专利名称：一种低产尿素黄酒酵母的筛选方法
技术领域：
本发明属于生物与发酵工程领域。涉及一种低产尿素黄酒酵母的筛选方法，可以快速地 分离获得目的菌株，使产尿素低型菌株快速的从大量的处理细胞中分离出来，减少了选育过 程盲目性，增强了预见性，大大地提高了育种效率。
背景技术：
氨基甲酸乙酯(Ethyl Carbamate, EC),具有遗传毒性和致癌性，是被国际癌症研究机构 (IARC)确认的人类可能致癌物质(2A类)，美国国家毒理计划将其列入"有理由预料引起癌症 的物质"名单，自2002年以来，氨基甲酸乙酯已成为世界卫生组织重点监控物质之一，但受 多方面原因的限制，到目前我国仍没有制定有关EC的限量标准，造成黄酒、葡萄酒等发酵酒 中EC含量超标的问题非常突出，随着人民生活水平的提高及酒类产品出口的需要，如何降低 发酵酒中EC的含量正逐渐受到研究人员的重视。
通过以下三种途径可以降低黄酒中的氨基甲酸乙酯含量第一种途径是添加酸性脲酶使 尿素分解为氨和二氧化碳，尿酶纯度低是阻碍我国尿酶产业化的主要原因之一。由于尿酶添 加剂中含有大量的杂质，添加到酒中会造成二次污染，加大酒类安全风险。第二种途径是选 育低产尿素菌种，利用特殊酵母彻底地清除酒类产品中的尿素，阻止的氨基甲酸乙酯的前体 物生成。第三种途径是适当地控制发酵条件，发酵温度越高，测氨基甲酸乙酯的生成量越大； 随着PH值的上升，氨基甲酸乙酯的生成量也趋于升高，因此，控制一定的发酵温度，可以 适当降低酒中氨基甲酸乙酯的含量。在黄酒酿造时，只有选用产尿素低的酵母菌株，才能从 根本上解决黄酒中氨基甲酸乙酯含量超标的问题。因此选育低产尿素菌种对于降低黄酒中氮 基甲酸乙酯的含量至关重要。
发明内容
本发明的目的是提出一种利用包含刀豆氨酸的培养基筛选低产尿素黄酒酵母方法。刀豆 氨酸是一种尿酶抑制剂，本发明利用上述内容并基于精氨酸酶缺陷型菌株可以利用刀豆氨酸 作为氮源生长，而非目的菌株则会由于不能利用精氨酸而缺少氮源不能生长的发现，利用刀 豆氨酸筛选方法从大量的诱变菌中筛选出产尿素低的酵母菌落，还可以从现有已具有低产尿 素性质的酵母中筛选低产性能更好更稳定的酵母。本发明可将上游的菌株改造技术与最终的 菌株分离获得结合起来，在菌体经过改造处理后，可以快速的分离获得目的菌株，使产尿素 低产型菌株快速的从大量的处理细胞中分离出来，减少选育过程盲目性，增强预见性，提高育种效率。
本发明提出的低产尿素黄酒酵母的筛选方法，可由以下步骤组成
(1) 将被筛选酵母培养后接种至含有刀豆氨酸、精氨酸、鸟氨酸的初筛培养基中培养,30 'C培养3-4天。生长的菌落可初歩定为精氨酸酶缺陷型菌株；
(2) 挑取可在初筛培养基上生长的菌落，分别至精氨酸培养基，鸟氨酸培养基的复筛培 养基培养；
(3) 将初筛培养基中生长出的菌株采用牙签法分别挑入复筛培养基中，在精氨酸复筛培 养基中不能生长而在鸟氨酸培养基中可以生长的菌株即为本发明的低产尿素黄酒酵母菌株。
其中步骤(1)培养基成分及制备方法为琼脂培养基2g琼脂，2g葡萄糖，50ml超纯 水在115。C灭菌15min， 50'C水浴保温；氨基酸培养基刀豆氨酸lmg，精氨酸17. 4mg,鸟氨酸 66mg， YCB 1. 17g，超纯水50ml，过滤灭菌，于5(TC水浴保温；将两种培养基混合后，迅速 倒平板，以免凝固，即制得初筛培养基。
步骤(2)精氨酸培养基，鸟氨酸培养基复筛培养基成分为
a) 精氨酸培养基:0. 17%不含氮Yeast Carbon Base， 5 mmol/L的精氨酸，2%葡萄糖，2% 琼脂；
b) 鸟氨酸培养基0. 17。/。不含氮Yeast Carbon Base, 5 mmol/L的鸟氨酸，2%葡萄糖，2% 琼脂。
步骤(1)被筛选的酵母可为未经基因修饰的酵母、经过基因修饰的酵母或己具备一定低 产尿素性质的黄酒酵母。
为了验证由本发明方法筛选的低产尿素黄酒酵母菌株，对新获得的诱变菌株进行发酵培 养挑取上述筛选出的菌种一环；接入lOmL大米醪培养液中，30°C培养24小时；再将活 化好的试管中菌液全部接入装有300mL无菌大米醪的三角瓶中，用发酵栓密封，3(TC发酵9 天，每天称重，记录每日失重量，当单日失重量在0.2克以内表明发酵结束。待发酵结束后， 检测发酵液尿素含量。
