检测病源细胞的靶向性分子及其应用的制作方法

专利名称：检测病源细胞的靶向性分子及其应用的制作方法
检测病源细胞的靶向性分子及其应用技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及检测病源细胞的靶向性分子及其制备方法和应用。
背景技术：
众多临床数据和研究表明，对病源细胞的定量检测是准确判断患者病情并给予及时治疗的直接证据。例如，血液中循环肿瘤细胞的数量是决定病人预后的重要因素。同样， 对血液中的疟原虫的检测也是判断疟疾病情的重要指标。
传统的检测方法基本是基于对病源细胞表面抗原的检测和定量。在这些方法中， 抗体首先被附着在一个固体载体上，由于抗体-抗原的相互作用抗体和待检测细胞形成复合物。同样的原理，抗体可能先通过抗原-抗体反应和待检细胞形成复合物，然后再附着到一个固体载体上。其后，被抗体抓住的细胞被收集和标记以此来定量。比如免疫荧光技术检测循环肿瘤细胞。首先用附着于磁珠或微流体芯片的抗体将肿瘤细胞从血液中富集出来。 然后用带有标记物、肿瘤细胞特异性的抗体标记肿瘤细胞并进行定量检测。一般来说，标记物包括放射性的同位素，染料，荧光素和酶(用于酶标反应)等。尽管基于抗原捕获的检测方法在临床上应用广泛，但是这些方法有许多不足之处
(I)检测灵敏度低。抗原酶标检测主要是通过对细胞抗原直接进行检测。这些方法的检出限受到目标细胞表面抗原数量的限制，检测限通常在 10_9m。因此在细胞数量稀有时(抗原浓度< I(T12M)，灵敏度不够。因此，目前本领域非常有必要开发新的检测试剂或方法，以提高检测的灵敏度。
(2)通量低。这些方法的通量受限于人工。因此，通量较低，不适用于大量筛查。
(3)操作麻烦且人为误差大。传统方法的操作步骤繁复，人工要求高。因此不可避免有很多人为引入的实验误差，从而导致检测结果的可信性下降。
(4)多重检测。对样本的多个抗原进行同时检测是临床诊断和治疗分型的重要指导指标。由于标记物的限制，传统的方法最多在同一个检测样本中对病源细胞的3-4个抗原进行同时检测。因此，不可能对样本的抗原进行大规模扫描。
现今技术对某种细胞的检测往往基于一个A-B的二联体理念:A代表一个针对细胞的特异性的、高亲和性的配体分子(Kd < 10_6M)，比如单克隆抗体、高亲和性的多肽片段、 高亲和性化学小分子等，用于特异性地结合目标细胞的表面抗原代表一个或多个染料标记分子，用于定量检测分子A。A和B可以是通过化学共价键偶联的分子。例如，抗⑶45 的抗体通过化学键CO-NH和荧光标记分子荧光素琥珀酰亚胺酯键合。此荧光素抗CD45的抗体可以用于特异性的荧光标记并定量检测白细胞。A和B也可以是通过非化学键键合的分子对(如氢键、范德华力等)。比如，A代表生物素共价键偶联的抗CD45的抗体，B代表亲和素共价键偶联的碱性磷酸酶，用于检测和定量。A和白细胞表面的CD45抗原结合，而B 通过生物素和亲和素的氢键结合从而达到检测的目的。
上述这些方 法虽然可以很便捷地检测目标细胞，但是这些方法的检出限受到目标细胞表面抗原数量的限制，检测限通常为 IO-9M,灵敏度并不高。
因此，目前本领域非常有必要开发新的检测试剂或方法，以提高检测的灵敏度。发明内容
本发明的目的在于提供靶向性分子偶联的寡聚核苷酸探针及其制备方法。
在本发明的第一方面，提供一种检测病源细胞的靶向性分子，结构如下
X-Y ；
其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子；
Y代表寡核苷酸探针；
代表X和Y之间的共价连接(键合)、偶联或偶合的关系。
在一个优选例中，X选自特异性靶向病源细胞的抗体、配体、化学小分子或多肽。
在另一优选例中，所述的X对于病源细胞的平衡解离常数小于10_6mOl/L(M)。
