组织学评分。平均值示于条上。示出每组的存活率。[0091]图19:与健康小鼠、用野生型乳酸乳球菌菌株处理的小鼠和用Cimzia处理的小鼠相比，患有诱导型TNBS结肠炎的Tgl278小鼠用根据本发明一个实施方案的菌株(分泌抗hTNF的乳酸乳球菌菌株SAGX0309)处理后的促炎性细胞因子分泌。(A)、(B)和(C)分别表不远端结肠中的mIL6、mKC和mMCPl水平，以pg/mg为单位。[0092]发明详述[0093]除非上下文另有清楚规定，否则本文未使用数量词限定时包括单数和复数指示物二者。[0094]本文使用的术语“包含”和“含有”与“包括”同义，并且是包括性或开放式的，并且不排除另外的未叙述的成员、要素或方法步骤。应理解，本文使用的术语“包含”和“含有”包括术语“由……组成”以及术语“基本由……组成”。[0095]通过端点叙述的数值范围包括包括在各个范围内的所有数字和部分，以及所叙述的端点。[0096]本文使用的术语“约”当涉及可测量值例如参数、量、时距等时，意指涵盖给定值的+/-20%或更小，优选+/-10%或更小，更优选+/-5%或更小并且又更优选+/-1%或更小的变化，其程度为这些变化适用于在所公开的本发明中执行。应理解修饰词“约”涉及的值自身也是具体的，并优选是公开的。[0097]虽然术语“一或更多”或“至少一”，例如一组成员的一个或更多个或至少一个成员自身通过进一步举例变得清楚，但是术语尤其涵盖涉及所述成员的任意一个或者所述成员的任意两个或更多个，例如，所述成员的任意>3、>4、>5、>6或>7等，并且多至所有的所述成员。[0098]本说明书引用的所有参考文献都通过引用整体并入本文。特别地，本文所具体引用的所有参考文献的教导通过引用并入本文。[0099]除非另有定义，否则用于公开本发明的所有术语，包括技术术语和科学术语，具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的意思。通过进一步的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。[0100]在下文中，更详细地定义了本发明的不同方面。除非明确指明有矛盾，否则如此定义的每个方面可与任意其他的一个或更多个方面组合。特别地，指示为优选的或有利的的任意特性可与指示为优选的或有利的的任意其他任意特性组合。[0101]贯穿本说明书，提及“一个实施方案”意指关于所述实施方案所描述的具体特性、结构或特征包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书在不同地方短语“在一个实施方案中”的出现不一定都涉及相同的实施方案，而是可能涉及相同的实施方案。此外，如由本公开对于本领域技术人员显而易见的，在一个或更多个实施方案中，可以以任意合适方式组合具体特性、结构或特征。此外，如本领域技术人员所理解的，虽然本文所述的一些实施方案包括包括在另一些实施方案中的一些特性而不包括其另一些特征，但是不同实施方案的特性的组合意味着在本发明的范围内，并且构成不同的实施方案。例如，在所附权利要求中，可以以任意组合使用所要求保护的实施方案中的任意一个。[0102]在以下的本发明详述中，参照构成本发明一部分并且其中仅通过阐明本发明可实施的具体实施方案示出的附图。应理解，可利用另一些实施方案并且可作出结构或逻辑变化而不偏离本发明的范围。因此，以下的详细描述不应视为限制意义，并且本发明的范围由所附权利要求书限定。[0103]列出重组DNA技术一般原理的标准参考书包括MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版，第1-3卷,Sambrook等编，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989；CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等编，GreenePublishingandffiley-1nterscience,NewYork,1992(定期更新)("Ausubel等.1992");Innis等,PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications,AcademicPress:SanDiego,1990。例如在Davis,B.D.等，Microbiology,第3版，Harper&Row,publishers,Philadelphia,Pa.(1980)中列出了微生物学的一般原则。[0104]如所指出的，本发明的一个方面涉及包含与一个或更多个外源基因转录或翻译偶联的内源基因的革兰氏阳性菌。优选地，一个或更多个外源基因在内源基因的下游(即，在3’末端)转录或翻译偶联。一个相关方面提供了包含多顺反子表达单元的革兰氏阳性菌，所述多顺反子表达单元包含内源基因和一个或更多个外源基因。优选地，多顺反子表达单元连续地包含一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因。另一个方面提供了包含多顺反子表达单元的重组核酸，所述多顺反子表达单元包含与一个或更多个对革兰氏阳性菌外源的基因转录或翻译偶联的对所述革兰氏阳性菌内源的基因。优选地，一个或更多个外源基因在内源基因的下游(即，在3，末端)转录或翻译偶联。[0105]优选地，一个或更多个外源基因是多顺反子表达单元的最3’基因，即，一个或更多个外源基因是多顺反子表达单元的最后的或最下游基因。例如，如果内源基因是单顺反子，则一个或更多个外源基因位于所述基因开放阅读框之后或下游(即，3’末端)，并且与其转录偶联。类似地，如果内源基因自身是多顺反子的，例如操纵子(的一部分)，则一个或更多个外源基因位于内源多顺反子基因最后(即，最下游或最3’)的内源基因之后或下游(即，3’末端)。[0106]最优选地，贯穿本说明书，本文所提及的内源基因是单顺反子。因此，内源基因优选地不构成内源操纵子的一部分。[0107]优选地，本文所述的多顺反子表达单元的表达通过可以是或可展现出以下特征的一种或更多种的启动子来实现:组成型启动子、中心代谢基因启动子、必需基因启动子、强启动子、管家基因启动子、核糖体基因启动子、糖酵解基因启动子。