专利名称：一种枯草芽孢杆菌及其微生态制剂和在动物饲料中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌，特别是公开一种含有该枯草芽孢杆菌的微生态制剂以及在动物饲料中的应用，属于生物技术领域。
背景技术：
饲料添加剂对强化饲料营养价值、改善饲料品质、节约饲料成本以及促进动物健康生长有非常重要的作用。抗生素被用作饲料添加剂后，为动物生产提供了一定的防疫保障，也给畜牧业带来了巨大的经济效益。但是随着社会的发展与科技的进步，利用抗生素作为饲料添加剂的弊端也逐步暴露，表现为病原微生物的抗药性逐渐增强，动物产品药物残留[1]，对人类的健康和生态环境的安全带来了潜在的威胁。因此，抗生素替代品益生菌制齐U、酸制剂、酶制剂以及一些复合生态制剂等的研究与应用，逐渐成为了畜牧工作者关注的
执占[2_5]。枯草芽孢杆菌是公认的肠道有益菌[6]，其代谢过程产生多种生物活性物质，作用表现为:
1、枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；
2、枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH值，间接抑制其它致病菌生长；
3、刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力；
4、枯草芽孢杆菌菌体自身合成a-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用；
5、能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性。枯草芽孢杆菌具有耐高温高压，利于饲料加工，易于贮存的特点，在动物生产中的应用一直是畜牧业科研人员研究的重点。目前我国饲料行业微生态制剂的生产菌种较为滞后，微生态制剂的生产较为单一 [7_8]，急需筛选出更多更优秀的菌种以满足畜牧业发展的需求。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有技术存在的问题，提供一种枯草芽孢杆菌及其微生态制剂和在动物饲料中的应用，本发明的枯草芽孢杆菌耐酸、耐碱，可较长时间承受一定程度的高温高压，可抑制大肠杆菌的生长繁殖。本发明含有上述枯草芽孢杆菌的微生态制剂能替代抗生素用于动物饲料，用以维持 动物肠道正常的微生物区系，从而促进动物生长、提高饲料报酬。。本发明是这样实现的:一种枯草芽孢杆菌，其特征在于:该枯草芽孢杆菌为2009年12月17日保藏在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的枯草芽孢杆^Bacillus subtilis,保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.3532。所述的枯草芽孢杆菌(.Bacillus subtilis) CGMCC N0.3532为革兰氏阳性菌，在LB培养基上的菌落为白色、扁平、表面粗糙、边缘不整齐，细胞直径小于I微米、细胞形态为杆状，形成芽孢但不产生伴孢晶体。在PH为5.(T8.5之间生长良好，在pH为3.5的环境中，培养5h内的存活率在90%以上，在pH为9.0的环境中，培养5h，存活率亦在85%以上。在90°C恒温水浴处理30分钟以后，存活率在70%以上。该枯草芽孢杆菌能够很好的适应动物消化道环境，对饲料加工过程的热处理不敏感，有利于制粒和膨化等工艺。—种含有枯草芽孢杆菌的微生态制剂，采用上述枯草芽孢杆菌在培养基中充分培养、发酵后得到的代谢产物与吸附剂、稀释剂混合均匀后，经烘干、粉碎后得到微生态制剂。所述枯草芽孢杆菌的制备方法:
菌株原种的分离培养:①固体平板培养基配方为蛋白胨log、酵母提取物5g、蔗糖25g、琼脂粉15 — 20g、氯化钠5g、加去离子水到总体积1000ml，培养条件为pH6_8、温度为35°C、培养24-48h !②液体培养基为蛋白胨10g、鹿糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氢二钾3g、硫酸镁0.5g、碳酸钙0.lg、加去离子水到总体积1000ml，挑取①得到的単菌落进行液体扩大培养，培养条件为PH6-8、温度为37°C、恒温摇床160rpm/min、培养15_18h ;③发酵培养基配方为玉米淀粉0.2%、豆柏0.1%、蔗糖0.5%、酵母提取物0.2%、磷酸氢二钾0.45%、硫酸镁
0.05%、氯化铁0.01%,2.8%浓度的硫酸锰溶液0.1%，接种②得到的培养基菌液混合液3-5%进行发酵培养，培养条件为PH6-8、温度为35°C、发酵罐搅拌器转速120rpm/min，发酵时间为 30-84h。、
所述的吸附剂为特制二氧化硅，所述的稀释剂为轻质碳酸钙、麸皮、次粉、玉米芯料和米糠中的任何一种或一种以上的组合。所述培养、发酵后 得到的代谢产物与吸附剂、稀释剂以质量比1:1:2比例混合。所述枯草芽孢杆菌微生态制剂在动物饲料中的应用，包括动物日粮和枯草芽孢杆菌微生态制剂，所述的枯草芽孢杆菌微生态制剂在动物饲料中的添加量为动物饲料重量的