在另一优选例中，所述的病源细胞是肿瘤细胞，X是叶酸或叶酸-半胱氨酸偶联物。
在另一优选例中，所述的肿瘤细胞是循环肿瘤细胞(CTC)。
在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针是经过化学修饰的寡核苷酸探针，所述的化学修饰增强列寡核苷酸探针的稳定性。
在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针的序列中，磷酸键上存在硫代修饰。
在另一优选例中，所述的“磷酸键上存在硫代修饰”是指寡核苷酸探针的序列中， P-O发生硫代脱氧而形成P-S。
在另一优选例中，所述的“磷酸键上存在硫代修饰”发生在部分磷酸键上或发生在所有磷酸键上。
在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针是单链或是双链。
在另一优选例中，所述的寡核苷酸探针的长度是10_150bp (双链)或 10-150nt (单链)；较佳地，所述的寡核苷酸探针的长度是20-100bp (双链)或20_100nt (单链)；更佳地，所述的寡核苷酸探针的长度是20-80bp (双链)或20-80nt (单链)。
在本发明的另一方面，提供一种制备靶向性分子的方法，所述靶向性分子结构如下
X-Y ；
其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子，该结合分子是叶酸-半胱氨酸偶联物；
Y代表寡核苷酸探针；
代表X和Y之间的共价连接(键合)、偶联或偶合的关系；
所述方法包括
(a)将寡核苷 酸与琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯(SMCC)溶液混合，将寡核苷酸上的氨基和琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯以C-N共价键键合，获得寡核苷酸-琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯键合产物；
(b)在寡核苷酸-琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯键合产物中加入叶酸-半胱氨酸偶联物，将叶酸-半胱氨酸的硫基和琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯上的马来酰亚胺以C-S共价键键合；获得寡核苷酸-叶酸-半胱氨酸产物。
在本发明的另一方面，提供所述的靶向性分子的用途，用于制备检测病源细胞的试剂或试剂盒。
在本发明的另一方面，提供一种检测病源细胞的试剂盒，其中包括所述的靶向性分子。
在另一优选例中，所述的试剂盒中包括1-100种靶向性分子，各靶向性分子中X相同或不同，且Y的碱基序列不同；从而，当靶向性分子多于一种时，该试剂盒可用于对不同的病源细胞或同一病源细胞表面上不同的特定分子进行多重检测。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括特异性扩增所述的靶向性分子中寡核苷酸探针的引物；和/或
特异性针对所述的靶向性分子中寡核苷酸探针的检测探针，该检测探针携带可检测标记。
在另一优选例中，所述的引物针对所述的靶向性分子中的寡核苷酸探针的两端序列；所述的检测探针与所述的靶向性分子中的寡核苷酸探针的中间序列互补。
在另一优选例中，所述的引物针对所述的靶向性分子中的寡核苷酸探针的两端序列；所述的检测探针与所述的寡核苷酸探针中与引物序列互补的序列位置之外的中间序列位置互补。
在另一优选例中，所述的引物的长度是8_50bp ;较佳地是10_30bp。
在另一优选例中，所述的检测探针是荧光探针，其携带的可检测标记是荧光分子； 更佳地，所述的检测探针是TaqMan探针。
