专利名称：单顺反子基因表达试剂盒及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域中的基因工程技术，具体涉及一种单顺反子基因表达试剂盒及其制备方法。
背景技术：
在转基因动物中外源基因的高效表达必须依赖好的表达载体。影响外源基因高效表达的因素很多，如启动子、甲基化、基因本身结构、插入位点、调控序列(增强子、绝缘子、核基质结合区)等。CAG启动子是人工构建的组合启动子，由巨细胞病毒(thecytomegalovirus，CMV)早期增强子(early enhancer element)和鸡 β-肌动蛋白(chicken beta-act in)启动子组成，CAG启动子是非特异性的组成型启动子，用于驱动基因在哺乳动物载体的高水平表达。本研究所用初始载体pCAG-1RES2-AcGFPl，是本研究室由pCAGEN载体上的CAG启动子移植并替换 pCMV-1RES2-AcGFPl 中的 CMV，同时以 pCAGEN载体上 Rabbit globin po IyA 移植并替换pCMV-1RES2-AcGFPl中的SV40polyA而得到的。核基质结合区(MARs)是真核生物染色质中与核基质或核骨架特异结合的一段DNA序列。MARs参与DNA复制调控和转录调控等多种核生化过程。我们从牛基因组克隆获得的MARs序列大小为1203bp，AT含量为62. 31 %，经生物信息学分析发现该序列也含有一个典型的DNA解旋序列(aatatt). —个潜在的T-box(taatcaa)和一个潜在的 TATA-box(tataat)序列结构。研究表明,MARs序列的功能包括边界因子(boundarye Iement)作用、染色质调节作用、DNA复制起始子的组分、染色体结构组成作用、MARs对转基因表达的调控作用，鉴于MARs与基因表达间的关系 ，尤其它能显著地增强转基因表达、克服位置效应、消除转基因沉默，它已被作为一种顺式调控元件应用到转基因技术中。基因表达盒研究现状，利用去除质粒载体主干序列的基因表达盒(仅包括启动子、编码区和终止子)作为基因转移体，也称为洁净DNA转化(clean DNA transformation)，主要是通过基因枪转化植物，已在水稻、棉花、小麦、葡萄转化中获得成功应用，利用花粉管导入法在甜瓜中也成功利用，而很少见在转基因动物尤其哺乳动物中的构建与应用。本研究中为了提高基因表达盒在哺乳动物中的转染和整合及表达效率，在基因表达盒的上游和下游各加了一个牛的核基质结合区(MARs)，构建制备成MAR-CAG-FATl-polyA-MAR单顺反子基因表达盒，作为基因转移体，用于转基因动物尚未见报道。它是洁净的、安全的基因转移体，为转基因动物研究提供新的思路和途径。
发明内容
本发明的目的在于提供无质粒载体主干序列、无任何选择标记、具安全性的组成型单顺反子基因表达盒，即MAR-CAG-FATl-polyA-MAR，独立基因转移体。
本发明的技术方案概述如下以双顺反子质粒载体P MAR-CAG-FSTN-1RES-AcGFPl-po IyA-MAR为初始质粒载体，经用EcoR I和Not I双酶切，将FSTN、IRES、AcGFPl切掉，选取剩余部分，与上游引入EcoR I和Hind III两个酶切位点，下游引入Not I酶切位点的中间序列T连接，构建成中间质粒载体PMAR-CAG-T-PolyA-MA以制备单顺反子基因表达盒的母载体，即利用EcoR/IHindI I I和Not I以任一目的基因替换T序列，即获得单顺反子基因表达盒，如用双酶切以 Hind II1-FATl-Not I 替换 Hind III—T-Not 获得 pMAR-CAG-FATl-polyA-MAR 质粒载体，用Sacl和AflII双酶切即分离到MAR-CAG-FATl-polyA-MAR基因表达盒，独立基因转移体。本发明的单顺反子基因表达试剂盒无主干载体序列和任何选择标记，避免了它们对转基因动物以及人类带来的潜在危害，是具转基因安全性的基因转移体。
图1 :初始质粒载体 P MAR-CAG-FSTN-1 RES-AcGFP1-po I yA-MAR 的结构示意图；图2 :中间质粒载体pMAR-CAG-T-Po I yA-MAR结构示意图；图3 :单顺反子基因表达盒质粒载体pMAR-CAG-FATl-polyA结构示意图。
