一种利用多重pcr技术检测转基因番木瓜的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用多重PCR技术检测转基因番木瓜的 方法。
【背景技术】
[0002] 目前，全世界范围内很多种转基因作物已经商业化，如大豆、玉米、棉花、油菜以及 番木瓜等，而对转基因产品的安全性问题，还存在争议。因此，部分国家为保障本国消费者 知情权和贸易壁皇，要求对转基因产品进行定性或定量标识。
[0003] 目前我国对转基因产品强制要求定性标识政策，而定性标识的技术基础是转基因 成分检测方法的研宄。
[0004] 目前，转基因检测方法有PCR方法、酶联免疫吸附法（ELISA)、Western杂交法、近 红外光谱法。应用最为广泛的方法为PCR方法，已经应用于多种转基因产品的检测，如土 豆、玉米、大米等。番木瓜是一种亚热带水果，但由于易受环斑病毒的感染而影响其产量，科 学家采用转基因技术培育出抗环斑病毒的转基因番木瓜，抗环斑病毒转基因番木瓜品种主 要有Event "55-l"、"GM-YK"和"华农一号"，"华农一号"是我国自主研发的转基因番木瓜， 已批准进入区域商业化，目前尽管已经建立了转基因番木瓜检测方法，但对"华农一号"快 速筛选方法的建立仍需开展。目前已有多重PCR法同时检测"Event 55-1"和非法转基因 品种，实时荧光PCR法研宄"Event 55-l"、"GM - YK"等非法转基因品种的污染及基因流动 性研宄等，但对"华农一号"研宄很少。姜大刚等利用TAIL-PCR法测定出插入位点后利用 定性PCR检测华农一号，可达到0. 05%的检测限。韩建勋等用实时荧光定量PCR对包括华 农一号在内的四种转基因产品进行研宄，发现能检出了中国台湾中兴大学研发的两个转基 因品系。但这些研宄都只限于转基因番木瓜华农一号的品系检测，并不能同时对多种转基 因番木瓜品种进行检测。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有检测技术不能同时检测包含"华农 一号"在内的多种转基因番木瓜的不足，提供一种利用多重PCR技术检测转基因番木瓜的方 法。
[0006] 本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
[0007] 一种利用多重PCR技术检测转基因番木瓜的方法，包含如下步骤：
[0008] S1.设计多重PCR的5对引物，分别为：
[0009] Papain-F ：ATCTACAATCTTGCTAACCCTA ；
[0010] Papain-R ：AGTCATCTTGAGAATAACCCAC ；
[0011] 35s-F ：AAGACGATCTACCCGAGCAA ；
[0012] 35s-R ：GAAGCAAGCCTTGAATCGTC ；
[0013] Nptll-F ：CTGTGCTCGACGTTGTCACT ；
[0014] Nptll-R：CTTCCATCCGAGTACGTGCT；
[0015] RP-F：CTTTGGTGCGGAAAAGTTGT ；
[0016] RP-R ：CCATAGCCCACAGTCGAATT ；
[0017] CP-F ：AGAATGTTTGGAATGGACGG ；
[0018] CP-R ：GCATACCCAGGAGAGAGTGC ；
[0019] S2.检测：以待检测番木瓜基因组DNA为模板，在PCR反应中加入SI.设计的所有 引物，进行PCR、电泳，从而得知所检测的番木瓜是否为转基因番木瓜。
[0020] 多重PCR在扩增过程中会遇见多个靶点扩增条件不兼容的问题，因此引物的设计 及反应条件调整极为重要。本发明通过内源基因木瓜蛋白酶基因的使用和对三种转基因番 木瓜外源基因特有基因分布研宄，得到五对特异性引物，成功进行了特异性扩增。在进行 五重PCR研宄过程中，采用逐个增加引物的方法，并同时对反应条件，引物配比等影响多重 PCR扩增的条件进行反复实验，最终实现五重PCR扩增。
[0021] 优选地，S2.中所述的PCR反应，其反应条件为：预变性94°C，3min ;30个循环：变 性 94°C，30sec，退火 62°C，30sec，延伸 72°C，lmin ;终止延伸 72°C，5min〇
[0022] 优选地，S2.中所述的PCR反应，其反应体系为25yL，含有2XMasterMix ;引物 Papain-F 和 Papain-R 分别为 0? 6 y L，引物 35s-F 和 35s-R 分别为 0? 5 y L，引物 NptII-F 和 NptII-R分别为0? 3 y L，引物RP-F和RP-R分别为0? 5 y L，引物CP-F和CP-R分别为0? 5 y L， 各引物的浓度为10 y M ;DNA模板为6 y L，浓度为20ng/ y L。
[0023] 优选地，S2.中使用的电泳为琼脂糖凝胶电泳。
[0024] 优选地，所述的琼脂糖凝胶电泳的方法为：取5yL PCR产物于质量体积比为2% 的琼脂糖凝胶，1 XTAE缓冲液中，稳压80V电泳30min。
[0025] 优选地，本发明所述的方法能同时对"Event 55-l"、"GM - YK"和"华农一号"三种 转基因番木瓜进行检测。
[0026] 优选地，S2.中所述的待检测番木瓜基因组DNA，通过以下方法提取得到：取每种 品种的新鲜番木瓜叶约l〇〇mg，加入液氮充分研磨，用DNA提取试剂盒提取各样品的DNA，用 紫外分光光度法来测定DNA提纯的浓度和纯度。
[0027] 有益效果：
[0028] 本发明多重PCR具有高效性、系统性、经济简便性。首次进行了以华农一号为研宄 对象的多重PCR研宄，并成功建立了检测番木瓜中转基因成分的五重PCR技术，检测限为 0. 2ng，达到了转基因番木瓜快速筛选的目的。
【附图说明】