在本发明的另一方面，提供一种检测病源细胞的方法，包括
(I)将所述的靶向性分子与待测样品共混，孵育；
(2)孵育结束后收集细胞，从细胞上洗脱所述的靶向性分子(较佳地，用pH2. 5的甘氨酸缓冲液洗脱)；
(3)以步骤(2)洗脱的靶向性分子为模板，进行PCR定量分析，根据定量分析结果获知待测样品中病源细胞的存在情况以及存在量。
在另一优选例中，所述的引物针对所述的靶向性分子中的寡核苷酸探针的两端序列；所述的检测探针与所述的靶向性分子中的寡核苷酸探针的中间序列互补。
在另一优选例中，所述的引物针对所述的靶向性分子中的寡核苷酸探针的两端序列；所述的检测探针与所述的寡核苷酸探针中与引物序列互补的序列位置之外的中间序列位置互补。
在另一优选例中，所述的引物的长度是8_50bp ;较佳地是10_30bp。
在另一优选例中，所述的检测探针是荧光探针，其携带的可检测标记是荧光分子； 更佳地，所述的检测探针是TaqMan探针。
在另一优选例中，步骤(3)中，以特异性针对(扩增)该靶向性分子中寡核苷酸探针的引物和/或特异性针对所述的靶向性分子中寡核苷酸探针的检测探针(该检测探针携带可检测标记)进行PCR扩增，获得PCR定量分析结果；根据定量分析结果获知待测样品中病源细胞的存在情况以及存在量。
在另一优选例中，步骤(3)中，还设置对照组和/或标准品组，籍此分析待测样品中病源细胞的存在情况以及存在量。
在另一优选例中，所述的检测病源细胞的方法是非诊断性或治疗性的。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。


图1、对制备获得的产物进行HPLC分析(260nm)。
A、叶酸-半胱氨酸-SSP025的HPLC纯度分析图谱；
B、叶酸-半胱氨酸-SSP045的HPLC纯度分析图谱；
C、叶酸-半胱氨酸-ssPOlOO的HPLC纯度分析图谱；
D、叶酸-半胱氨酸-ssPS45的HPLC纯度分析图谱；
E、叶酸-半胱氨酸-dsP045的HPLC纯度分析图谱。
图2、对制备获得的产物进行紫外分光光度分析。
A、叶酸-半胱氨酸偶联物的紫外分光光度分析；
B、未偶联的ssP025的紫外分光光度分析；
C、叶酸-半胱氨酸-ssP025偶联体的紫外分光光度分析；
D、叶酸-半胱氨酸-ssP045偶联体的紫外分光光度分析；
E、叶酸-半胱氨酸-ssPS45偶联体的紫外分光光度分析；
F、叶酸-半胱氨酸-ssPOlOO偶联体的紫外分光光度分析。
图3、对叶酸-半胱氨酸-寡聚核苷酸探针与叶酸受体的亲和力进行检测，获得叶酸-半胱氨酸-SSP025的竞争结合曲线。
图4、叶酸-半胱氨酸-寡聚核苷酸探针的PCR检测，不同长度探针的扩增结果。
图5、对表4数据进行线性回归分析。将标准品中的细胞数量作为独立变量，平均检出的细胞数量作为依赖变量，结果得到纵轴截距1. 99，斜率为1. 159 ;及R2 = 0. 99。
图6、分别获自3个病例的胸水样品用叶酸-半胱氨酸-0G(0G为oregon green 488，是一种荧光分子，绿色，染的是叶酸受体)和DAPI染色(蓝色，染的是细胞核)的结果， 其中左列为光学透射成像结果，用于观察细胞的形态；右列为叶酸-半胱氨酸-OG和DAPI 的染色结果。单呈蓝 色的为白细胞；蓝、绿两色双染的为癌细胞。
具体实施方式
本发明揭示了一种新的检测病源细胞的试剂和方法，本发明的方法通过对标记物寡聚核苷酸进行信号放大，提高了病源细胞表面特定分子的检测灵敏度(检测限为 I(T14M);且不同的寡聚核苷酸序列可以对多种待检测分子进行编码，因此可以实现多重检测。
术语