最优选地，启动子是组成型启动子。[0108]本文使用的术语“革兰氏阳性菌”具有其在本领域中已知的普通意思。对于进一步的指导，革兰氏阳性菌可通过革兰氏染色为保留结晶紫染色来鉴定。[0109]在一个优选实施方案中，根据本发明的革兰氏阳性菌是非致病性的，即其在施用于目的对象时不造成伤害或不引起`有害作用。[0110]优选地，根据本发明的革兰氏阳性菌是乳酸菌(LAB)，包括但不限于乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、气球菌属(Aerococcus)、肉食杆菌属(Carnobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、酒球菌属(Oenococcus)、芽抱乳杆菌属(Sporolactobacillus)、四体球菌属(Tetragenococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)和魏斯氏菌属(Weisella)。更优选地，LAB是乳球菌物种例如但不限于乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)、Lactococcuspiscium、植物乳球菌(Lactococcuspiantarum)和棉子糖乳球菌(Lactococcusraffinolactis)及其任意亚种和菌株。最优选地，乳球菌物种是乳酸乳球菌及其任意亚种和菌株，例如但不限于乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcuslactisssp.cremoris)、乳酸乳球菌霍氏亚种(Lactococcuslactisssp.hordniae)、乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcuslactisssp.lactis)、乳酸乳球菌亚种双乙酸乳酸变种(Lactococcuslactisssp.bv.diacetylactis)。在本发明的另一些优选实施方案中，乳酸乳球菌是乳酸乳球菌乳脂亚种或乳酸乳球菌乳酸亚种，更优选是乳酸乳球菌乳脂亚种，并且涵盖其任意菌株，例如，乳酸乳球菌乳脂亚种SKl1、乳酸乳球菌乳脂亚种MG1363或乳酸乳球菌乳酸亚种IL1403。在另一个优选实施方案中，LAB是肠球菌物种优选粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)及其任意亚种和菌株，例如但不限于屎肠球菌菌株LMG15709。[0111]在另一个优选实施方案中，根据本发明的革兰氏阳性菌是双歧杆菌。[0112]双歧杆菌是革兰氏阳性的，非运动性的，通常分支的厌氧细菌的属。本文使用的双歧杆菌可包括青春双歧杆菌(B.adolescentis)、有角双歧杆菌(B.angulatum)、动物双歧杆菌(B.animalis)、星形双歧杆菌(B.asteroides)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)、波恩双歧杆菌(B.bourn)、短双歧杆菌(B.breve)、链状双歧杆菌(B.catenulatum)、小猪双歧杆菌(B.choerinum)、棒状双歧杆菌(B.coryneforme)、兔双歧杆菌(B.cuniculi)、B.denticolens、齿双歧杆菌(B.dentium)、嘉利肯双歧杆菌(B.galIicum)、鸡双歧杆菌(B.galIinarum)、印度双歧杆菌(B.1ndicum)、婴儿双歧杆菌(B.1nfantis)、B.1nopinatum、乳双歧杆菌(B.lactis)、长双歧杆菌(B.1ongum)、巨大双歧杆菌(B.magnum)、瘤胃双歧杆菌(B.merycicum)、微小双岐杆菌(B.minimum)、假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum)、假长双歧杆菌(B.pseudolongum)、小鸡双歧杆菌(B.pul1rum)、反会双岐杆菌(B.ruminantium)、沙库来双岐杆菌(B.saeculare)、沙布提双岐杆菌(B.subtile)、猪双歧杆菌(B.suis)、热嗜酸性双岐杆菌(B.thermacidophilum)、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)。优选地，双歧杆菌是青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌。应理解双歧杆菌的所有亚种和菌株也包括在内。[0113]如本文在内源和外源基因环境下使用的术语“连续”指多核酸、载体或染色体中各基因的5’至3’顺序。例如，连续地包含一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因的多顺反子表达单元是指其中一个或更多个内源基因定位在一个或更多个外源基因上游的单元。因此，一个或更多个外源基因定位在一个或更多个内源基因的3’末端之后。应理解，如本文所述的连续偶联或排序不一定意味着内源基因与外源基因直接偶联。在内源基因与外源基因之间可存在另外的序列。作为一个实例，如本文另外定义的基因间区域可存在于连续的内源基因与外源基因之间(即，内源基因的下游或3’与外源基因的上游或5’)。本文使用的术语“内源基因”、“内源启动子”、“内源基因间区域”、“内源核糖体结合位点”分别指革兰氏阳性菌天然的或者在`自然中可在革兰氏阳性菌中发现的基因、启动子、基因间区域或核糖体结合位点。因此，术语内源基因、启动子、基因间区域或核糖体结合位点涵盖革兰氏阳性菌不同属、种、亚种或菌株之间直系同源(orthologous)的基因、启动子、基因间区域和核糖体结合位点。特别地，认为分离自革兰氏阳性菌一个属、种、亚种或菌株的基因、启动子、基因间区域或核糖体结合位点对于革兰氏阳性菌所有的其他属、种、亚种或菌株是内源的(不考虑可能的多核酸序列差异)，前提条件是革兰氏阳性菌的所述其他属、种、亚种或菌株也天然地包含这样的基因、启动子、基因间区域或核糖体结合位点。