0.05%-0.15%。饲用动物包括单胃动物、反刍动物以及水产动物。本发明的有益效果是:本发明的枯草芽孢杆菌心subtilis ) CGMCCN0.3532具有耐酸、耐碱、耐热、抑制肠道有害菌群(如大肠杆菌)的生长和繁殖，该枯草芽孢杆菌制剂作为动物饲料添加剂，可替代现有动物饲料中的抗生素，可改善动物胃肠道微生物区系、促进动物健康生长、增强动物免疫机能、提供营养因子、提高饲料转化率、促进营养物质的吸收、降低动物腹泻率，可提高仔猪、仔鸡的生产性能。本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )CGMCC N0.3532及其微生态制剂无耐药性，不会对环境造成破坏，也不会对人类的健康造成危害，是一种环境友好型微生态饲料添加剂。保藏说明
菌株:枯草芽抱杆菌subtilis 保藏日期:2009年12月17日
保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号 保藏编号:CGMCC N0.353具体实施例方式以下结合实施例详细介绍本发明的枯草芽孢杆菌(^3ci77tts subtilis ),保藏号:CGMCC N0.3532微生态制剂在实际生产中的应用效果。实施例1:
本实施例为保藏号为CGMCC N0.3532的枯草芽孢杆菌的筛选过程，具体步骤如下:
(I)、菌种的初步筛选
取仔猪十二指肠、回肠和直肠内容物进行生物筛选。将所取的肠道内容物在80-90°C的水域中热处理15分钟，用灭菌去离子水分别作I倍稀释、5倍稀释、10倍稀释、20倍稀释、100倍稀释、1000倍稀释后，LB培养基平板培养。筛选用LB 培养基，既蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g、琼脂粉15_20g，加去离子水IOOOmL, 115°C高压灭菌15min。(2)、菌种的复筛
将初筛出的枯草芽孢杆菌在液体培养基中培养，培养基配方为液体培养基为蛋白胨10g、鹿糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氢二钾3g、硫酸镁0.5g、碳酸|丐0.lg、加去离子水到总体积1000ml，37°C、210rpm恒温摇床培养15_18h。将得到的菌液在80°C水浴中处理5min后复筛，复筛培养基为:蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化钠5g、蔗糖25g、琼脂粉15-20g,加去离子水IOOOmL, 115°C高压灭菌15min。(3)、菌种耐酸碱的实验
将复筛得到的枯草芽孢杆菌菌液分别在PH为3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,6.0,6.5,7.0、
7.5、8.0、8.5、9.0、10.0的液体LB培养基中培养5h后，该枯草芽孢杆菌在pH为3.5处理组中存活率为91.5%，在pH为9.0处理组中存活率为86.2%。实施例2:
将实施例1所得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )，保藏号:CGMCC N0.3532接种于固体斜面培养基上，所述固体斜面培养基配方为:蛋白胨10g、酵母提取物5g、蔗糖25g、琼脂粉15 — 20g、氯化钠5g、加去离子水到总体积1000ml，35°C恒温培养36h，得到种子培养物接种于液体培养基中扩大培养，培养基配方为:蛋白胨10g、蔗糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氢二钾3g、硫酸镁0.5g、碳酸|丐0.lg、加去离子水到总体积1000ml,37°C、160rpm/min恒温培养15_18h,取得到的菌液按体积比3_5%于发酵培养基中培养,发酵培养及配方为玉米淀粉0.2%、豆柏0.1%、蔗糖0.5%、酵母提取物0.2%、磷酸氢二钾0.45%、硫酸镁0.05%、氯化铁0.01%,2.8%浓度的硫酸锰溶液0.1%，35°C、发酵罐搅拌器转速120rpm，发酵时间为72h，将得到的培养物与二氧化硅和轻质碳酸钙按1:1:2重量比混合，经干燥、粉碎得到枯草芽孢杆菌微生态制剂。实施例3:
将实施例:1所得的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis )，保藏号:CGMCC N0.3532接种于固体斜面培养基上，所述固体斜面培养基配方为:蛋白胨10g、酵母提取物5g、蔗糖25g、琼脂粉15 — 20g、氯化钠5g、加去离子水到总体积1000ml，35°C恒温培养36h，得到种子培养物接种于液体培养基中扩大培养，培养基配方为:蛋白胨10g、蔗糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氢二钾3g、硫酸镁0.5g、碳酸I丐0.lg、加去离子水到总体积1000ml, 37°C、160rpm/min恒温培养15_18h,取得到的菌液按体积比3_5%于发酵培养基中培养,发酵培养及配方为玉米淀粉0.2%、豆柏0.1%、蔗糖0.5%、酵母提取物0.2%、磷酸氢二钾0.45%、硫酸镁