具体实施例方式1. MAR-CAG-FATl-polyA-MAR 基因表达盒的构建利用图1所示的质粒载体pMAR-CAG-FSTN-1RES-AcGFPl-polyA-MAR作为初始载体构建没有主干载体序列、没有抗性基因、没有荧光标记的安全载体，先用EcoR I和Not I对质粒载体进行双酶切，将FSTN、IRES、AcGFPl切掉，再插入一段中间序列T，通过此序列引入新的合适的酶切位点，再通过新的酶切位点插入FATl序列。2.中间序列T的获得通过PCR反应从PMD19T-simple vector上获得含有HindIII酶切位点的序列，方便外源基因FATl的插入。PCR的引物设计上游引物引入EcoR I和HindIII两个酶切位点，下游引物引入Not I酶切位点，PCR引物如下所示TPE3 正义链5' AATCGgaattcAATCGaagcttTATCCGCCTCCATCCAGTCT 3'TPE4 反义链5' AATCGgcggccgcTTCCGTGTCGCCCTTATTCC 3'PCR反应条件(1)95°C 5min(2) 95 °C 30s(3) 60 °C 30s(4) 72°C 50s(5)72。。7min
(2)-(4)重复35个循环通过此反应即可获得该中间T序列，片断大小为657bp。测序通过胶回收的方法回收该片段，连接到PMD19T_simplevector上,转化并涂平板，挑菌并摇菌，通过菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，最后将阳性菌液送去测序，留一部分保菌。3.将T片断插入到酶切载体中获得中间质粒载体测序结果回来后，与原序列进行比对，选择测序结果正确的菌液进行提质粒，对所提质粒进行EcoR I和Not I双酶切，获得的片段通过EcoR I和Not I两个酶切位点插入到初始的酶切载体中，并进行酶切鉴定和PCR鉴定，以确保外源基因正确插入，获得的中间载体质粒pMAR-CAG-T-polyA-MAR，其结构示意图如图2所示。4.获得FATl序列哺乳动物自身不能合成ω-3多不饱和脂肪酸，所以通常处于供应不足的状态，其营养需求必需从摄食中获得。ω_3多不饱和脂肪酸去饱和酶基因fat-Ι是合成ω-3系列不饱和脂肪酸的关键酶。研究表明，fat-Ι基因促使ω-6系列不饱和脂肪酸转变为相应的ω-3系列不饱和脂肪酸。希望可以生产高表达ω-3系列多不饱和脂肪酸的转基因家畜。为方便目的片断插入载体中，上游引物5’端引入一个HindIII酶切位点，下游引物引入一个Not I酶切位点，前面分别添加5个保护碱基，如下所示FAF3 正义链5' AATCGaagctt CTGGTTATTGTGCTGTCTCAT 3'FAR4 反义链5' AATCGgcggccgcCTCATCACTTGGCCTTGG 3'使用上述引物从含FATl基因序列的cDNA库中进行PCR反应，反应条件如下(1)95°C 5min(2) 95 °C 30s(3) 58°C 30s(4) 72°C lmin20s(5) 72 °C 7min(2)-(4)重复35个循环通过此反应即可获得FATl序列的全长片断，片断大小为1182bp。通过胶回收的方法回收该片段,连接到PMD19T_simple vector上,转化并涂平板，挑选菌株并扩增，通过菌液PCR检测所挑菌落是否为阳性，最后将阳性菌株进行测序，留一部分保菌。5.将FATl序列插入到载体中测序结果回来后，与原序列进行比对，选择测序结果正确的菌液进行提质粒，对所提质粒进行HindIII和Not I双酶切，获得的片段通过HindIII和Not I两个酶切位点插入到中间载体中，并进行酶切鉴定和PCR鉴定，以确保外源基因正确插入，得到单顺反子质粒载体pMAR-CAG-FATl-polyA-MAR，其结构示意图如图3所示。6.获得 MAR-CAG-FAT1-po IyA-MAR 基因表达试剂盒
pMAR-CAG-FATl-po lyA-MAR质粒载体构建完毕后，用Sac1、AflII双酶切，即可获得MAR-CAG-FATl-polyA-MAR基因表达盒，其全序列为SEQ NO.1。转基因细胞整合与表达的鉴定一、转基因细胞的获得通过脂质体转染的方法获得转基因细胞，具体步骤如下1、DNA的准备酶切并回收基因表达盒MARCAGFATlpolyAMAR2、细胞的准备转染前一天解冻骨髓间充质干细胞，将重悬后的细胞按合适密度铺到24孔板的6个空中(每个孔的密度为70% -80% )，每孔加500微升细胞培养液(成分为DMEM+10% FBS)对细胞进行培养。3、转染(I)转染试剂的配制每孔需加200微升转染试剂，其成分为200微升opti-MEM+2微升LTX+0. 67微升plus+500 纳克 DNA。