专利名称：：预防仔猪腹泻的微生态制剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种预防仔猪腹泻的微生态制剂，属于动物微生态制剂的应用及制备
技术领域：
。技术背景目前我国畜牧业规模化饲养比例已达80%。在规模化养殖过程中常出现大面积畜禽的腹泻。尤其是幼畜由于自身肠道微生物平衡建立需要一个过程，因此在建立过程中抵抗力弱，更易发生腹泻，且抗生素的使用效果不理想，由此造成大量死亡，给养殖户带来较大的经济损失。研究发现，通过人工添加肠道益生菌可以帮助仔猪建立肠道微生态平衡，增加幼畜的抵抗力。目前的研究致力于益生菌的种类及使用效果上。国外对人肠道多形拟杆菌的研究表明拟杆菌是人肠道的优势菌群，是肠道微生物中数量最多的厌氧菌，在肠道微生态平衡的建立中起着重要的作用。在其它哺乳动物肠道内也发现类似的结论，而且腹泻和拟杆菌数量的下降有明显的关系。现有技术中用于幼畜腹泻的微生态制剂主要是乳酸杆菌、双歧杆菌、芽孢杆菌和酵母菌等益生菌。上述产品存在的主要问题是对仔猪腹泻的防治效果不明显且效果不稳定。
发明内容本发明的目的在于提供一种预防仔猪腹泻的微生态制剂。本发明的目的还在于提供一种预防仔猪腹泻的微生态制剂的制备方法。本发明的构思如下从健康仔猪的肠道内容物中分离拟杆菌属的菌株，经过纯化、鉴定，安全性实验后，经发酵、离心得到湿菌体，和已知的益生菌乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、啤酒酵母菌根据肠道微生物好氧菌和厌氧菌的比例混合，经过海藻酸钠包备制成微囊。通过人工喂养，帮助仔猪建立肠道微生态平衡，提高免疫力，从而可以预防仔猪腹泻的发生。本发明所述的预防仔猪腹泻的微生态制剂的组成以活菌的数量比表示为猪拟杆菌乳酸杆菌啤酒酵母菌枯草芽孢杆菌=(65):(43):(21):(21),且每克产品的活菌总数大于l(T个，其中，所说的猪拟杆菌是采用以下方法制备的从健康仔猪的肠道内容物中分离拟杆菌属的菌株，经过纯化、鉴定，确定为猪拟杆菌，安全性实验后，保藏备用；制备方法采用二级厌氧分批发酵，种子培养基配方为胰酶解酪蛋白15.0g，脂胨5.0g，酵母浸膏5.0g，牛肉膏5.0g，葡萄糖5.0g，氯化钠5.0g，KH2P042.5g，可溶性淀粉3.0g，L-cys盐酸盐0.5g，质量百分数为0.5%氯化血红素lmL，质量百分数为1。/。维生素Kr溶液0.1mL，加水到1000mL，PH7.27.4;发酵培养基是将种子培养基中的L-cys盐酸盐增加到0.8g，氯化血红素增加到2mL，维生素Id增加到0.2mL，加水到1000mL，PH7.27.4。用质量分数为3%5%的接种量接种，37'C厌氧培养45h48h，得到浓度大于1()W个/mL发酵液，经过2000转/分钟的离心机处理20分钟，得到猪拟杆菌的湿菌体。本发明所说的预防仔猪腹泻的微生态制剂的制备方法包括以下步骤(1)制备猪拟杆菌的菌体；(2)猪拟杆菌、乳酸杆菌、啤酒酵母菌、枯草芽孢杆菌用活菌数计数法进行计数，得到活菌的数量，然后按比例混合，用海藻酸钠包被，低温干燥，制成微囊，即得微生态制剂成品。本发明中，乳酸杆菌、啤酒酵母菌、枯草芽孢杆菌均为已知菌种，市场可以购得，或采用常规方法制备即可。本发明取得的积极效果是将肠道的优势菌猪拟杆菌用于微生态制剂；并根据肠道微生物的好氧菌及厌氧菌的比例，将猪拟杆菌、乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌四种益生菌混合制成有一定比例的益生菌微生态制剂，快速有效的建立仔猪肠道微生态平衡。与其它类似微生态制剂的最大区别就是将肠道优势菌猪拟杆菌用于微生态制剂，其次是将多种益生菌按照肠道微生态平衡所需的不同数量制备有一定比例的微生态制剂，避免了同类产品益生菌种类不完全、比例不合适造成的效果不稳定等缺点。具体实施方式以下实施例用于说明本发明。实施例1一种预防仔猪腹泻的微生态制剂，其组成按活菌数比表示为猪拟杆菌乳酸杆菌啤酒酵母菌枯草芽孢杆菌=5.8:3.8:1.9:1.8，且每克产品的活菌总数1.3Xl(T个/g。其制备方法是(1)猪拟杆菌湿菌体的制备猪拟杆菌湿菌体的制备采用的是二级厌氧分批发酵。种子培养基具体配方为胰酶解酪蛋白15.0g，脂胨5.0g，酵母浸膏5.0g，牛肉膏5.0g，葡萄糖5.0g，氯化钠5.0g，KH2P042.5g，可溶性淀粉3.0g，L-cys盐酸盐0.5g，质量分数为0.5%的氯化血红素溶液lmL，质量分数为1%的维生素^溶液O.lmL，加水到1000mL,PH7.2。