如本文所用，所述的“病源细胞”是指来自于病灶组织的细胞(固定于病灶组织或由病灶组织释放并游离存在于体液中)，该细胞表面上存在有特定分子(例如表面抗原或受体)，该特定分子为该种病源细胞所特有的，且能够被特定的结合分子(如抗体、配体)结合，该特定的结合分子即为特异性靶向病源细胞的结合分子。例如，叶酸可以识别和结合癌细胞表面的叶酸受体(folate receptor),抗Her2的单克隆抗体可以识别和结合于乳癌细胞表面的Her2抗原；LHRH多肽可以识别和结合前列腺癌细胞表面的黄体生成素释放激素受体(LHRH receptor)等等。
如本文所用，所述的“结合分子”能够特异性地靶向病源细胞上特定分子(例如表面抗原或受体)，其具有高的亲和性，其对于的平衡解离常数通常小于10_6。所述的“结合分子”例如但不限于抗体、配体、化学小分子或多肽等。
如本文所用，所述的“特异性针对靶向性分子中寡核苷酸探针的引物”是指一条引物或一对引物，其至少部分序列可以与靶向性分子中的寡核苷酸探针互补，该引物可通过 PCR技术来扩增寡核苷酸探针的序列。所述的引物通常是引物对，包括与寡核苷酸探针两端互补的正向和反向的序列。
如本文所用，所述的“癌症”或“肿瘤”没有特别的限制，较佳地该“癌症”或“肿瘤” 自发病起会向血液循环中散播癌症细胞或肿瘤细胞。例如选自(但不限于)鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、肺癌、宫颈癌、白血病、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤、神经系统肿瘤、小儿肿瘤。作为本发明的优选实施方式，所述的“癌症”或“肿瘤”选自乳(腺)癌、肺癌。
如本文所用，所述的“平衡解离常数(equilibriumdissociation constant,Kd) ” 指占据半数细胞上特定的受体或表面分子所需的配体、抗体、化学小分子或多肽的浓度。Kd 值与受体亲和力呈反向关系，Kd值愈小，表明亲和力愈高；反之Kd值愈大，表明亲和力愈低。通常Kd小于10_6M表示受体或表面分子与的配体、抗体、化学小分子或多肽亲和力高。
如本文所用，所述的“特异性”是指是抗体、配体、多肽或化学小分子能识别和/或结合于循环肿瘤细胞表面的特定分子(如表面抗原、受体)上，但不识别和结合于其它非相关分子。
如本文所用，所述的“TaqMan荧光探针”为一种寡核苷酸，其两端分别标记一个荧光发射基团(作为可检测信号)和一个荧光淬灭基团。当探针完整时，荧光发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’ -3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而通过荧光检测系统可接受到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，即荧光信号的累计与PCR产物形成的完全同步，从而实现定性和定量。
如本文所用，所述的“循环肿瘤细胞(CTC) ”是指存在于血液(外周血)中的癌症 (肿瘤)细胞，CTC的浓度可以诊断癌症、对癌症进行分期、预后等。
基本原理
本发明的方法主要基于结`合分子-寡(聚)核苷酸探针，所述的结合分子特异性靶向病源细胞表面的特定分子。所述的寡核苷酸探针用于作为后续PCR定量分析的扩增模板。所述的结合分子通过与病源细胞表面的特定分子结合，对病源细胞进行标记。而寡聚核苷酸通过定量PCR技术用于对配体进行定量检测从而达到对待检细胞进行定量的目的。
基于上述原理所实现的技术效果如下首先，由于PCR对寡聚核苷酸的扩增效应， 可以将检测限大大降低；其次，PCR的技术可以对大量样本在2小时内进行检测，通量高；再次，由于寡聚核苷酸的多样性，可以对不同的病源细胞或同一种病源细胞表面的不同受体进行多重检测。因此，本发明的试剂和方法解决了传统方法许多不能解决的问题。
靶向性分子
本发明的靶向性分子主要是基于以下结构