配制过程如下向opt1-MEM加入适量的DNA，彻底混匀；再向其中加入适量的plus轻轻混匀，室温静置5分钟；最后向其中加入适量的LTX，彻底混匀后室温静置30分钟。(2)待转染细胞的处理在转染试剂静置30分钟的过程中可以对待转染的细胞进行处理，处理过程如下将孔中原有的细胞培养液吸走，用500微升的DPBS洗两遍，再用500微升的opt1-MEM洗一遍，将原有培养液中的FBS彻底去除。(3)转染待转染试剂静置30分钟后，用移液器吹吸7-8次混匀，将孔中的opt i-MEM去除，吸取200微升转染试剂逐滴缓慢地加入到孔中，将培养板轻轻前后晃动几次，确保转染试剂均匀覆盖在细胞表面，放入培养箱中进行培养。(4)换液转染4-6小时后，将每个孔中的转染试剂去除，加入500微升的DMEM+10FBS，继续培养。二、外源基因整合检测转染后的细胞继续培养三天后，此时外源基因已经稳定整合，消化三个孔的细胞进行基因组DNA的提取，以其为模版，通过PCR的方法检测外源基因的整合情况。上游引物在FATl 5'端，下游引物在MAR序列3'端，PCR产物3000bp。将PCR的结果进行凝胶电泳，电泳结果显示，三个样品所对应的泳道在3000bp附近均有目的条带，说明这三个孔的转基因细胞中外源基因在DNA水平已经正常整合。三、外源基因表达检测转染后的第四天，对剩余三个孔的细胞进行总RNA提取，随即对总RNA进行反转录，以反转后的cDNA为模版进行RT-PCR，从而检测外源基因在RNA水平是否表达。所用引物为外源基因FATl的全长扩增引物，因此PCR产物长度为1258bp。将RT-PCR的结果进行凝胶电泳，电泳结果显示，三个样品所对应的泳道在1258bp附近均有目的条带，说明这三个孔的转基因细胞中外源基因在RNA水平已经正常表达。
上述实验结果表明，本发明所构建的MAR-CAG-FATl-polyA-MAR独立基因转移体可以有效地进行转染、整合与表达，且无任何质粒载体主干序列和任何选择性抗性基因及标志基因，是安全有效的新型基因转移体。当理解的是，本发明的具体实施例仅仅是出于示例性说明的目的，其不以任何方式限定本发明的保护范围，本领域的技术人员可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
权利要求
1.单顺反子基因表达试剂盒，其含有独立基因转移体MAR-CAG-FATl-polyA-MAR，其中MAR为牛核基质结合区；CAG为启动子；FAT1为n_3去饱和酶基因；polyA为终止区；所述的独立基因转移体无主干载体序列和任何选择标记。
2.根据权利要求1所述的单顺反子基因表达试剂盒，所述独立基因转移体的全序列为SEQ NO. lo
3.权利要求1或2所述的单顺反子基因表达试剂盒的制备方法，其特征在于包括如下步骤 利用图1所示的质粒载体pMAR-CAG-FSTN-1RES-AcGFPl-polyA-MAR作为初始载体构建没有主干载体序列、没有抗性基因、没有荧光标记的安全载体，先用EcoR I和Not I对质粒载体进行双酶切，将FSTN、IRES、AcGFPl切掉，再插入一段中间序列T，通过此序列引入新的酶切位点,再通过新的酶切位点插入FATl序列。
4.根据权利要求3所述的制备方法，所述的新的酶切位点是HindIII酶切位点。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的FATl序列通过如下引物进行PCR获得 FAF3正义链5' AATCGaagctt CTGGTTATTGTGCTGTCTCAT 3' FAR4反义链 5' AATCGgcggccgcCTCATCACTTGGCCTTGG 3'。
6.根据权利要求3-5任意一项所述的制备方法，其特征在于插入FATl序列通过Sac1、Afl II双酶切获得MAR-CAG-FATl-polyA-MAR单顺反子基因表达盒。
全文摘要
本发明公开了一种单顺反子基因表达试剂盒及其制备方法，其含有独立基因转移体MAR-CAG-FAT1-polyA-MAR，其中MAR为牛核基质结合区；CAG为启动子；FAT1为n-3去饱和酶基因；polyA为终止区。本发明的单顺反子独立基因转移体无主干载体序列和任何选择标记，避免了它们对转基因动物以及人类带来的潜在危害，是具转基因安全性的独立基因转移体。
文档编号C12N15/63GK103031324SQ20121055493
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者李光鹏, 胡晓明, 杨磊, 谌颜, 于超然, 扈廷茂 申请人:内蒙古大学