0.05%、氯化铁0.01%、2.8%浓度的硫酸锰溶液0.1%，35 °C、发酵罐搅拌器转速120rpm，发酵时间为72h，将得到的培养物与二氧化硅和麸皮按1:1:2的重量比混合，经干燥、粉碎得到枯草芽孢杆菌微生态制剂。实验例:
本实验例是实施例2所得到的枯 草芽孢杆菌微生态制剂对仔猪生产性能的影响，用日龄一致、体重接近的杜长大断奶仔猪60头，观察枯草芽孢杆菌微生态制剂对仔猪生产性能的影响。仔猪分三个试验组，试验I组，为对照组，试验II组饲喂基础日粮和添加0.05%的枯草芽孢杆菌微生态制剂，处理III组饲喂基础日粮和添加0.1%的枯草芽孢杆菌微生态制剂。I材料与方法
1.1微生态制剂
枯草芽孢杆菌微生态制剂，采用实施例2的枯草芽孢杆菌制剂。1.2试验动物
选择日龄一致、体重接近的(杜长大)断奶仔猪60头，公母各半，按完全随即分组设计分为3组，每组5个重复，每个重复4头仔猪，公母分开饲喂。1.3试验日粮
试验分为3个处理组，即对照组(饲喂基础日粮+55mg/kg金霉素)，试验I组(饲喂基础日粮+0.05%的枯草芽孢杆菌微生态制剂)，试验II组(基础日粮+0.1%的枯草芽孢杆菌微生态制剂)。基础日粮原料组成及营养成分见表I。表I为试验基础日粮组成及营养水平比较表。
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于:该枯草芽孢杆菌为2009年12月17日保藏在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的枯草芽孢杆菌Bacillus保藏中心登记入册编号:CGMCC N0.3532。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌，其特征在于: 1)在pH为3.5的环境中，培养5h内的存活率在90%以上； 2)在pH为9.0的环境中，培养5h，存活率亦在85%以上； 3)在90°C恒温水浴处理30分钟以后，存活率在70%以上。
3.一种含有权利要求1或2所述枯草芽孢杆菌的微生态制剂，其特征在于:枯草芽孢杆菌在培养基中经 充分培养、发酵之后所得到的代谢产物与吸附剂/稀释剂按1:1:2比例混合，经烘干、粉碎后得到的微生态制剂，所述的吸附剂为特制二氧化硅，所述的稀释剂为轻质碳酸钙、麸皮、次粉、玉米芯料和米糠中的任意一种或一种以上的组合。
4.根据权利要求3所述的枯草芽孢杆菌微生态制剂，其特征在于:所述培养过程将枯草芽孢杆菌接种于液体培养基中进行扩大培养。
5.根据权利3或4所述枯草芽孢杆菌的微生态制剂，其特征在于:所述的液体培养基为适合枯草芽孢杆菌生长的任何培养基，其优选培养基配方为:蛋白胨10g、蔗糖25g、酵母提取物10g、尿素lg、磷酸氢二钾3g、硫酸镁0.5g、碳酸钙0.lg、加去离子水到总体积IOOOml0
6.根据权利3所述枯草芽孢杆菌的微生态制剂，其特征在于:所述的发酵培养基为适合枯草芽孢杆菌生长的任何培养基；其优选培养基配方为:玉米淀粉0.2%、豆柏0.1%、蔗糖0.5%、酵母提取物0.2%、磷酸氢二钾0.45%、硫酸镁0.05%、氯化铁0.01%,2.8%浓度的硫酸锰溶液0.1%。
7.根据权利3-6中任意一项所述枯草芽孢杆菌的微生态制剂,其特征在于:所述培养基是在温度为35-37°C的条件下，培养15-72h ;其优选枯草芽孢杆菌接种于固体斜面培养基,在35°C的恒温培养箱中，培养36h作为种子培养物，所述的种子培养物接种于液体扩大培养基，在温度为35-37°C下，培养15-18h ;扩大培养的代谢产物接种到发酵培养基中培养，在35°C下，培养72h。
8.一种含有权利要求3-7中任一项所述枯草芽孢杆菌微生态制剂在动物饲料中的应用，包括动物日粮和枯草芽孢杆菌微生态制剂，所述的枯草芽孢杆菌微生态制剂在动物饲料中的添加量为动物饲料重量的0.05%-0.15%。
9.根据权利要求8所述的枯草芽孢杆菌微生态制剂在动物饲料中的应用，其特征在于:所述的枯草芽孢杆菌微生态制剂在动物饲料中的添加量优选为动物饲料重量的0.1%。
10.根据权利要求8所述的枯草芽孢杆菌微生态制剂在动物饲料中的应用，其特征在于:所述动物日粮包括猪用日粮、鸡用日粮、水产动物用日粮和反刍动物用日粮。
全文摘要
本发明为一种枯草芽孢杆菌及其微生态制剂和在动物饲料中的应用，其特征在于该枯草芽孢杆菌为2009年12月17日保藏在《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心》的枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，保藏中心登记入册编号CGMCCNo.3532。枯草芽孢杆菌在培养基中经充分培养、发酵之后所得到的代谢产物与吸附剂和稀释剂按1:1:2比例混合，经烘干、粉碎后得到的微生态制剂，所述的吸附剂为特制二氧化硅，所述的稀释剂为轻质碳酸钙、麸皮、次粉、玉米芯料和米糠中的任意一种或一种以上的组合。所述的枯草芽孢杆菌微生态制剂在动物饲料中的添加量为动物饲料重量的0.05%-0.15%，提高动物免疫机能，可有效替代抗生素。
文档编号C12N1/20GK103087964SQ201310040239
公开日2013年5月8日 申请日期2013年2月1日 优先权日2013年2月1日
发明者王海东, 潘宝海, 陈 峰 申请人:上海三维同力生物科技有限公司