[0029] 图1为单引物PCR验证图。其中，各条带对应情况如下：1.转基因番木瓜"GM-YK"； 2.转基因番木瓜"55-1" ；3.CP引物空白对照；4.转基因番木瓜"华农一号"；5.转基因番 木瓜"55-1" ;6.35S引物空白对照；7.转基因番木瓜"华农一号";8.转基因番木瓜55-1; 9. NPTII引物空白对照；10.转基因番木瓜"华农一号"；11.非转基因番木瓜"台农2号"； 12. Papain引物空白对照；13.转基因番木瓜"华农一号"1;14.转基因番木瓜"华农一号"2; 15. RP 空白对照；M. Marker。
[0030] 图2为1-5重PCR扩增结果图。其中，各条带对应情况如下：1.转基因番木瓜华 农一号（Papain引物）；2.转基因番木瓜"华农一号"（35s引物）；3.转基因番木瓜"华农 一号"（35s引物和NptII213引物）；4.转基因番木瓜"华农一号"（Papain引物、35s引物 和NptII213引物）；5.转基因番木瓜"GM-YK"（含CP基因）（五种引物）；6?转基因番木 瓜"华农一号"（含RP基因）（五种引物）；7转基因番木瓜GM-YK和"华农一号"混合（五 种引物）；8空白；M Marker。
[0031] 图3为五重PCR灵敏度验证图。其中，各条带对应情况如下：1.华农一号100ng ; 2.华农一号20ng ;3.华农一号5ng ;4.华农一号lng ;5.华农一号0. 2ng ; 6.华农一号 0? 05ng ; 7?空白对照；M. Marker。
【具体实施方式】
[0032] 以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对发明不做任何形式的限 定。
[0033] 本实施例中采用的单重和多重PCR技术检测转基因番木瓜的方法如下：
[0034] (1)待测试样品DNA的提取与纯化
[0035] 采用三种转基因番木瓜（Event55-1、GM-YK和华农一号）和非转基因番木瓜（台 农2号）的新鲜叶片，取每种品种的新鲜番木瓜叶约100mg，加入液氮充分研磨，用DNA提取 试剂盒提取各样品的DNA。紫外分光光度法来测定DNA提纯的浓度和纯度。
[0036] (2)特异性引物设计
[0037] 五对引物的序列如表1所示：
[0038] 表1检测转基因番木瓜内、外源基因的PCR引物
【主权项】
1. 一种利用多重PCR技术检测转基因番木瓜的方法，其特征在于，包含如下步骤：
51. 设计多重PCR的5对引物，分别为： Papain-F：ATCTACAATCTTGCTAACCCTA； Papain-R：AGTCATCTTGAGAATAACCCAC； 35s-F：AAGACGATCTACCCGAGCAA； 35s-R：GAAGCAAGCCTTGAATCGTC； NptII-F：CTGTGCTCGACGTTGTCACT； NptII-R：CTTCCATCCGAGTACGTGCT； RP-F：CTTTGGTGCGGAAAAGTTGT； RP-R：CCATAGCCCACAGTCGAATT； CP-F：AGAATGTTTGGAATGGACGG； CP-R：GCATACCCAGGAGAGAGTGC；
52. 检测：以待检测番木瓜基因组DNA为模板，在PCR反应中加入SI.设计的所有引物， 进行PCR、电泳，从而得知所检测的番木瓜是否为转基因番木瓜。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2.中所述的PCR反应，其反应条件为：预 变性94°C，3min;30个循环：变性94°C，30sec，退火62°C，30sec，延伸72°C，Imin;终止延伸 72〇C,5min〇
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S2.中所述的PCR反应，其反应体系为 25yL，含有 2XMasterMix;引物Papain-F和Papain-R分别为 0? 6yL，引物 35s-F和 35s-R 分别为〇? 5yL，引物NptII-F和NptII-R分别为0? 3yL，引物RP-F和RP-R分别为0? 5yL， 引物CP-F和CP-R分别为0. 5yL，各引物的浓度为10yM;DNA模板为6yL，浓度为20ng/ y L0
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，S2.中使用的电泳为琼脂糖凝胶电泳。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，琼脂糖凝胶电泳的方法为：取5yLPCR产 物于质量体积比为2%的琼脂糖凝胶，IXTAE缓冲液中，稳压80V电泳30min。
6. 根据权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，能同时对"Event55-1"、 "GM-YK"和"华农一号"三种转基因番木瓜进行检测。
7. 根据权利要求1~5任一项所述的方法，其特征在于，所述的多重PCR技术为五重 PCR技术。
【专利摘要】本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种利用多重PCR技术检测转基因番木瓜的方法。该方法包含如下步骤：S1.设计多重PCR的5对引物；S2.以待检测番木瓜基因组DNA为模板，在PCR反应中加入S1.设计的所有引物，进行PCR、电泳，从而得知所检测的番木瓜是否为转基因番木瓜。本发明多重PCR具有高效性、系统性、经济简便性，成功建立了检测番木瓜中转基因成分的五重PCR技术，检测限为0.2ng，达到了转基因番木瓜快速筛选的目的。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104694634
【申请号】CN201510075479
【发明人】白卫滨, 孙建霞, 文罗娜, 李名薇, 吴实, 胡云峰
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年2月12日