专利名称：一株高效转化黄姜皂苷的菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明具体涉及利用菌株海洋红酵母( o￡/oiorw7a)ST_02高效转化黄姜中皂苷生产薯蓣皂苷元的方法，属于生物技术领域。
背景技术：
薯蓣皂苷元，Steroids留体类药物，是生产留体激素类药物的重要基础原料，被医药界称为“药用黄金”，药用价值非常重要和广阔。在世界的甾体医药原料的行业的历史中，我国的薯蓣皂苷元生产一直处于主导和垄断的地位，占领全世界留体医药原料的90%以上市场份额。留体激素类药物是在临床上具有重要应用的一类药物，具有很强的抗感染、抗过敏、抗病毒和抗休克的药理作用，是治疗风湿、心血管、淋巴白血病、细胞性脑炎、皮肤病、抗肿瘤和抢救危重病人的重要用药，也是仅次于抗生素的第二大类药物。目前薯蓣皂苷元的常用工业生产方法是用酸解的方法从黄姜(盾叶薯蓣)中提取，这种方法最大的弊端在于造成严重的环境污染。为响应可持续发展的生产要求，用微生物转化法结合酶解法生产薯蓣皂苷元以成为清洁生产领域最大的热门之一。经过一系列研究，木霉属和曲霉属的一些微生物已被发现可以进行生物转化，并且条件温和，环境友好，但转化效率低，副产物多，不符合工业生产的要求。如何提高微生物转化效率是目前清洁生产研究中的重大难题，海洋红酵母ben thica) ST-02菌株高效率转化黄姜中皂苷生成薯蓣皂苷元的特点，为工业生产薯蓣皂苷元带来了福音和广阔的市场前景。
发明内容
本发明的目的在于提 供一株高效转化产生薯蓣皂苷元的海洋红酵母(.Rhodotorula benthica) ST-02,以及利用该菌株转化生产薯菌阜苷元的方法,满足工业生
产高产率需求。本发明的发明人从实验室保存的真菌中筛选到一株转化产生薯蓣皂苷元的微生物，该菌于2012年11月19日保藏在位于北京市朝阳区大屯路的中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.6837，分类命名% Rhodo torula benthica。应用上述微生物转化黄姜中皂苷生产薯蓣皂苷元的方法，其步骤如下:
(1)采用保藏号为CGMCCN0.6837的菌株海洋红酵母benthica)
为生产菌种，按照常规方法进行活化培养得到种子液，将该种子液涂布到查氏培养基上；
(2)制备ST-2菌株的细胞液体培养物:挑取步骤(I)的查氏固体培养基上的ST-2菌株一环，接种于已灭菌的装有30-50 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，培养温度为30_40°C，置摇床上以150-200 r/min的转速培养20-24 h至对数生长中期，即得到ST-2菌株的细胞液体培养物；
(3)发酵培养:将步骤(2)中制备好的细胞液体培养物以5-9%(w/w)的接种量接入发酵培养基，装液量为500 mL锥形瓶中装50-100 mL发酵培养基，培养温度为25_40°C，在120-220 r/min的转速下培养20-24 h，得发酵液。(4)生物转化:精确称取适量黄姜皂苷，投入步骤(3)中的菌体发酵液，使其终浓度为3-5 g/L，在转化温度30°C，200-220 r/min的转速下转化144-168 h，即得转化液。(5)产物检测:将步骤(4)的转化液在10000-12000 r/min下离心10-15 min，沉淀用与转化液同体积的60 0C _90°C石油醚抽提2次，合并抽提液后于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现，乙腈复溶晶体并通过0.22 μ m的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析薯蓣皂苷元的含量。其中步骤(I)中所述的查氏固体培养基的成分及配比为:蔗糖30 g/L，硝酸钠3g/L，磷酸氢二钾I g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，氯化钾0.5 g/L，七水硫酸铁0.01 g/L，水1000 mL,自然pH。在121°C高压蒸汽下灭菌20min ;步骤(2)所述种子培养基的成分及配比为:蔗糖20 g/L，硫酸铵2 g/L，硝酸钠2 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸氢二钾I g/L，七水硫酸镁0.5 g/L，氯化钾0.5 8/1，七水硫酸铁0.01 g/L，水1000 mL，自然pH，在121°C高压蒸汽下灭菌20 min;步骤(3)所述发酵培养基的成分及配比为:蔗糖20 8/1，硫酸铵2.5 g/L,硝酸钠2.5 g/L，氯化钠4 g/L，磷酸氢二钾1.5 g/L，七水硫酸镁1.5 g/L，氯化钾0.5 g/L，七水硫酸铁0.01 g/L，黄姜皂苷3 g/L，，水1000 mL，自然pH，121°C高压蒸汽下灭菌20min。本发明所述的海洋红酵母Ae/ iAica)ST-02菌株首次发现可转化生成薯蓣皂苷元，并且能达到高产物得率的要求，是一株极具开发研究价值的生产菌株。
具体实施例方式实施例1醇提法得到黄姜皂苷
