专利名称：植物染色体微切割获取单条染色体的方法
技术领域：
本发明涉及植物染色体的获取方法。
背景技术：
1.在细胞尚未进行分裂的核中，可以见到许多能够染色较深而纤细的网状物，这就是染色质。当细胞分裂时，核内的染色质即呈现为一定数目和形态的染色体 (chromosome)，控制生物各种性状的基因就是按一定顺序在染色体上成直线排列(如图 1)。2.染色体是细胞核中最重要的组成成分，在光学显微镜或电子显微镜下都可以看到染色体的存在，并且自然界中的动植物的各个物种的染色体都各有特定的形态特征。在细胞分裂过程中，染色体的形态和结构表现有一系列规律性变化。其中以有丝分裂的中期和早后期表现得最为明显和典型。这个阶段染色体收缩到最粗最短的程度，并且从细胞的极面上观察，可以看到他们分散地排列在赤道板上，所以通常以这个时期进行染色体形态的识别和研究。3.染色体的结构根据光学显微镜在有丝分裂中期的观察，染色体的结构是由两条染色单体(chromatid)组成的(图2)，在细胞分裂中期，核仁和核膜都消失了，核与细胞质已无可见的界限，细胞内出现清晰可见的由来自两极的纺锤丝所构成的纺锤体 (spindle)，各个染色体的着丝点均排列在纺锤体中央的赤道板上，而其两臂则自由地分散在赤道板两侧。由于这时染色体具有典型的形状，所以最适于采用适当的制片技术鉴别、切割和计数等研究工作。如到细胞分列后期，每个染色体的着丝点分裂成2个，这时各条染色体已成为一个染色体，形态不好识别和研究(图3)。植物染色体的显微切割主要有两种方法玻璃针切割法和激光灼烧法。玻璃针切割法是在倒置显微镜下，用直径不超过0. 5um的玻璃纤维对染色体直接进行切割，切下的目标染色体或染色体片段用微细玻璃针在45%的醋酸中收集到油室内， 进行蛋白酶消化等处理获得的DNA并用于PCR扩和克隆。该方法已在多种植物染色体切割上得到应用，能对目的染色体直接切割、分离，具有费用低的优点；但该技术操作困难，不易掌握，在一定程度上限制了其应用。激光灼烧法也叫激光切割法，借助激光对目标染色体灼烧进行显微切割、分离。可以借助于切割系统借助于系统软件直接对目标染色体进行可视化切割。该方法虽然操作简单，容易掌握，操作也更准确，但对设备条件要求相对较高，费用较高，不便于推广。
发明内容
本发明的目的是提出一种在植物细胞分裂中期，进行染色体微切割获取单条染色体的方法。本发明是在显微镜下，采用冷激光对需要研究的特定区段的染色体或染色单体片段进行按人为需要进行切割、分离，从而快速、准确地获得任意一条染色单体或染色单体片段。本发明的操作步骤如下第一步，截取0. 5cm左右的种子植物尤其是农作物(如小麦、玉米、水稻、棉花等) 根尖端，置于冰水中预处理24h，再移入70%乙醇中低温4°C保存、待用； 第二步，采摘上述同种植物的处于减数分裂中期的花粉母细胞(以下称花药)，先用乙醇冰醋酸=3 1体积比的溶液固定lOmin，立即转入70%乙醇中低温4°C保存、待用；第三步，对根尖和花药分别移入酶解液中进行酶解，酶解后从酶解液中取出，用无菌双蒸水冲洗后再放置在4°C无菌双蒸水中低渗3次；第四步，对根尖和花药分别进行染色体压片将根尖和花药分别置于盖玻片上，先滴加品红染色约5min后，轻轻捣碎根尖和花药，再将根尖和花药反转覆盖于载玻片的PEG 膜上，轻压一下即可，立即把压好的片子放到-20°C保存2小h ；再从低温冰箱取出，置于无菌操作台上，并用口吹气快速增温，马上用刀片揭开盖片，然后置于70°C烘箱干燥lmin，成为根尖和花药的染色体标本片子；立即进行下一步；第五步，染色体的微切割、单体收集和保存将制备好的根尖和花药染色体标本片子放在显微镜的载物台上，寻找染色体目标，找到后用350nm紫外冷激光切割，切割后的染色单体立即进行收集，并加入20 μ L的蛋白酶K溶液0. 2mL, 37°C静置4h，再置于高速离心机中以转速500r/min转4min，分离出含有染色体单体的溶液，将该溶液置于37°C温水中温浴4h，使蛋白酶K充分消化去蛋白，然后置于75°C培养箱20min，使蛋白酶K失活，再放入低温冰箱_20°C冰箱存放备用。本发明的积极效果是；1、本发明采用冷激光切割，激光不与分离的样本直接接触，不会因热效应对染色体样本造成破坏，克服了过去的染色体切割技术中存在的污染重，被分离的目标染色体难以完全回收，操作设备复杂等问题。