专利名称：饵料用高sod活性海洋酵母的筛选方法
技术领域：
本发明所属微生物饵料研究开发技术领域。本发明涉及饵料用高SOD活性海洋酵母的筛选方法。本发明旨在快速高效地定向筛选获得高SOD活性的海洋红酵母以作为饵料用于养殖业。
背景技术：
超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)可清除机体代谢产生的超氧阴离子，广泛存在于生物体内。已有的研究表明，超氧化物歧化酶的活性与水产动物的免疫水平有密切关系，因而超氧化物歧化酶的活性常被用于判定水产养殖动物免疫性能的指标。酵母菌因其为真核动物，其细胞内所含超氧化物歧化酶与水产动物的超氧化酶相似，因而利用价值较大。贺华君等人将降解成多肽的无活性SOD和完整的SOD对ICR小鼠灌胃，发现降解后无活性的SOD能使红细胞中SOD活性升高而口服完整的SOD可经胃肠吸收进入红细胞而使其活性升高，这表明口服外源SOD对哺乳动物小鼠来说是有效的。因而，将高SOD活性的酵母应用于水产养殖以提高养殖动物的免疫能力在理论上是可行的。酵母菌菌体中富含蛋白质、维生素、生长因子等营养物质，适合性好。大部分酵母菌无毒，可以食用；并且可以利用工业废料进行大量培养以生产单细胞蛋白。因而，酵母菌作为生物饵料已被广泛应用于水产养殖业，特别是富含虾青素的海洋红酵母、红发夫酵母在水产养殖中的作用越来越受到人们的重视。动物摄食富含虾青素的红酵母，红发夫酵母可直接吸以酯化形式沉积于组织中，进而增加养殖动物的体色，提高观赏动物的观赏价值；还可增强水产动物对高氨和低氧的耐受性，清除自由基，抑制脂质过氧化，提高抗病能力。除此之外，超氧化物歧化酶在临床医药、食品、化妆品及农业等方面均有应用。因而，开发高SOD活性的海洋红酵母应用前景广阔。百草枯在体内可产生超氧阴离子，进而诱导机体抗氧化基因的表达提高。但目前因内有关百草枯的报道仅限于研究其中毒机理，尚未见有关百草枯对微生物胁迫的报道； 国外，AdriermeT. Black等研究表明小鼠角质化表皮细胞在有百草枯的存在下Cu，Zn-SOD 表达量提高。Fang-Jenlee等研究表明在百草枯存在条件下，酿酒酵母SOD生物合成量显著提高，但并未见有百草枯被用作筛选条件筛选高产SOD菌株的报道。鉴于目前高SOD活性的酵母菌的筛选大多是在大量的已有菌种中挑选SOD产量和生物量均较高的菌株，再用紫外线或EMS诱变，虽然这样可以获得高SOD的突变菌株，但是工作量大且由于突变的不确定方向性，很难将多个优良性状集于同一菌株。本发明就是在已有的研究基础上，经科学试验后，首次创新性的提出通过逐步提高百草枯浓度淘汰抗氧化活性较低菌株进而实现定向筛选高SOD活性菌株的目的，以期应用于水产养殖业及工业发酵生产SOD。
发明内容
本发明涉及饵料用高SOD活性海洋酵母的筛选，其特征在于其筛选的方法包括以下过程 步骤(一)菌种自己分离或向菌种保藏单位及生物技术公司等索要或采购；步骤(二)培养基葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂20g，链霉索300U/ mL,陈海水1000ml。调PH值4. 5-5. 0，高压灭菌20min。冷却至室温制成固体培养基；步骤(三)菌种活化和筛选将海洋红酵母菌接种于培养基上，20°C培养。挑取菌种于斜面上28°C活化三代后(每代24h)，挑取两环培养物接种于装有40mL液体培养基的150mL锥形瓶中，28°C摇床扩培24h ；步骤(四)将扩培后活化菌种以10%接种量接种至百草枯浓度为0. 25mmol/L的装有40mL液体培养基的150mL锥形瓶中。28°C、150r/min摇床培养3d ；步骤(五)重复步骤四将培养集中百草枯浓度由0.25mmol/L依次提高至0.3、 0. 35,0. 4,0. 45mmol/L,吕氏美蓝染色进行死活鉴定，最终经涂布分离得单菌株；步骤(六)菌种保藏将分离得到的单菌落划线接种至固体斜面培养，分别编号后，-20°C冰箱保藏；步骤(七)将分离获得的菌株发酵培养后以3000r/min离心15min后弃上清液， 再水洗两遍，每次以3000r/min离心lOmin，弃上清，收集得湿菌体；步骤(八)检测所分离菌株的SOD酶活性与初始菌株进行比较，发现所分离菌株的SOD酶活性显著提高。