X-Y ；
其中，X代表一个特异性的针对病源细胞的高亲和性分子(通常Kd < 10_6mol/L)， 比如抗体、高亲和性的多肽片段、高亲和性化学小分子等，用于特异性地结合病源细胞上的特定分子；γ用于作为后续PCR定量分析的扩增模板，用于目标病源细胞的定量检测。
X是发挥导向作用的关键分子，其是用于识别和/或结合病源细胞的，因此，其通常根据所需检测的病源细胞的类型而设，例如叶酸可以识别和结合肺癌细胞表面的叶酸受体(folate receptor);抗Her2的单克隆抗体可以识别和结合于乳癌细胞表面的Her2 抗原；LHRH多肽可以识别和结合前列腺癌细胞表面的黄体生成素释放激素受体(LHRH receptor)。
目前，针对存在于各种病源细胞表面的特定分子，已经有深入的研究，也开发出了各种针对这些表面分子的结合分子，包括抗体、配体、多肽、化学小分子等。本发明对结合分子没有特别的限制，这些结合分子均可被应用于本发明的方法中，从而设计出各种针对病源细胞的靶向性分子。
Y是具有一定长度的寡核苷酸分子，基于该寡核苷酸分子可设计出特异性的引物从而实现PCR扩增，通过扩增效应降低检测限，提高检测的敏感性。所述的寡核苷酸分子可以是双链的或是单链的。所述的寡核苷酸的序列没有特别的限定，较佳地其不与人体或动物体的基因序列互补，本领域人员熟知其设计以及合成的方法。所述寡核苷酸的长度较佳地可以是10-150bp (双链)或10-150nt (单链)。
本发明还包括采用如基于核酸链骨架修饰技术等手段获得的经修饰的寡核苷酸分子，所述的修饰基本不改变寡核苷酸分子结合特性；优选那些能够提高寡核苷酸分子稳定性的修饰。例如，所述的修饰为硫代修饰，或在核糖的2’位置进行烷基修饰。应理解，任何能够保持所述寡核苷酸分子结合特性的修饰都包含在本发明中。
寡核苷酸的骨架修饰方法有多种，包括硫代法，该方法是将DNA骨架上磷酸键上的氧原子用硫原子替代，所述的硫代可以是全部磷酸键上的硫代或是部分磷酸键上的硫代。硫代的修饰能够大大增强所述寡核苷酸分子的稳定性，从而有利于获得准确的检测结果O
较佳地，X和Y之间以化学共价键的形式连接。
作为本发明的优选方式，本发明人在反复研究后，开发了检测循环肿瘤细胞 (CTC)的靶向性分子。这是由于叶酸可以识别和结合肿瘤细胞表面的叶酸受体(folate receptor)。该靶向性分子中，X是叶酸或叶酸-半胱氨酸偶联物。叶酸与半胱氨酸的偶联物与天然叶酸相比较，提高了与叶酸受体的亲和力；并且，将叶酸与半胱氨酸相连，可以显著地增加叶酸的溶解性，从而提高与循环肿瘤细胞接触的叶酸的量。叶酸-半胱氨酸偶联物的制备可以采用本领域已知的技术进行。与叶酸连接的半胱氨酸的个数可以是一个或多个的，例如I 3个，该范围内的半胱氨酸可为叶酸提供良好的亲水环境。该靶向性分子中， Y的序列是多种多样的，且是硫代的或非硫代的。
试剂盒
本发明开发的一种或多种靶向性分子可被包含在试剂盒中，从而便于本领域技术人员的操作。
与所述靶向性分子配套的引物也可被包含在试剂盒中，该引物通常是引物对，包括正向的和反向的与所述的靶向性分子的两端序列互补的序列，从而可以以所述的靶向性分子为模板，进行PCR扩增，实现检测结果的放大。
较佳地，所述的试剂盒中还包括荧光PCR用的荧光探针，例如TaqMan探针，从而便于PCR产物的定量分析。
所述的试剂盒中，所述靶向性分子及其配套的弓I物或荧光探针被独立地装于合适的容器中，更佳地所述靶向性分子及其配套引物或荧光探针还被配制成合适的用量或浓度。
所述的试剂盒中还可包含其它试剂，例如用于PCR扩增的试剂(如DNA聚合酶， Realtime PCR Master Mix)、缓冲液(如 PBS)、洗漆液等。
所述试剂盒还可包括试剂盒使用说明书，以指导技术人员的操作。
应用