再就是切割时，将制备好的染色体标本片子翻放在载物台上，使样本在PEG膜的下面，而黏性的Eppendorf收集管盖在PEG膜的上方，黏附时塑料帽只于膜接触，而不直接与组织接触，收集管盖只黏附分离下来的膜和样本，提取过程不需要激光的轰击，对样本没有损伤，使污染机会大大降低。2、本发明采取先在普通显微镜下把镜检到的理想的含染色单体的细胞先做标记， 为切割时查找提供了意想不到的效果。3、针对切割过程中的耗材昂贵问题，，本发明将PEG膜平整地胶附于载玻片上，很方便地用染色单体的切割和分离，在显微切割和分离完成后，再由载玻片上方的收集管带 EVA膜的塑料膜，靠逆重力将含有目标染色单体的材料粘走，简单实用。4、本发明获取的目标染色单体或染色单体片段，可以根据研究者的需要，在分离得到任意一条染色单体或染色单体片段后，利用PCR技术在引物和工作反应条件下，以分离切割下来的染色单体或染色单体片段为模版，进行外扩增，来检验染色体切割获取的染色单体或染色体片段有无科学研究或实际应用价值。5、本发明以普通小麦品种中国春为试验材料，试验过程中以根尖细胞和花粉母细胞的细胞分裂中期的染色单体切割，将收集到的中国春的单个细胞、2条染色体、单条染色单体、染色体片段进行第一轮微扩增，利用扩增产物进行琼脂糖电泳，结果表明，微切割、分离、收集的中国春染色单体来源为中国春的染色体。6、为了进一步验证第一轮微扩增的效果，又在第一轮微扩增基础上进行第二轮微扩增，验证本方法的可靠性。以第一轮扩增产物为模板，再进行第二轮的微扩增，利用第二轮微扩增产物进行 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过电泳图谱看出，进一步验证了微切割和收集的中国春的染色单体与中国春的染色体完全相同。
图1为染色体图；图2为有丝分裂中期的染色体结构，a、b为两条染色单体，c着丝点；图3为有丝分裂后期的染色体结构；图4为普通小麦中国春根尖细胞单条染色体切割前和切割收集后照片，其中A为单条染色体切割前照片，B为单条染色体切割分离后照片，C为单条染色体切割收集后照片；图5为以微量染色体为模板的第1轮DOP-PCR扩增；其中1泳道为DNA Marker DL2, 000 ；2 3泳道为1条染色体，4泳道为2条染色体，5泳道为染色体片段，6泳道为1 个全细胞条染色体；7泳道为阳性对照(普通小麦“中国春”基因组DNA)，8泳道为阴性对照 (无菌水)；图6为第2轮DOP-PDR微扩增产物聚丙烯酰凝胶电泳图谱；图中显示了普通小麦 “中国春”和中间偃麦草第2轮DOP-PDR微扩增产物聚丙烯酰凝胶电泳图谱，图中的2和10 泳道为DNA Marker DL2, 000 ；4泳道为染色体片段，1和3泳道为1条染色体，6泳道为2 条染色体，7泳道为1个全细胞染色体，5泳道为中间偃麦草1条染色体；8泳道为阳性对照 (普通小麦“中国春”基因组DNA)，9泳道为阴性对照(无菌水)；图7(A)为玉米染色体的切割前的照片；图7 (B)为玉米染色体切割后的照片；图7 (C)为玉米染色体切割后收集的照片；图8 (A)为棉花染色体切割前的照片；图8 (B)为棉花染色体切割后的照片；图8 (C)为棉花染色体切割后收集的照片；
具体实施例方式下面以小麦种子品种“中国春”为例说明本发明的操作步骤。第一步，种子根的获取将中国春种子在25°C无菌水中浸泡24h，然后转入4°C冰箱中24h后，再置于25°C 暗培养，待根长至Icm左右时，取出，用剪刀截取根的尖端0. 5cm左右，置于冰水中预处理 24h，再移入70%乙醇中于4°C保存待用；第二步，花粉母细胞(以下简称花药)的获取在大田条件下5月1日 5月10日，取中国春小麦花粉，(显微镜下观察，处于减数分裂中期I)，先用乙醇冰醋酸=3 1体积比的溶液固定lOmin，立即转入70%乙醇中，低温4°C保存待用。第三步，根尖 和花药的酶解先用滴管缓缓滴加无菌双蒸水，并冲洗根尖，4°C无菌双蒸水浸泡根尖和花药3 次，每次5min ；用剪刀切取根尖2-3mm，移入酶解液中，37°C Ih 45min ；同理，把花药移入酶解液37°C Ih ；将根尖和花药从酶解液中取出，用滴管缓缓滴加无菌双蒸水，并冲洗两次根尖，再放置在4°C无菌双蒸水中后低渗3次，每次5min，取出，再放入，再取出，再放入，重复两次；上述酶解液由4%重量百分比的纤维素酶Onazuka R-10+0. 