具体实施例方式本发明所述的涉及饵料用高SOD活性海洋酵母的筛选方法包括以下实施例，下面的实施例可进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例步骤(一)菌种本实验所用海洋红酵母菌种购自大连健洋生物科技有限公司；步骤(二)培养基葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂20g，链霉素300UmL， 陈海水1000ml。调PH值4. 5-5. 0，高压灭菌20min。冷却至室温制成固体培养基；步骤(三)菌种活化和筛选将海洋红酵母菌接种于培养基上，20°C培养。挑取菌种于斜面上28°C活化三代后(每代24h)，挑取两环培养物接种于装有40mL液体培养基的150mL锥形瓶中，28°C摇床扩培24h ；步骤(四)将扩培后活化菌种以10%接种量接种至百草枯浓度为0. 25mmol/L的装有40mL液体培养基的150mL锥形瓶中。28°C、150r/min摇床培养3d ；步骤(五)重复步骤四将培养集中百草枯浓度由0.25mmol/L依次提高至0.3、 0. 35,0. 4,0. 45mmol/L,吕氏美蓝染色进行死活鉴定，最终经涂布分离得单菌株；步骤(六)菌种保藏将分离得到的单菌落划线接种至固体斜面培养，分别编号后，-20°C冰箱保藏；步骤(七)将分离获得的菌株发酵培养后以3000r/min离心15min后弃上清液， 再水洗两遍，每次以3000r/min离心lOmin，弃上清，收集得湿菌体；步骤(八)检测所分离菌株的SOD酶活性与初始菌株进行比较，发现所分离菌株的SOD酶活性显著提高。用百草枯筛选高SOD活性海洋红酵母的有效性试验
1菌种与试剂菌种(大连健洋生物科技有限公司)、百草枯(四川西亚化工股份有限公司)、邻苯三酚、异丙醇等均为分析纯。2方法与结果 2. ISOD提取及酶活测定用异丙醇浸泡所收集得到的湿菌体(异丙醇体积与湿菌体质量之比为9 1)选择性释放S0D，抽滤除去溶剂，加入3倍体积的50mmol/LPH为7. 0的磷酸缓冲液中搅拌两个小时，离心除去菌体即可得SOD释放液。微量邻苯三酚法检测SOD酶活性。2.2S0D酶活性比较以初始菌株作对照，将所得菌株分别在不加百草枯和百草枯浓度为0. 075mmol/L 的培养基中培养72h后分别检测各组SOD活性及虾青素含量(每组3个平行，结果以M士SD 表示)，结果如下表表1百草枯处理对海洋红酵母抗氧化性能的影响Table 1 The antioxidants of Rhodotorula marina treated with paraquat
S μ召承 W _ ” 一
ContrastTreatedTreated+paraquat
生物量(干重/g)0.182+0.002 0.120土0.015α 04± λ0( 3 “ 一 Biomass
SOD 比活(U/g)61.80±6.10 83.57±10.98126.87:1:13.90 SOD activity
SOD 总量(U/40ml)23.16±2.77 17.08±2.1420.89±0.77 SOD production
虾青素含量(ug/g)250.50±14.09 112.98±2.58106.31 土2,37 Astaxanthin content