因此，这这种相异但天然存在的基因、启动子、基因间区域或核糖体结合位点序列被认为是内源的。例如并非限制，分离自乳酸乳球菌乳酸亚种的编码烯醇酶的基因enoA也被认为对于乳酸乳球菌乳脂亚种是内源的。[0114]但是，优选地，如本文所意图的革兰氏阳性菌给定属、种、亚种或菌株的“内源”基因、启动子或基因间区域可分别指在革兰氏阳性菌同一属、种、亚种或菌株中天然的(即，对其为自然存在的或自身的)基因、启动子或基因间区域。例如并非限制，分离自乳酸乳球菌乳酸亚种的编码烯醇酶的基因enoA可优选地被认为对于乳酸乳球菌乳酸亚种是“内源”的，而对于乳酸乳球菌乳脂亚种不是。[0115]本文使用的术语“外源基因”是指对于革兰氏阳性菌不是天然的或者不能在自然中在革兰氏阳性菌中发现的基因。术语外源基因与术语异源基因同义。外源基因可以是全长基因或者可替代地是截短基因或基因片段。例如，外源基因可来源于病毒，其他原核生物例如革兰氏阴性菌，或可替代地并且优选地可来源于真核生物，例如植物、动物、优选哺乳动物，最优选人。可替代地，外源基因可以是完全或部分合成或人造的，即其完全或部分不天然存在。此外，外源基因可以是嵌合的，即其可由来源于不同物种的序列或天然序列和合成或人造序列的组合构成。还涵盖了由革兰氏阳性菌序列和对革兰氏阳性菌外源的序列构成的嵌合序列，例如，编码由革兰氏阳性菌分泌信号肽和外源蛋白质构成的融合蛋白的序列。[0116]因为真核基因在大多数情况下在外显子旁包含内含子，所以本领域技术人员应理解，根据本发明，外源基因的任何提及涉及这种基因的不含内含子的开放阅读框，即这种基因的蛋白质编码序列。术语“开放阅读框”或ORF指一连串的编码核苷酸三联体，以翻译起始密码子(例如，ATG或GTG)开始并且以翻译终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)结束并且编码单一多肽。[0117]原核基因(特别是来自革兰氏阳性菌的基因)不包含内含子。因此，原核基因的编码序列或开放阅读框对应于位于原核基因组(特别是细菌染色体)上的一连串编码核苷酸三联体，其以翻译起始密码子开始并以翻译终止密码子结束。[0118]因此，在一个方面中，本发明涉及包含与一个或更多个外源开放阅读框或编码序列转录或翻译偶联的内源开放阅读框或编码序列的革兰氏阳性菌。[0119]本领域技术人员应理解，虽然术语“基因”一般来说可以指对应于遗传单元的基因组序列的定位区(locatableregion),其与转录和翻译调节区例如普里布诺盒(pribnowbox)、夏因-达尔加诺序列、操纵基因、终止子、转录区和/或其他功能性序列区缔合，除非另有明确说明，否则在本文所述的外源序列环境中术语“基因”的任意提及优选地指所述基因的编码序列或开放阅读框。在本文所述的内源序列环境中术语“基因”的任意提及可以指对应于遗传单元的基因组序列的定位区，其与调节区、转录区和或其他功能性序列区缔合，但是可替代地，也可指所述基因的编码序列或开放阅读框。[0120]本文使用的术语“翻译偶联”与“翻译连接”同义。这些术语本质上与多顺反子表达系统或单元有关。当共有的调节元件(例如特别是共有的启动子)实现两个或更多个基因转录为编码所述两个或更多个基因、开放阅读框或编码序列的单一mRNA，然后可翻译为两个或更多个单独多肽序列时，所述两个或更多个基因、开放阅读框或编码序列认为是翻译偶联的。本领域技术人员应理解，细菌操纵子是其中两个或更多个基因翻译或转录偶联的天然多顺反子表达系统或单元。根据本发明，转录偶联是翻译偶联的基础。[0121]因此，在一个方面中，本发明涉及包含与一个或更多个外源基因、开放阅读框或编码序列转录偶联的内源基因的革兰氏阳性菌。优选地，革兰氏阳性菌连续地包含内源基因与一个或更多个外源基因、开放阅读框或编码序列转录偶联。本文使用的术语“转录偶联”与“转录连接”同义。这些术语一般是指包含共同转录为单一mRNA并且可翻译为两条或更多条单独多肽的两个或更多个开放阅读框或编码序列的多核酸序列。[0122]在另一些方面中，本发明涉及包含多顺反子表达单元的革兰氏阳性菌或重组核酸，所述多顺反子表达单元包含内源基因和一个或更多个外源基因、开放阅读框或编码序列。[0123]本文使用的术语“多顺反子表达单元”或“多顺反子表达系统”是指其中两个或更多个基因的表达受共同调节机制(例如启动子、操纵基因等)调节的单元。本文使用的术语多顺反子表达单元与多个顺反子表达单元同义。多顺反子表达单元的实例是但不限于双顺反子表达单元、三顺反子表达单元、四顺反子表达单元。包含编码单独表达产物例如蛋白质、多肽和/或肽的两个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)开放阅读框或编码区的任何mRNA涵盖在术语多顺反子中。[0124]在一个实施方案中，如本文所述翻译或转录偶联的一个或更多个内源基因与一个或更多个外源基因被对革兰氏阳性菌内源的启动子转录控制。在另一个实施方案中，如本文所述的多顺反子表达单元或系统被对革兰氏阳性菌内源的启动子转录控制。[0125]“启动子”一般意指核酸分子(优选DNA分子)上的RNA聚合酶与之结合并使转录开始的区域。启动子优选地但不一定定位在其控制转录的序列的上游，即5’。[0126]在另一个实施方案中，如本文所述翻译或转录偶联的一个或更多个内源基因与一个或更多个外源基因受所述一个或更多个内源基因(之一)的天然启动子转录控制。在另一个实施方案中，如本文所述的多顺反子表达单元或系统受包含在所述多顺反子表达系统或单元中的所述一个或更多个内源基因(之一)的天然启动子转录控制。在另一个实施方案中，如本文所述的多顺反子表达单元或系统与革兰氏阳性内源启动子可操作性连接。[0127]本文使用的术语“可操作性连接的”或“可操作性连接”是这样的连接，其中调节DNA序列与试图表达的DNA序列以这种方式连接以允许表达。例如，如果连接或结合允许或实现了所述基因的表达，则认为启动子与基因、开放阅读框或编码序列可操作性连接。在另一个实例中，如果连接或结合允许或`实现了至少3’基因的翻译，则认为5’和3’基因、顺反子、开放阅读框或编码序列在多顺反子表达单元中可操作性连接。[0128]例如，如果序列之间连接的性质不⑴导致引入移码突变，⑵干扰启动子指导开放阅读框转录的的能力或(3)干扰开放阅读框通过启动子区序列转录的能力，则认为DNA序列(例如，优选启动子和开放阅读框)可操作性连接。