5%重量百分比的果胶酶 Pectolyase Y-23，75mmol/L KCI 和 7. 5mmol/L EDTA 缓冲液配制而成，Ph = 4. 0，并抽虑除气泡；第四步，根尖和花药染色体压片将根尖和花药分别置于盖玻片上，先滴加品红染色约5min后，轻轻捣碎根尖和花药，再将根尖和花药反转覆盖于载玻片的PEG膜上，轻压一下即可，立即把压好的片子放到-20°C保存2小h ；再从低温冰箱取出，置于无菌操作台上，并用口吹气快速增温，马上用刀片揭开盖片，然后置于70°C烘箱干燥lmin，成为染色体标本片子，立即进行染色体微切割；第五步，染色体的微切割、单体收集和保存将制备好的染色体标本片子放在显微镜的载物台上，在40 X或IOOX镜下寻找染色体目标找到后，进行染色体的350nm紫外冷激光切割(图4)，由图4可以有出，图4A箭头所示欲切割的目标染色体(二价体)，表明目标染色体未被切割；图4B箭头所示切割路径， 表明目标染色体(二价体)已经被切割分离；图4C箭头所示目标染色体(二价体)被切割收集后留下的空白处，表明目标染色体(二价体)已经被黏性Eppendorf管盖收集。切割后的染色单体立即进行收集，并加入20 μ L的蛋白酶K溶液0. 2mL, 37°C 4h，再置于高速离心机中500r/min，4min,将含有分离的染色体的溶液置于37°C水浴中温浴4h，使蛋白酶K充分消化去蛋白，然后置于75°C培养箱20min，使蛋白酶K失活，再放入低温冰箱-20°C存放备用。为了证明实施例的效果，对上述小麦种子品种“中国春”的染色体的单体微量扩增，微量扩增后进行两轮PCR反应。第一轮反应取含上述酶解液的加入4μ L的IOXTaq的酶缓冲液和3μ L的含 25mmol/L MgCl2，加入5 μ L含2mmol/L dNTP加5 μ L含15pmol/L的引物(上海生物工程研究所合成，序列为 5，-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3 ’)，加 0. 5 μ 1 4U/ μ 1 的 Taq 酶加无菌水补至50 μ 1混勻，于BIO-RAD型扩增仪进行第一轮扩增；94°C预变性lOmin，然后进入5个循环的 94°C lmin,30°C 1. 5min，72°C 3min，其中 30°C变化至 72°C需 3min ；接着进行 25 个循环 94°C lmin，57°C lmin，72°C 1. 5min，每圈自动延伸 Isec ；最后 72°C延伸 lOmin，低温 4°C下进行保温。第二轮PCR反应5μ1第一轮PCR产物依次加入5yL IOXTaq酶缓冲液、 3μ L25mmol/L 的 MgCl2、5y L 2mmol/L 的 dNTP、5 μ L 15pmol/L 的引物(同上)、0· 5 μ L4U/ μ 1的Taq酶，最后加无菌水补至50 μ 1，混勻。于BIO-RAD型扩增仪进行第二轮扩增；反应程序为94°C预变性5min，然后进入30个循环的94°C lmin,55°C lmin,72°C 1.5min，最后72°C延伸lOmin，低温4°C下进行保温。 第一轮反应产物的琼脂糖电泳，仪器型号DYY-12型电泳仪，北京六一仪器厂生产，附件为DYCZ-24B型电泳槽(梳子25齿)，目的是对微切割回收到的切割产物能否利用 PCR技术进行DNA扩增，关系到显微切割技术是否具有应用价值。对中国春的单个细胞、两条染色体、染色单体片段等第一轮PCR扩增产物进行琼脂糖电泳(图5)。由图5可见，在 2 6泳道(普通小麦“中国春”微切割染色体)和第7泳道(阳性对照普通小麦“中国春” 基因组DNA)均获得较强的弥散扩增信号，其扩增产物长度均大于lOObp，而在泳道8(阴性对照无菌水)中未观察到此扩增信号，由此表明，在2-6泳道中所观察到的扩增信号(DNA 产物)很可能是源自普通小麦“中国春”基因组DNA。第二轮反应产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳。利用第二轮PCR扩增产物进行6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(图6)，由图6可见，5泳道产生了 1条清晰可辨的DNA谱带(箭头所示)，此条谱带的分子量大于lOObp，小于250bp，而在阴性对照9泳道(无菌水)中却未观察到此条谱带。