本发明还涉及利用所述的靶向性分子来检测病源细胞的方法，所述的方法可以是以诊断疾病为目的的，例如对患者进行预后，或判断疑似人群是否罹患疾病；或以非诊断疾病为目的的，例如，纯粹的科学研究，或纯粹的细胞分型(如区分肿瘤细胞的类别)。
所述的检测病源细胞的方法包括(I)将所述的靶向性分子与待测样品共混，孵育；(2)孵育结束后收集细胞，从细胞上洗脱所述的靶向性分子；(3)以步骤(2)洗脱的靶向性分子为模板，以特异性针对(扩增)该靶向性分子中寡核苷酸探针的引物进行PCR扩增，获得PCR定量分析结果；根据该定量分析结果获知待测样品中病源细胞的存在情况以及存在量。
所述的PCR优选荧光定量PCR技术，因此，较佳地，在PCR扩增系统中还加入荧光探针，从而可藉由特定的定量PCR仪方便地实现分析；更佳地，所述的荧光探针是TaqMan探针。
作为本发明的优选方式，还设置对照组和/或标准品组，即已知叶酸-半胱氨酸-寡聚核苷酸探针数量的组，通常设置一系列数量不同的标准品构成标准品组，籍此分析待测样品中病源细胞的存在情况以及存在量。
下面结合 具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
材料
H-Cys (Trt) -2-C1 Trt 树脂、HBTU和 HOBT 均购自 Novabiochem (U. S. A.)。红细胞裂解液购自索莱宝生物(北京，中国)。氨基修饰的单链寡聚核苷酸(SSP025，SSP045，SSP052， ssPOlOO)、PBS> CD45 Dynabeads 磁珠和 PCR 检测试剂购自 Invitrogen (Long Island, U.S.A.)。SMCC (琥拍酰亚胺-4-环己烧-1-碳酸酯)购自 Thermo Scientific (U. S. A.) 所用细胞株均购自中科院细胞库(上海，中国)。叶酸-半胱氨酸-OG(oregon green 488) 分子如下制备。除非另外说明，实施例所用的叶酸是Y叶酸。寡聚核苷酸和PCR的引物购自 Invitrogen 公司。PD-10 柱(Sephadex G-25M)购自 General Electrical Healthcare (美国)。定量PCR的试剂购自TOYOBO公司(日本)。定量PCR仪为Applied Biosystems 的7300realtime PCR system。其余试剂均购自Sigma Aldrich。叶酸抗体购自Cortez Diagnostics (美国)。
“叶酸-半胱氨酸-0G”制备方法如下
首先，合成叶酸-半胱氨酸偶合物。将441mg的Y叶酸慢慢溶入20mL 二硫甲砜， 然后加入1. 2mmol的二环己基碳二亚胺和2mmol的N-羟基硫代琥珀酰亚胺于50°C反应6 小时。此反应得到的Y叶酸-N-羟基硫代琥珀酰亚胺和10倍等摩尔量的半胱氨酸加入50 微升吡啶在25°C反应5小时。粗产物(其中包含Y叶酸-半胱氨酸和α-异构体-半胱氨酸)用20mL乙腈沉淀并离心收集。随后产物用乙醚洗三遍。收集的产物最后用真空干燥，并称量，重量为390mg。此粗产物用美国Agilent Technologies的Microsorb碳-18制备型反相高效液相色谱柱(250mmX21mm)分离纯化。Y叶酸-半胱氨酸的洗脱时间分别为 7. 6分钟。分离的Y叶酸-半胱氨酸(此为脂键CO-NH连接的偶合物，含2个半胱氨酸) 为58mg,得率为12%。然后,将纯化后的1.5mg偶合物在100 μ L的二硫甲砜中溶解,并加入1. Omg的Oregon Green 488琥珀酰亚胺酯并在室温孵育4小时。反应后的产物用高效液相色谱纯化，获得Oregon Green 488 (简称0G)荧光标记的叶酸探针(称为叶酸-半胱氨酸-0G)。
实施例1、双链寡聚核苷酸探针的制备