[0129]在一个示例性的优选实施方案中，启动子可定位在其与之可操作性连接的开放阅读框的上游，即5’。[0130]本领域技术人员应理解，启动子可与另外的天然调节序列或区域(例如操纵基因)缔合。表达所需的调节区的精确性质可随生物体而改变，但是一般应包含启动子区，在原核生物中包含启动子(指导RNA转录的开始)以及在转录为RNA时发出开始蛋白质合成信号的DNA序列二者。这样的区域通常包含参与转录和翻译开始的那些5’非编码序列，例如普里布诺盒(参见，TATA盒)、夏因-达尔加诺序列等。[0131]在另一个实施方案中，启动子是多顺反子表达单元中最5’(即，最上游)内源基因的天然启动子。[0132]本文使用的在启动子环境(或引申至涉及内源基因的基因表达)下的术语“组成型”是指允许其缔合基因连续转录的启动子。特别地，在这种启动子控制下一种或更多种缔合基因的转录不依赖于任何诱导物或其他调节信号而发生。[0133]本文使用的术语“管家基因”或“管家启动子”是指维持基础细胞功能所需的基因或基因的启动子。虽然一些管家基因以相对恒定的水平表达，但是其他管家基因可根据外部条件或实验条件改变。管家基因可例如参与代谢、基因表达(例如，基础转录机制)、信号转导，但是也可以是结构基因。[0134]本文使用的“糖酵解基因”或“糖酵解启动子”是指参与糖酵解途径的基因或基因的启动子，并且包括编码糖酵解酶的基因的启动子，特别是编码己糖激酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸果糖激酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶和丙酮酸激酶的基因的启动子。[0135]本文使用的“核糖体基因”或“核糖体启动子”是指核糖体基因的基因或启动子，包括编码核糖体蛋白质的基因以及转录为核糖体RNA的基因。优选地，其可以指核糖体蛋白质的基因或启动子。[0136]本文使用的“中心代谢基因”或“中心代谢启动子”或者可替代地“基础代谢基因”或“基础代谢启动子”是指参与关键代谢途径的基因或基因的启动子，并且包括参与糖酵解、戊糖-磷酸途径和三羧酸(TCA)循环的基因。[0137]本文使用的在基因环境(或引申至涉及这些基因的启动子)下的术语“必需”涉及这样的基因，其天然表达产物的不存在对于宿主是不利的(例如，特别是致死的)，或者可替代地改变、抑制或阻止正常生理或功能(例如，特别是增殖或生长)。应理解，本文使用的在基因或基因的启动子环境下的术语“必需”涉及组成型必需的，与条件性必需的是不同的。例如，几种革兰氏阳性菌(特别是乳酸菌例如乳球菌属)中的乳糖操纵子基因例如^-半乳糖苷酶基因当在包含乳糖作为主要或唯一碳源的培养基中培养细菌时可以是必需的，当在包含替代性碳源的培养基中培养细菌时这些基因则是非必需的。因此，如本文所意图的，这些基因仅是条件性必需的，而不是组成型必需的。[0138]在一个优选实施方案中，如本文所述的内源启动子和/或内源基因选自包含对应于以下乳球菌启动子和/或基因(更优选乳酸乳球菌乳脂亚种菌株MG1363启动子和/或基因)的革兰氏阳性菌启动子和/或基因的组或者由其组成的组:1)DNA指导的RNA聚合酶，亚基/160kD亚基(rpoC);2)DNA指导的RNA聚合酶，P亚基/140kD亚基(rpb2或rpoB);3)DNA结合铁蛋白样蛋白(氧化性损伤保护蛋白)(dps)；4)丙酮酸激酶(pyk)；5)谷氨酰基和谷氨酰胺酰基tRNA合成酶(glnS或gltX)；6)烯醇酶(eno)；7)谷氨酰胺合成酶(glnA);8)HTH型转录调节子(glnR);9)Xaa-His二肽酶(argE或pepV)；10)FOFl型ATP合酶P亚基(ATP合酶FlP亚基)(atpD);11)3-磷酸甘油酸激酶(pgk)；12)甘油醒-3-磷酸脱氢酶/赤藓糖-4-磷酸脱氢酶(gapA或gapB)；13)乙酸激酶(ackA);14)3-氧酰基_(酰基-载体-蛋白)合酶(fabB或fabF)；15)3_氧酰基_(酰基-载体-蛋白)还原酶(fabG);16)DNA指导的RNA聚合酶，a亚基/40kD亚基(rpoA);17)Xaa-Pro氨基肽酶(pepP)；18)果糖/塔格糖二磷酸醒缩酶(tbp或fbaA)；19)核糖体蛋白S4(rpsD)；20)超氧化物歧化酶(sodA)；21)核糖体蛋白S12(rpsL)和核糖体蛋白S7(rpsG)；22)核糖体蛋白L18(rplR)和核糖体蛋白S5(rpsE)和核糖体蛋白L30/L7E(rpmD);23)S_核糖基高半胱氨酸裂合酶(S-ribosylhomocysteinelyase)(IuxS)；24)核糖体蛋白L19(rplS)；25)核糖体蛋白Sll(rpsK)；26)核糖体蛋白LlO(rplJ)；27)核糖体蛋白L7/L12(rplL)；28)细菌类核DNA结合蛋白/DNA结合蛋白HU(hup或hllA);29)50S核糖体蛋白L28(rpmB)；30)磷酸转移酶系统纤维二糖特异性组分IIB(lace或ptcB);31)R)F1型ATP合酶a亚基(atpA)；32)ABC型糖转运系统(ATP酶组分)(malK或msmK)；33)乙偶姻脱氢酶复合物El组分a亚基(acoA或pdhA)；34)细胞分裂蛋白(difIVA或ftsA);35)UDP-吡喃半乳糖变位酶(gif);36)谷氨酰基氨基肽酶(frvX或pepA)；37)预测的脱氢酶相关蛋白(mviM或llmg_0272)；38)核糖体蛋白S2(rpsB)；39)翻译起始因子3(IF_3)(infC)；40)核糖体蛋白L4(rplD)和核糖体蛋白L23(rplff)和核糖体蛋白L2(rplB)；41)EMAP结构域(ydjD)；42)转录延伸因子(greA);43)ATP依赖性Clp蛋白酶的蛋白酶亚基(clpP)；44)核糖体蛋白L15(rpl0)；45)核糖体蛋白Lll(rplK)；46)核糖体蛋白S8(rpsH)；47)核糖体蛋白L2l(rplU)；48)核糖体蛋白S13(rpsM)；49)核糖体蛋白S19(rpsS)和核糖体蛋白L22(rplU或rplV)和核糖体蛋白L16(rplP)和核糖体蛋白L14(rplN)；50)核糖体蛋白SlO(rpsJ)；51)共伴侣蛋白(co-chaperonin)GroES(HsplO)(cpnlO)；52)核糖体蛋白L24(rplX)；53)假设蛋白LACR_0137(duf965)和54)分泌的45kDa蛋白(usp45)。