在1、3、4、6、7泳道(微切割普通小麦“中国春”染色体DNA)和阳性对照 8泳道(普通小麦“中国春”基因组DNA)中，均分别产生了 2条分子量相同且清晰可辨的 DNA谱带(箭头所示)，其中1条DNA谱带的分子量大于250bp，小于500bp，另1条DNA谱带的分子量大于lOObp，小于250bp，而在阴性对照9泳道(无菌水)中却未观察到这2条 DNA谱带，由此说明，所切割和收集的普通小麦“中国春”的染色体DNA与普通小麦“中国春” 基因组DNA有同源性。由第一轮反应和第二轮反应，验证了本发明显微切割的染色体单体的可行性，可用于植物染色体的切割，并且可成功地收集。同理，用本发明方法切割玉米染色体和棉花染色体，其中玉米染色体切割前后以及切割后收集的照片见图7(A)、图7(B)和图7(C)；棉花染色体切割前后以及切割后收集的图片见图8(A)、图8(B)和图8(C)。
权利要求
1.一种植物染色体微切割获取单条染色体的方法，其特征在于，它是在显微镜下，采用冷激光对需要研究的特定区段的种子植物染色体或染色单体片段进行按人为需要进行切害I]、分离，从而快速、准确地获得任意一条染色单体或染色单体片段；具体操作步骤如下第一步，截取0. 5cm左右的种子植物根尖端，置于冰水中预处理24h，再移入70%乙醇中低温4°C保存、待用；第二步，采摘上述同种植物的处于减数分裂中期的花粉母细胞(以下称花药)，先用乙醇冰醋酸=3 1体积比的溶液固定lOmin，立即转入70%乙醇中低温4°C保存、待用； 第三步，对根尖和花药分别移入酶解液中进行酶解，酶解后从酶解液中取出，用无菌双蒸水冲洗后再放置在4°C无菌双蒸水中低渗3次；第四步，对根尖和花药分别进行染色体压片将根尖和花药分别置于盖玻片上，先滴加品红染色约5min后，轻轻捣碎根尖和花药，再将根尖和花药反转覆盖于载玻片的PEG膜上， 轻压一下即可，立即把压好的片子放到-20°C保存2小h ；再从低温冰箱取出，置于无菌操作台上，并用口吹气快速增温，马上用刀片揭开盖片，然后置于70°C烘箱干燥lmin，成为根尖和花药的染色体标本片子；立即进行下一步；第五步，染色体的微切割、单体收集和保存将制备好的根尖和花药染色体标本片子放在显微镜的载物台上，寻找染色体目标，找到后用350nm紫外冷激光切割，切割后的染色单体立即进行收集，并加入20 μ L的蛋白酶K溶液0. 2mL, 37°C静置4h，再置于高速离心机中以转速500r/min转4min，分离出含有染色体单体的溶液，将该溶液置于37°C温水中温浴 4h，使蛋白酶K充分消化去蛋白，然后置于75°C培养箱20min，使蛋白酶K失活，再放入低温冰箱-20°C冰箱存放备用。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的种子植物为农作物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的农作物为小麦、玉米、水稻或棉花。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酶解液由4%重量百分比的纤维素酶 Onazuka R-10+0. 5%重量百分比的果胶酶 Pectolyase Y-23，75mmol/L KCI 和 7. 5mmol/L EDTA缓冲液配制而成，Ph = 4. O,并抽虑除气泡。
全文摘要
本发明公开了一种植物染色体微切割获取单条染色体的方法，它是在显微镜下，采用冷激光对需要研究的特定区段的种子植物染色体或染色单体片段进行按人为需要进行切割、分离，从而快速、准确地获得任意一条染色单体或染色单体片段。本发明采用冷激光切割，激光不与分离的样本直接接触，不会因热效应对染色体样本造成破坏，克服了过去的染色体切割技术中存在的污染重，被分离的目标染色体难以完全回收，操作设备复杂等问题。
文档编号C12Q1/68GK102352352SQ20111031564
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者刘连颖, 尹赟瑜, 毕建杰, 盛一璟, 谭秀山, 高居荣 申请人:山东农业大学