将鲜黄姜切成I Cm左右小块，80 °C烘干，粉碎机粉碎。圆底烧瓶中加入1000 ml无水乙醇，再倒入100 g黄姜粉末，加热至微沸，回流提取2次，每次4 h，过滤，合并滤液，旋转蒸发仪浓缩，得到醇溶皂苷。称取圆底烧瓶和皂苷的重量a，加入300 mL去离子水，超声使皂苷与水充分混溶，倒出皂苷，称量圆底烧瓶的重量b，a-b即是醇溶皂苷的重量。实施例2酶解法得到黄姜皂苷
称取100 g干黄姜粉，加入1000 mL水中，煮沸I h，冷却，调整pH为6.5，加入中温淀粉酶1.5 mL,65 °C温育I h。冷却后调整pH为6.0，加入耐高温淀粉酶1.0 mL,80 °C温育I h。冷却，调整pH为5.5，加入液体糖化酶2 mL，60 °C温育8 h。冷却，4000 rpm离心30min,取沉淀，60°C烘干至恒重，称重。实施例3得到黄姜皂苷
称取鲜黄姜312 g (约合100 g干黄姜)粉碎，磨浆。加去离子水300 mL洗涤，经两层纱布挤压过滤。滤渣加300 mL去离子水洗涤，重复过滤。①滤液静置6 h，物料分为3层，上层为清液(红褐色)，中间层为黄姜悬浊液，下层为淀粉(白色)。吸取上清液，倾倒悬浊液，可得到下层的淀粉，60 °C烘干称重。②滤渣，即纤维渣，重复水洗6次(每次用水200 mL)，得纤维素，105°C烘干，称重。水洗液抽滤，滤渣与①所得悬浊液合并。调整悬浊液PH为6，加入耐高温淀粉酶0.5 mL和糖化酶2 mL,60 °C酶解6 h。酶解结束后8000 rpm离心10 min，取沉淀60 °C干燥得皂苷，称重。
实施例4利用海洋红酵母(7 Ao￡/oiorw7a AefliAica ) ST-02转化产生薯菌阜苷元
(I)制备海洋红酵母0 oi/oioiT/7a ben thi ca) ST-02菌株的细胞液体培养物
挑取固体查氏培养基上的海洋红酵母( o￡/oiorw7a ben thica ) ST-02菌株一环,接种在装有30 mL种子培养基的250 mL锥形瓶中，30°C置于摇床上以200 r/min的转速培养
24-28 h至对数期，即制得该菌株的细胞液体培养物。(2)按以下配方及配比制备发酵培养基:蔗糖20 8/1，硫酸铵2.5 g/L，硝酸钠2.5g/L，氯化钠4 g/L，磷酸氢二钾1.5 g/L，七水硫酸镁1.5 g/L，氯化钾0.5 g/L，七水硫酸铁0.01 g/L,水1000 mL ,pH自然，121°C高压蒸汽下灭菌20 min。(3)摇瓶发酵:将上述步骤(I)制备的细胞液体培养物以5-9% (w/w)的接种量接种在装有已灭菌的30 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在30-40°C条件下，置于摇床上以150-200 r/min的转速培养，发酵12-24 h，菌体进入对数中后期。(4)生物转化:精确称取适量黄姜皂苷，投入步骤(3)中的菌体发酵液，使黄姜皂苷终浓度为4 g/L，在转化温度30°C，200-220 r/min的转速下转化100-120 h。实施例5石油醚提取转化产生的薯蓣皂苷元
10000-12000 r/min离心转化液15 min，取沉淀，加入石油醚(沸点60 °C 90 °C ) 20mL超声提取两次，每次4 h， 合并提取液，80 °C浓缩至20 mL左右。得到薯蓣皂苷元的石油醚溶液。
权利要求
1.一株高效转化黄姜中皂苷生产薯蓣皂苷元的菌株，该菌株为海洋红酵母iRhodo torula ben thica ) ST-02,保藏在位于北京市朝阳区大屯路的中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.6837，分类命名％ Rhodotorula AefliAica，保藏日期为2012年11月19日。
2.利用海洋红酵母知/ iAica)ST-02(保藏编号为CGMCC N0.6837)转化生产薯蓣皂苷元的方法，其特征为:500 mL三角瓶装50-100 mL的发酵培养基，接种量按体积比为5-9%，培养温度30-40°C，摇床转速150-200 r/min，培养24 h后投入一定量的底物黄姜皂苷，继续转120 h ;所用发酵培养基组成如下:葡萄糖20-40 g/L，NaNo3 0.3-1.7 g/L, (NH4)2SO4 0.3-1.7 g/L, NaCl 1.5-3 g/L, MgSO4 0.1-1 g/L, K2HPO4 0.1-1.0 g/L，FeS04.7H2O 0.01-0.10 g/L, pH 6.5-7.5，121°C 高压蒸汽下灭菌 20 min。
全文摘要
本发明具体涉及利用菌株海洋红酵母(Rhodotorulabenthica)ST-02高效转化黄姜中皂苷生产薯蓣皂苷元的方法，并且能达到高产物得率的要求，是一株极具开发研究价值的生产菌株。
文档编号C12R1/645GK103114047SQ201310040600
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月3日 优先权日2013年2月3日
发明者马洋, 许正宏, 史劲松, 徐起, 李会, 张佳佳, 张晓梅, 李恒 申请人:江南大学