用经灭菌的去离子水分别溶解序列互补的两条单链寡聚核苷酸(其中一条单链用氨基(Amino)修饰)，配制成50 μ M单链寡聚核苷酸溶液。如下设置退火反应体系
去除核酸酶的水40μ I ；
退火缓冲液(5Χ)20μ1(其中 IOmM Tris, pH 7. 5-8. 0,50mM NaCl, ImM EDTA);正向链 F-ssP045 (50 μ M) 20 μ I ;反向链 R_ssP045 (50 μ Μ) 20 μ I ;总体积 100 μ I。
按照上述顺序依次加入各种试剂，混匀。然后如下设置PCR仪进行退火反应
权利要求
1.一种检测病源细胞的靶向性分子，结构如下X-Y ；其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子；Y代表寡核苷酸探针；代表X和Y之间的共价连接、偶联或偶合的关系。
2.如权利要求1所述的靶向性分子，其特征在于，X选自特异性靶向病源细胞的抗体、 配体、化学小分子或多肽。
3.如权利要求2所述的靶向性分子，其特征在于，所述的病源细胞是肿瘤细胞，X是叶酸或叶酸-半胱氨酸偶联物。
4.如权利要求3所述的靶向性分子，其特征在于，所述的肿瘤细胞是循环肿瘤细胞。
5.如权利要求1所述的靶向性分子，其特征在于，所述的寡核苷酸探针的序列中，磷酸键上存在硫代修饰。
6.一种制备靶向性分子的方法，所述靶向性分子结构如下X-Y ；其中，X代表特异性靶向病源细胞的结合分子，该结合分子是叶酸-半胱氨酸偶联物；Y代表寡核苷酸探针；代表X和Y之间的共价连接、偶联或偶合的关系；所述方法包括(a)将寡核苷酸与琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯溶液混合，将寡核苷酸上的氨基和琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯以C-N共价键键合，获得寡核苷酸-琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯键合产物；(b)在寡核苷酸-琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯键合产物中加入叶酸-半胱氨酸偶联物，将叶酸-半胱氨酸的硫基和琥珀酰亚胺-4-环己烷-1-碳酸酯上的马来酰亚胺以 C-S共价键键合；获得寡核苷酸-叶酸-半胱氨酸产物。
7.权利要求1所述的靶向性分子的用途，用于制备检测病源细胞的试剂或试剂盒。
8.—种检测病源细胞的试剂盒，其中包括权利要求1所述的靶向性分子。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，其中还包括特异性扩增权利要求1所述的靶向性分子中寡核苷酸探针的引物；和/或特异性针对权利要求1所述的靶向性分子中寡核苷酸探针的检测探针，该检测探针携带可检测标记。
10.一种检测病源细胞的方法，包括(1)将权利要求1所述的靶向性分子与待测样品共混，孵育；(2)孵育结束后收集细胞，从细胞上洗脱权利要求1所述的靶向性分子；(3)以步骤(2)洗脱的靶向性分子为模板，进行PCR定量分析，根据定量分析结果获知待测样品中病源细胞的存在情况以及存在量。
全文摘要
本发明涉及检测病源细胞的靶向性分子及其制备方法和应用。本发明的方法通过对标记物寡聚核苷酸进行信号放大，提高了病源细胞表面特定分子的检测灵敏度；且不同的寡聚核苷酸序列可以对多种待检测分子进行编码，因此可以实现多重检测。
文档编号C12N15/10GK103045720SQ20111031528
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者何伟, 杨国华, 吕娟, 韩宁宁, 李英辉, 郭志伟 申请人:格诺思博生物科技(上海)有限公司, 南通中博医药科技有限公司