优选地，内源启动子和/或内源基因选自包含enoA、usp45、gapB、pyk、rpmB和rplS的组或者由其组成的组。在例如TO2008/08411(通过引用并入本文)中公开了这些启动子及其序列，例如表1及其图1A至H。在一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中内源基因与一个或更多个外源基因受对革兰氏阳性菌而言内源的启动子、优选地通过选自所述革兰氏阳性菌的eno、usp45、gap、pyk、rpmB和rplS启动子的内源启动子转录控制。在另一个实施方案中，内源基因位于革兰氏阳性菌中其天然染色体基因座中。[0139]在一个优选实施方案中，所述一个或更多个外源基因、开放阅读框或编码序列与所述一个或更多个内源基因、开放阅读框或编码序列的3’末端翻译或转录偶联。因此，在一个实施方案中，本发明提供了包含多顺反子表达单元的革兰氏阳性菌，其中所述多顺反子表达单元包含一个或更多个5’内源基因和一个或更多个3’外源基因。优选地，多顺反子表达单元的最5’基因是内源基因。例如并非限制，多顺反子表达单元可从5’末端至3’末端包含内源基因、然后是一个或更多个内源基因、然后是一个或更多个外源基因，或者基本由其组成。可替代地但非限制，多顺反子表达单元可由5’末端至3’末端包含内源基因、然后是一个或更多个外源基因，或者基本由其组成。可替代地，多顺反子表达单元可由5’末端至3’末端包含内源基因、然后是一个或更多个外源基因，然后是一个或更多个内源基因，或者基本由其组成。[0140]如本文所述的翻译偶联或转录偶联的一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因或者多顺反子表达单元或系统可包含在复制子中，所述复制子允许在如本文所述的根据本发明之革兰氏阳性菌中维持和/或增殖并表达内源基因和外源基因。[0141]在一个实施方案中，如本文所述的翻译偶联或转录偶联的一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因(任选地包含如本说明书其他地方所述的(内源)启动子)或者多顺反子表达单元或系统可包含在载体中，优选允许在革兰氏阳性菌中表达的表达载体中。因此，本发明还涉及包含如本文所述的重组核酸的载体。[0142]本文使用的“载体”是指在其中可插入和克隆(即，增殖)核酸片段的核酸分子，通常是DNA。因此，载体通常包含一个或更多个独特的限制位点，并且可以能够在限定宿主或运载生物体中自主复制使得克隆序列可再生。根据情况，载体可包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体、噬菌体源载体、PAC、BAC、线性核酸(例如线性DNA)等(参见，例如Sambrook等，1989;Ausubel1992)。[0143]在具体载体(例如质粒)的选择中的重要因素尤其包括:包含载体的受体细胞可从不包含载体的那些受体细胞中被识别并选择的容易程度；具体宿主中期望的载体的拷贝数；以及是否期望能够使载体在不同物种的宿主细胞之间“穿梭”。优选的原核载体包括质粒，例如能够在大肠杆菌中复制的那些(例如，pBR322、ColEl，pSClOl,puC19等)。这样的质粒在例如Sambrook等，1989；Ausubel1992中进行了描述。特别优选的载体可以是能够在大肠杆菌(或其他革兰氏阴性菌)中以及在另一种目的宿主细胞例如革兰氏阳性菌(乳酸菌，优选乳球菌，更优选乳酸乳球菌)中复制的那些载体(参见，例如Kok等.Appl.Environ.Microbiol.，1984,vol.48(4)，726-31)。另一些优选的载体可以是能够在一种或更多种革兰氏阳性菌而不能在革兰氏阴性菌中复制和/或穿梭的那些载体。在一个优选实施方案中，载体是如Steidler等Appl.Environ.Microbiol.，1995,vol.61⑷,1627-1629(通过引用具体地并入本文)所述的pTINX。[0144]在另一个实施方案中，可将如本文所述的翻译偶联或转录偶联的一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因或者多顺反子表达单元或系统整合在革兰氏阳性菌基因组或染色体中，用于得到重组革兰氏阳性菌和随机以及同源重组的方法在本领域中是公知的，以及用于实现重组的载体也是公知的。通过进一步的指导，例如在Steidler等(2003,NatureBiotechnology，21:785-789)、Law等(1995,JBacteriol,177(24):7011-7018)、Leenhouts等(1998，MethodsinCellScience,20:35-50)和W02004/046346中描述了这样的方法和载体，其通过引用整体并入本文。优选地，通过经同源重组将需要序列定点整合在细菌染色体中来产生或引入如本文所述的多顺反子表达单元。[0145]在一个实施方案中，重组载体包含如本说明书其他地方所述的内源启动子和任选的另外的调节序列，以及如本文所述的多顺反子表达单元。优选地，内源启动子与多顺反子表达单元可操作性连接。可在预定基因座处实现同源重组。这样的系统是高度模块化的(modular)，并且允许启动子、调节序列、内源基因和外源基因的单独选择和组合，以及插入位点的选择。[0146]在另一个实施方案中，根据本发明的革兰氏阳性菌在其天然基因座处(即，在细菌染色体上其天然基因组环境中)包含`如本说明书其他地方所述的内源启动子，其与包含一个或更多个内源基因、开放阅读框或编码序列和一个或更多个外源基因、开放阅读框或编码序列的多顺反子表达单元可操作性连接。可操作性连接可通过包含启动子的基因座与包含多顺反子表达单元(两侧是构造成实现所述同源重组的序列)的重组载体之间的同源重组来实现。