虾青素产量(Pg/40ml)45.59±2.06 13.45土 1.7810.98土2.14 Astaxanthin production经单因素方差分析表明百草枯处理后，海洋红酵母的生物量、虾青素含量及产量均显著下降(P < 0. 05)；而处理后于0. 075mmol/L的百草枯浓度下培养的海洋红酵母的生物量及虾青素产量下降极显著(P < 0.01)。但是，经处理的海洋红酵母SOD比活升高 35. 2%，处理后于0. 075mmol/L的百草枯浓度下培养的海洋红酵母SOD比活升高103. 7%, 差异显著(P < 0. 05)。相对较高的百草枯胁迫可以淘汰大部分的海洋红酵母而筛选出SOD 活性较高的菌株；而相对较低的百草枯浓度(0. 075mmol/L)对海洋红酵母的生存无影响， 但却可以提高SOD活性。尽管百草枯是一种毒性较强的农药，但是由于所需量极少即可提高SOD活性，且其对鱼类等低毒；因而可以考虑将百草枯作为发酵条件研究，在提取SOD时去除百草枯即可或是考虑将酵母直接用于鱼类等的饵料。
通过上述试验，说明可以用百草枯胁迫来筛选高SOD活性菌株。
权利要求
1.本发明涉及饵料用高SOD活性海洋酵母的筛选，其特征在于其筛选的方法包括以下过程步骤(一)菌种自己分离或向菌种保臧单位及生物技术公司等索要或采购； 步骤(二)培养基葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂20g，链霉素300U/mL，陈海水1000ml。调PH值4. 5-5. 0，高压灭菌20min。冷却至室温制成固体培养基；步骤(三)菌种活化和筛选将海洋红酵母菌接种于培养基上，20°C培养。挑取菌种于斜面上28°C活化三代后(每代24h)，挑取两环培养物接种于装有40mL液体培养基的150mL 锥形瓶中，28 °C摇床扩培24h ； 步骤(四)将扩培后活化菌种以10%接种量接种至百草枯浓度为0. 25mmol/L的装有 40mL液体培养基的150mL锥形瓶中。28°C、150r/min摇床培养3d ；步骤(五)重复步骤四将培养集中百草枯浓度由0. 25mmol/L依次提高至0. 3,0. 35、 0. 4,0. 45mmol/L,吕氏美蓝染色进行死活鉴定，最终经涂布分离得单菌株；步骤(六)菌种保藏将分离得到的单菌落划线接种至固体斜面培养，分别编号后，-20°C冰箱保臧；
2.根据权利要求1所述的步骤，其特征是通过在培养基中添加百草枯并逐级提高百草枯浓度的方法以淘汰大部分的抗氧化能力较低的海洋红酵母菌株从而筛选出SOD活性较高的菌株，最终实现快速高效地定向筛选获得高SOD活性的洋红酵母以作为铒料用于养殖业的目的。
3.根据权利要求1所述的步骤，其特征是通过外加百草枯胁迫以定向筛选高SOD活性的海洋红酵母菌株。
全文摘要
本发明所属微生物饵料研究开发技术领域。本发明涉及饵料用高SOD活性海洋酵母的筛选方法。将海洋红酵母菌接种于培养基上(葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂20g，链霉素300U/ml，陈海水1000ml，调pH值4.5-5.0，高压灭菌20min，冷却至室温制成固体培养基)，20℃培养；挑取菌种于斜面上28℃活化三代后(每代24h)，挑取两环培养物接种于装有40ml液体培养基的150ml锥形瓶中，28℃摇床扩培24h；将扩培后活化菌种以10％接种量接种至百草枯浓度为0.25mmol/L的装有40ml液体培养基的150ml锥形瓶中28℃、150r/min摇床培养3d，并将培养集中百草枯浓度由0.25mmol/L依次提高至0.3、0.35、0.4、0.45mmol/L，吕氏美蓝染色进行死活鉴定，最终经涂布分离得单菌株；将分离得到的单菌落划线接种至固体斜面培养，分别编号后，-20℃冰箱保藏。本发明可快速高效地定向筛选获得高SOD活性的洋红酵母以作为饵料用于养殖业。
文档编号C12N1/16GK102220250SQ201110093079
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月1日 优先权日2011年4月1日
发明者关洪斌, 王晓兰, 王洛洋, 王璐思, 纪政, 胡宗仁 申请人:山东大学威海分校