本发明还提供一株经本发明筛选方法获得的黄酒酵母，该酵母菌是在筛选获得多批菌株 中，选取筛选后除具备低产尿素的性质外，还保留了原黄酒酵母本身的高酒精耐受力性能， 菌种于2009年1月12日保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏号为CGMCCNo. 2858。
本发明还涉及上述方法用于菌种改造后筛选低产尿素黄酒酵母的用途，以及上述酵母用 作制备黄酒原料的用途。本发明提供了能够从经过菌株改造的大量酵母菌中快速而高效的获得低产尿素的酵母菌 株。此筛选方法的建立为工业发酵生产低产尿素的酵母菌株的改造和筛选提供了有效手段， 在发酵工业中具有广阔的推广和应用前景。
木发明筛选方法，可对一般经诱变后的酵母进行，为保证筛选方法通常情况均可筛选到 目的菌株，可选择黄酒酵母较为集中的环境，或具有一定低产尿素性质的酵母进行突变、筛 选，本发明随机选择一黄酒厂获取菌种，并从中国食品发酵工业研究院微生物菌种平台购买 和之前使用的黄酒酵母菌中各选择了一个初步具备低产尿素性质的酵母菌株进行诱变、筛选。
具体实施例方式
选取三株黄酒酵母菌株作为出发酵母菌株进行诱变，这三株酵母菌株分别为..HJ-4，从 黄酒企业筛选；HJ-17购于CICC (中国食品发酵工业研究院微生物菌株平台)，，这一菌种初 步具备低产尿素性质。HJ1615，购于CICC (中国食品发酵工业研究院微生物菌株平台)，具 备高酒精耐受力性能。
实施例l
选取啤酒企业分离得到的黄酒酵母对其进行诱变
1.诱变方法
1) 出发菌株的活化将菌种HJ-4按3%的添加量接种于大米醪培养液中，3(TC摇床培养 18h,至酵母对数生长期，此时菌体活力最好，适合诱变。
2) 细胞悬液制备在3500r/min转速下离心活化好的菌液10min，收集菌体，用灭菌生 理盐水洗涤一次，旋涡混合器振荡10min，血球计数板计数菌体个数，再用生理盐水调整细 胞浓度使之成为106个/ml的菌悬液。
3) He-Ne激光诱变采用试管法进行He-Ne激光诱变取上述制备好的悬浮液，各200 u 1于小试管中进行激光照射。He-N e型激光辐射波长为632. 8nm、能量密度为17. 8mJ / cm2 的条件下，辐照60 min。
4) NTG诱变育种程序取He-Ne激光诱变所得到的尿素低产菌株为出发株，按照2. 2中 制备好酵母菌悬液，各吸上菌液4ml置于2支灭菌离心管中，存于3(TC水浴中待用。在灭菌 的离心管中各放入2.5、 5.0、 lO.OmgNTG，加入lralKH2P04—Na2HP04缓冲液，在超声波清洗 器中完全溶解后存放在3(TC水浴中待用。
将菌悬液倒入含有NTG的离心管中(此时NTG最终浓度是1 mg/ml),充分混匀后立即 放入30'C水浴之中，开始计算时!司；30min后从水浴中取出混合液，并立即以3500r/min进
5行离心。将离心后的上清废液倒0. lmol/L浓NaOH溶液中，将菌块打匀，补加生理盐水5ml， 再以3500r/min进行一次离心，倒去废液后添加无菌水5ml，制成酵母菌悬液。
将菌体悬浮于大米醪培养液中，3CTC震荡培养过夜，最后稀释到适合浓度，涂布于完全 培养基平板上，30'C培养60h。为了便于筛选，平板中的琼脂层较薄为好(约12mL)，培养的 菌落较大而且分散要好。
2) 菌种筛选
诱变后的菌液涂布初筛培养平板，3(TC培养3-4天，至菌落可见；挑取生长出的菌落转 移复筛培养平板(精氨酸培养基，鸟氨酸培养基)培养3-4天，其中在精氨酸培养基上不生 长而在鸟氨酸培养基上生长的菌株即为目的菌株。
3) 发酵栓实验
对新获得的诱变菌株进行发酵培养挑取上述筛选出的菌种一环；接入lOmL大米醪培 养液中，30'C培养24小时；再将活化好的试管中菌液全部接入装有300mL无菌大米醪的三 角瓶中，用发酵栓密封，30°C发酵9天，每天称重，记录每日失重量，当单日失重量在0.2 克以内表明发酵结束。待发酵结束后，检测发酵液尿素的含量。