因此，在一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的革兰氏阳性菌，其中内源基因与一个或更多个外源基因转录偶联，这通过将一个或更多个外源基因染色体整合至所述基因座，优选地通过将一个或更多个外源基因染色体整合至所述基因座的内源基因3’来进行。[0147]可选择载体设计使得仅内源基因和/或外源基因的开放阅读框或编码序列整合到目的染色体基因座中。在这种情况下，通过启动子的天然基因组基因座提供了实现转录和/或翻译的启动子自身旁边的调节序列(例如操纵基因、转录起始位点、夏因-达尔加诺序列、终止子序列等)。可替代地，可在包含多顺反子表达单元的重组载体上提供这样的序列。在后一种情况下，根据需要，与内源启动子缔合的天然调节序列可在同源重组期间移除。本文所述的系统关于内源基因、外源基因和可能的调节序列的单独选择是模块化的，但是其预定了所选择启动子的内源基因座处的插入位点。[0148]在另一个实施方案中，根据本发明的革兰氏阳性菌在其天然基因座处(即，在细菌染色体上其天然基因组环境中)包含均在本说明书其他地方描述的内源启动子和一个或更多个内源基因，所述内源启动子和一个或更多个内源基因与一个或更多个外源基因、开放阅读框或编码序列可操作性连接，使得实现了一个或更多个内源基因和一个或更多个外源基因的多顺反子表达。在该系统中，内源启动子和一个或更多个内源基因，以及实现所述一个或更多个内源基因转录和翻译的调节序列存在于其天然基因座中。这些的系统最大程度地保留了革兰氏阳性菌的天然特征。[0149]多顺反子表达单元包含至少两个基因、开放阅读框或编码序列。为了使所有基因开始翻译，这些基因的每一个一般都与实现核糖体结合的序列(即，核糖体结合位点)缔合。在原核生物中，核糖体结合位点表示为夏因-达尔加诺(SD)序列，其具有一般的共有序列5'-AGGAGG-3'。SD序列平均位于翻译开始密码子或起始密码子上游(即，5’)的约8个碱基对处。根据5’基因终止密码子与3’基因起始密码子之间的距离(以核苷酸的量计)，SD序列可通常定位在以下位置处:1)如果距离至少是SD序列的大小则在两种基因的基因间区域中；2)在5’基因与3’基因之间距离较小的情况下，在两种基因之间的基因间区域中，但是与5’基因终止密码子重叠；或者3)如果例如5’基因的终止密码子与3’基因的起始密码子非常接近或重叠，则在5’基因的终止密码子的5’。[0150]在一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其还包含一条或更多条多核酸序列，所述一条或更多条多核酸序列包含构造成实现一个或更多个外源基因翻译的核糖体结合位点。在另一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其还包含构造成实现一个或更多个外源基因翻译的一个或更多个核糖体结合位点。在另一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中所述一个或更多个内源基因与所述一个或更多个外源基因通过核糖体结合位点转录或翻译偶联。在又一个实施方案中，本发明涉及包含如本文所述的多顺反子表达单元的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中任意的5’基因与3’基因通过包含核糖体结合位点或(基本)由核糖体结合位点组成的多核酸序列偶联。在一个优选实施方案中，所述核糖体结合位点对于革兰氏阳性菌是内源的。在另一个优选实施方案中，所述核糖体结合位点包含在基因间区域中，优选包含在操纵子基因间区域中。[0151]在另一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其还包含一条或更多条多核酸序列，所述一条或更多条多核酸序列包含构造成实现一个或更多个外源基因翻译的基因间区域。在另一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其还包含构造成实现一个或更多个外源基因翻译的一个或基因间区域。在另一个实施方案中，本发明涉及如本文所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中所述一个或更多个内源基因与所述一个或更多个外源基因通过基因间区域转录或翻译偶联。在又一个实施方案中，本发明涉及包含如本文所述的多顺反子表达单元的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中任意的5’基因与3’基因通过包含基因间区域或由基因间区域组成的多核酸序列偶联。在一个优选实施方案中，所述基因间区域对于革兰氏阳性菌是内源的。在另一个优选实施方案中，所述基因间区域是操纵子基因间区域。[0152]本文使用的术语“基因间区域”与“基因间接头”或“基因间间隔物”同义。基因间区域定义为毗连(即，位于相同多核酸序列上的)基因、开放阅读框、顺反子或编码序列之间的多核酸序列。引申开来，基因间区域可包含通过所述基因间区域连接的5’基因的终止密码子和/或3’基因的起始密码子。本文定义的术语基因间区域特别地涉及多顺反子表达单元中毗连基因之间的基因间区域。例如，本文定义的基因间区域可存在于操纵子中的毗连基因之间。因此，在一个实施方案中，本文定义的基因间区域是操纵子基因间区域。[0153]在一个实施方案中，基因间区域、接头或间隔物选自包含以下基因间区域的组或由以下基因间区域组成的组:在革兰氏阳性菌rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE或rplN前面(即，在其5’，更特别地紧邻其5’)的基因间区域。在一个实施方案中，所述革兰氏阳性菌是乳酸菌，优选是乳球菌物种，更优选是乳酸乳球菌，及其任意亚种或菌株。在一个实施方案中，所述基因间区域涵盖rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE或rplN的起始密码子和/或其前面(即5’)基因的终止密码子。在一个优选实施方案中，本发明涉及如本文所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中内源基因与一个或更多个外源基因通过革兰氏阳性菌中有活性的一个或更多个基因间区域转录偶联，优选地其中一个或更多个基因间区域对于所述革兰氏阳性菌是内源的，更优选地其中内源基因间区域选自在rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplE和rplF前面的基因间区域。[0154]技术人员应理解，如果基因间区域涵盖5’终止密码子和/或3’起始密码子，则这些各密码子优选地不存在于通过所述基因间区域连接的基因中，从而避免可影响正确的翻译起始和/或终止的双起始密码子和/或终止密码子。用于鉴定基因间区域的方法在本领域是已知的。通过进一步的指导，基因间区域可例如基于预测操纵子和相关启动子及开放阅读框来鉴定，在本领域已知并且可使用用于其的大量软件。[0155]在另一个实施方案中，所述基因间区域序列选自包含SEQIDNO:1至7中任意一种的组或者基本由其组成的组或者由其组成的组:[0156]SEQIDNO:ITAATG[0157]SEQIDNO:2TAATCCATG[0158]SEQIDNO:3TAAGGAGGAAAAAATG[0159]SEQIDNO:4TAATAGAGGAGGAAAATCGTG[0160]SEQIDNO:5TAAGAAGGGAGATAAGTAAGAATG[0161]SEQIDNO:6TAAGGAAAGGGGTAATTAAACATG[0162]SEQIDNO:7TAAGCAAAACTAGGAGGAATATAGCATG。[0163]在另一个实施方案中，所述基因间区域选自包含以下序列的组或者基本由其组成的组或者由其组成的组:相对于SEQIDNO:1或SEQIDNO:2表现出一个错配或者一个核苷酸的缺失或插入的序列，相对于SEQIDNO:3或SEQIDNO:4表现出一个、两个或三个错配或者一个、两个或三个核苷酸的缺失或插入的序列，以及相对于SEQIDNO:5,SEQIDNO:6或SEQIDNO:7表现出一个、两个、三个或四个错配或者一个、两个、三个或四个核苷酸的缺失或插入的序列。[0164]SEQIDNO:1至7都包含5’终止密码子和3’起始密码子。SEQIDNO:1至7分别对应于在乳酸乳球菌乳脂亚种菌株MG1363(基因库登录号AM406671.1)的rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE或rplN前面的基因间区域。这些序列与乳酸乳球菌乳酸亚种菌株CV56(基因库登录号CP002365.1)、乳酸乳球菌乳脂亚种菌株NZ9000(基因库登录号CP002094.1)、乳酸乳球菌乳酸亚种菌KF147(基因库登录号CP001834.1)、乳酸乳球菌乳酸亚种菌IL1403(基因库登录号AE005176.1)和乳酸乳球菌乳脂亚种菌株SKll(基因库登录号CP000425.1)等的对应序列相同。[0165]在另一个实施方案中，基因间区域、接头或间隔物选自包含以下基因间区域或由以下基因间区域组成的组:在革兰氏阳性菌的rplP、rpmD、rplM、rpsE、rplE或rplF前面(即，在其5’，更特别地紧邻其5’)的基因间区域。在一个实施方案中，所述革兰氏阳性菌是乳酸菌，优选是肠球菌物种，更优选是屎肠球菌，及其任意亚种或菌株。在一个实施方案中，所述基因间区域涵盖rplP、rpmD、rplM、rpsE、rplE或rplF的起始密码子和/或其前面(即，5’)基因的终止密码子。技术人员应理解，如果基因间区域涵盖5’终止密码子和/或3’起始密码子，则这些各密码子优选地不存在于通过所述基因间区域连接的基因中，从而避免可影响正确的翻译起始和/或终止的双起始密码子和/或终止密码子。用于鉴定基因间区域的方法在本领域是已知的。通过进一步的指导，基因间区域可例如基于预测操纵子和相关启动子及开放阅读框来鉴定，在本领域已知并且可使用用于其的大量软件。[0166]在另一个实施方案中，所述基因间区域序列选自包含SEQIDNO:8至13中任意一种的组或者基本由其组成的组或者由其组成的组:[0167]SEQIDNO:8TAATC[0168]SEQIDNO:9TAAGGAGGACAACAATA[0169]SEQIDNO:10TAATAGGAGGGAATTTCA[0170]SEQIDNO:11TTAGAAGAAGGAGGAATACCATTC[0171]SEQIDNO:12`TAAAAGTTTAAGGAAGGAGGGTCTTACTGA[0172]SEQIDNO:13TAATCAAGTAGAATCTACAAGGAGGTGTCTTTAA。[0173]在另一个实施方案中，所述基因间区域选自包含以下序列的组或者基本由其组成的组或者由其组成的组:相对于SEQIDNO:8表现出一个错配或者一个核苷酸的缺失或插入的序列，相对于SEQIDNO:9或SEQIDNO:10表现出一个、两个或三个错配或者一个、两个或三个核苷酸的缺失或插入的序列，以及相对于SEQIDNO=IUSEQIDN0:12或SEQIDNO:13表现出一个、两个、三个或四个错配或者一个、两个、三个或四个核苷酸的缺失或插入的序列。SEQIDNO:8至13分别对应于在屎肠球菌菌株LMG15709的rplP、rpmD、rplM、rpsE、rplE和rplF前面的基因间区域。[0174]在一个实施方案中，如本文所述的基因间区域(不包含任意之前的终止密码子并且不包含任意后续的起始密码子)可包含多于I个核苷酸或者由其组成，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个核苷酸，优选多于5个核苷酸，甚至更优选10个或更多个核苷酸。在另一个实施方案中，基因间区域可包含I至50个核苷酸，例如I至40个、I至30个、I至25个、I至20个、I至15个或I至10个，优选5至50个、5至40个、5至30个、5至25个、5至20个、5至15个或5至10个核苷酸，甚至更优选10至50个、10至40个、10至30个、10至25个、10至20个或10至15个核苷酸。[0175]表1和表2描述了如本文所述的包含多顺反子表达单元之革兰氏阳性菌的一些特别优选的实施方案，其中所述革兰氏阳性菌包含内源启动子，在其3’内源基因与如表1和2所述的基因间区域连接，在其3’一个或更多个外源基因、开放阅读框或编码序列与基因间区域连接。在一个优选实施方案中，表1和2所述的每个基因受其天然启动子和任选的调节序列转录控制。