4) 实验测定结果
通过He-Ne激光和亚硝基胍复合诱变黄酒酵母HJ1615，从中筛选分离得到4株产尿素量 远低于亲株的新菌株。对这四株突变株进行发酵栓实验，并测定其发酵综合性能，其中菌株 HJ-4—4在发酵力，总酸，酒精度以及风味物质等综合指标保持了亲株的优良性状，同时产 尿素的量为15.41mg/L低于出发菌株产尿素量50呢以上。通过5代以上发酵实验，表明遗传 性状稳定。
依照此实施例分别对4个不同酒厂的黄酒酵母进行了筛选，分别获得2-5株具备低产性 能的菌种。
实施例2
选取HJ-17菌株进行诱变；诱变与筛选方法与实施例l相同，^J获得分离并筛选、鉴别
得到3株低产尿素菌株,产尿素量低于出发菌株的15-20倍菌株。 实施例3
对HJ1615菌株进行诱变；诱变与筛选方法与实施例l相同，可筛选分离得到2株产尿素 量低于亲株10-15倍的菌株，其中1株HJ1615-D4保留了原有高酒精耐受力性能，保藏至中 国微生物菌种保藏管理委员会，保藏号为CGMCC No.2858。
权利要求
1、一种低产尿素黄酒酵母的筛选方法，包括以下步骤(1)将被筛选酵母培养后接种至含有刀豆氨酸、精氨酸、鸟氨酸的初筛培养基中培养；(2)挑取可在初筛培养基上生长的菌落，分别至精氨酸培养基，鸟氨酸培养基的复筛培养基培养；(3)选择在精氨酸复筛培养基中不能生长，而在鸟氨酸培养基中可以生长的菌株即为所筛选的菌株。
2. 权利要求1中筛选方法，其中初筛培养基包括琼脂培养基和氨基酸培养基，各培养基成分及制备方法 为琼脂培养基2g琼脂，2g葡萄糖，50ml超纯水在115'C灭菌15min， 50'C水浴保温；氨基酸培养 基刀豆氨酸lmg，精氨酸17. 4mg，鸟氨酸66mg, YCB 1. 17g，超纯水50ml，过滤灭菌，于5(TC水浴保 温；将两种培养基混合后，迅速倒平板，以免凝固，即制得初筛培养基。
3. 权利要求1所述筛选方法中精氨酸培养基，鸟氨酸培养基复筛培养基，成分为，a) 精氨酸培养基:0. 17%不含氮Yeast Carbon Base, 5 mmol/L的精氮酸，2%葡萄糖，2%琼脂；b) 鸟氨酸培养基0. 17%不含氮Yeast Carbon Base, 5 mmol/L的鸟氨酸，2%葡萄糖，2%琼脂。
4. 权利要求l-3所述任意一种筛选方法，还可以包括验证低产尿素黄酒酵母的步骤，该验证步骤方法为 将筛选获得的菌株接入大米醪培养液中活化培养；将活化好的菌液接入300mL无菌大米醪三角瓶中，用 发酵栓密封发酵，每天称重，记录每日失重量，当单日失重量在0.2克以内表明发酵结束；待发酵结 束后，检测发酵液尿素含量。
5. 权利要求l所述筛选方法，其中被筛选的酵母为未经基因修饰的酵母。
6. 权利要求l所述筛选方法，其中被筛选的酵母为经过基因修饰的酵母。
7. 权利要求7所述筛选方法，其中被筛选的酵母已具备一定低产尿素黄酒酵毋性质。
8. —种由权利要求1-7任意一种筛选方法获得的低产尿素黄酒酵母。
9. 权利要求8所述的黄酒酵母，优选为保藏号为CGMCC No. 2858的菌种。
10. 权利要求l-7任意一种筛选方法用于菌种改造后筛选低产尿素黄酒酵母的用途。
11. 权利要求8-9任意一种酵母用作制备黄酒原料的用途。
全文摘要
本发明公开了一种低产尿素的黄酒酵母的筛选方法。此方法利用刀豆氨酸平板，可以从经化学诱变剂诱变的黄酒酵母中筛选出产尿素低的酵母菌落，还可以从一般低产尿素的黄酒酵母菌落中，筛选低产性能更好的酵母菌落。使用本发明的筛选方法可以快速地分离获得目的菌株，减少了选育过程盲目性，增强了预见性，大大地提高了选育效率。筛选获得的黄酒酵母具备副产物尿素含量低的特点，可以有效降低黄酒生产中的氨基甲酸乙酯的含量。
文档编号C12N1/16GK101550401SQ200910077048
公开日2009年10月7日 申请日期2009年1月19日 优先权日2009年1月19日
发明者宋绪磊, 张彦青, 红 李, 王异静, 王德良 申请人:中国食品发酵工业研究院