在另一个优选实施方案中，所述多顺反子表达单元整合在细菌染色体中。在又一个优选实施方案中，所述内源启动子和/或内源基因存在于细菌基因组或染色体上其天然基因座处。优选地，起始密码子和终止密码子(如果存在的话)分别替换所述外源基因和所述内源基因的起始密码子和终止密码子。[0176]表1:示例性多顺反子表达单元可包含内源启动子>>内源基因>>基因间区域>>外源基因或者基本由其组成，其中所述内源基因和基因间区域选自以下组合。[0177]【权利要求】1.包含多顺反子表达单元的革兰氏阳性菌，所述多顺反子表达单元连续地包含内源基因和与所述一个或更多个内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个外源基因，其中所述一个或更多个外源基因是所述多顺反子表达单元的最3’基因。2.包含多顺反子表达单元的重组核酸，所述多顺反子表达单元连续地包含对革兰氏阳性菌而言内源的基因和与所述一个或更多个内源基因3’末端转录偶联的一个或更多个对所述革兰氏阳性菌而言外源的基因，其中所述一个或更多个外源基因是所述多顺反子表达单兀的最3’基因。3.根据权利要求1所述的革兰氏阳性菌或者根据权利要求2所述的重组核酸，其中所述一个或更多个外源基因编码产物，例如在对象中具有治疗性或预防性作用的蛋白质、多肽和/或肽，例如用于诱导免疫或免疫耐受的抗原、非致疫苗作用的治疗活性多肽、抗体或其功能性片段如Fab、融合蛋白或多聚体蛋白。4.根据权利要求1所述的革兰氏阳性菌或者根据权利要求2所述的重组核酸，其用作药物，优选用于将产物施用或递送至对象，所述革兰氏阳性菌或重组核酸中所述一个或更多个外源基因编码在所述对象中具有治疗性或预防性作用的所述产物例如蛋白质、多肽和/或肽，例如用于诱导免疫或免疫耐受的抗原、非致疫苗作用的治疗活性多肽、抗体或其功能性片段如Fab、融合蛋白或多聚体蛋白。5.根据权利要求1、3或4中任一项所述的革兰氏阳性菌或者根据权利要求2至4中任一项所述的重组核酸，其中所述内源基因和所述一个或更多个外源基因被对所述革兰氏阳性菌而言内源的启动子转录控制。6.根据权利要求5所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中所述启动子是必需基因启动子、组成型启动子、中心代谢基因启动子和/或管家基因启动子。7.根据权利要求5所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中所述启动子是核糖体基因启动子。8.根据权利要求5所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中所述启动子是糖酵解基因启动子。9.根据权利要求5所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中所述启动子选自所述革兰氏阳性菌的eno、usp45、gap、pyk、rpmB和rplS的启动子。10.根据权利要求1或3至9中任一项所述的革兰氏阳性菌，其中所述内源基因位于其在所述革兰氏阳性菌中的天然染色体基因座。11.根据权利要求10所述的革兰氏阳性菌，其中通过将所述一个或更多个外源基因染色体整合至所述基因座、优选通过将所述一个或更多个外源基因染色体整合至所述基因座中所述内源基因的3’来将所述内源基因与所述一个或更多个外源基因转录偶联。12.根据权利要求1或3至11中任一项所述的革兰氏阳性菌或者根据权利要求2至9中任一项所述的重组核酸，其中所述内源基因与所述一个或更多个外源基因通过在所述革兰氏阳性菌中有活性的一个或更多个基因间区域转录偶联，优选地，其中所述一个或更多个基因间区域对于所述革兰氏阳性菌而言是内源的。13.根据权利要求12所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中所述基因间区域选自在rplff>rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplE和rplF之前的基因间区域。14.重组核酸，其包含与对革兰氏阳性菌而言外源的基因可操作连接的在所述革兰氏阳性菌中有活性的基因间区域，优选地，其中所述基因间区域是革兰氏阳性菌的内源基因间区域。15.根据权利要求14所述的重组核酸,其中所述基因间区域选自在rplW、rplP、rpmD、rplB、rpsG、rpsE、rplN、rplM、rplE和rplF之前的基因间区域。16.根据权利要求1或3至13中任一项所述的革兰氏阳性菌或者根据权利要求2至9或12至15中任一项所述的重组核酸，其中一个外源基因编码抗体的轻链(')或其功能性片段，并且另一个外源基因编码所述抗体的重链(Vh)或其功能性片段，更优选地，其中所述功能性片段是Fab。17.根据权利要求16所述的革兰氏阳性菌或重组核酸，其中编码'或其功能性片段的所述外源基因与编码Vh或其功能性片段的所述外源基因的3’末端转录偶联。18.根据权利要求1、3至13、16或17中任一项所述的革兰氏阳性菌或者根据权利要求2至9或12至17中任一项所述的重组核酸，其中所述革兰氏阳性菌是乳酸菌，优选乳球菌(Lactococcus)、乳杆菌(Lactobacillus)或肠球菌(Enterococcus),更优选乳酸乳球菌(LactococcusIactis)或屎肠球菌(Enterococcusfaecium),或者其中所述革兰氏阳性菌是双歧杆菌(Bifidobacterium)。19.药物组合物，其包含根据权利要求1、3至13或16至18中任一项所述的革兰氏阳性菌。20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述一个或更多个外源基因编码产物，例如蛋白质、多肽或肽，所述产物在对象中具有治疗性或预防性作用。21.载体，其包含根据权利要求2至9或12至18中任一项所述的重组核酸。【文档编号】C12N15/90GK103562390SQ201280026763【公开日】2014年2月5日申请日期:2012年6月1日优先权日:2011年6月1日【发明者】克拉斯·万登布鲁克,卡罗利安·万于伊内盖姆,洛塔尔·施泰德勒申请人:阿克托杰尼斯有限公司