发酵培养基发酵培养基是将种子培养基中的L-cys盐酸盐增加到0.8g，氯化血红素增加到2mL，维生素K^增加到0.2mL，加水到1000mL，PH7.2。以质量分数为3%的接种量接种，37。C厌氧培养45h。得到浓度为5X1()W个/mL左右的发酵液。经过2000转/分钟的离心离心20分钟，得到湿菌体，湿菌体干燥处理。(2)啤酒酵母菌湿菌体制备啤酒酵母菌湿菌体制备采用的是二级补料分批发酵。种子配方为葡萄糖40g，酵母膏5g，硫酸胺2g，磷酸二氢钾lg，加水到1000mL，pH自然。种子培养18小时，以质量分数为2%的接种量接种到发酵罐中。发酵配方为葡萄糖20g，酵母膏5g，硫酸胺2g，磷酸二氢钾lg，加水到1000mL，pH自然。在发酵过程中根据残糖、残氮流加补料液。控制参数为pH控制4.5，培养温度3(TC，罐压0.03Mpa，通气比1:Q.6l:1，溶氧控制70%85%，发酵周期为18小时，得到菌体浓度为1(T个/mL的发酵液，经2000转/分钟离心机处理20分钟得到湿菌体。(3)枯草芽孢杆菌湿菌体的制备枯草芽孢杆菌湿菌体的制备采用的是二级补料分批发酵。种子培养基酵母浸膏10g，葡萄糖20g，CaC0320g，加水到1000mL。种子培养24h，以质量分数为3%5%的接种量接种。发酵培养基葡萄糖IO，酵母膏10g，CaCO310g，pH7.2。流加培养基葡萄糖15g，酵母膏5g加水到1000mL。葡萄糖和酵母膏制成混合液一起流加。发酵8h开始流加。培养温度为34。C，发酵周期为34h。得到菌体浓度为3X1(^个/mL的发酵液，经过2000转/分钟的离心20分钟，得到湿菌体。(4)乳酸杆菌湿菌体的制备乳酸杆菌湿菌体制备采用的是二级厌氧分批发酵。种子配方为MRS培养基胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸铵2g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾2g，乙酸钠5g，吐温-801g，硫酸镁0.5g，硫酸锰0.2g，琼脂20g，加水到1000mL，pH6.4。种子培养时间为18h。发酵培养基为葡萄糖20g，牛肉膏10g，柠檬酸钠5g，土温-800.5g，氯化钠2.5g，硫酸镁lg，胡萝卜汁50mL，L-半胱氨酸盐酸盐0.1g，加水到1000mL，初始pH6.5，以质量分数为5%的接种量接种，发酵温度37"C，厌氧培养40h。得到菌体浓度为2.3X1()W个/mL酸的发酵液。经过2000转/分钟的离心20分钟，得到湿菌体。(5)微囊制备上述四种湿菌体，稀释、活菌计数、按比例混合，得混合菌液，混合菌液和海藻酸钠混合，海藻酸钠为质量分数为3%的终浓度，将海藻酸钠滴入质量分数为2%的氯化钙中，固化30分钟，离心得到湿微囊，45'C低温干燥7小时，得到预防仔猪腹泻的微生态制剂产品。产品性能为产品效力以产品中各种菌的活菌数表示(个/g)。每克产品活菌总数为1.3X10"个/g，其中猪拟杆菌为5.8Xl(f个/g，乳酸杆菌为3.8Xl(f个/g，啤酒酵母菌及枯草芽孢杆菌分别为1.9Xl(^个/g和1.8Xl(f个/g。本发明的预防仔猪腹泻的微生态制剂的使用方法是；仔猪从出生后吃第一次初乳前，从U腔灌服微囊制剂2g，每日一次至7日龄。1周后，按质量分数为0.3%的加量将微囊制剂混入饲料中饲喂至60日龄。其产生的效果是2007年初到2007年6月的时间里，在河北省栾城进行了喂养实验。实验仔猪为分娩日期相同或接近，母猪分娩后，按每窝实产仔猪数分为两组，窝间不混群，初生体重基本相同，共401头。实验分成二组，其中l组为试验组，共200头仔猪，2组为对照组，共201头。试验组按照使用方法进行喂养，对照组从补料开始在饲料中按常规喂养方法添加各种药物，至60曰龄。(1)其对仔猪增重的效果见表l。(2)其对仔猪腹泻的预防效果见表2。表l.仔猪增重统计表组总头数体重(Kg)别初生重1周2周3周4周5周60天试验组2001.41±0.082.39土0.494.01±0.325.79±0.408.08±0.359.%士0.3517.82±0.53对照组2011.36±0.142.25土0.233.59±0.194.98±0.306.86±0.418.54±0.2315.45±0.35比较(％)3.686.2211.6916.3617.7816.6315.34表2.试验组与对照组仔猪发病率、死活率统计表组别头数发病头数发病率(%)死亡数死亡率(％)试验组2003919.5094.50对照组2019547.264321.39实施多il2一种预防仔猪腹泻的微生态制剂，其组成按活菌数比表示为猪拟杆菌、乳酸杆菌、啤酒酵母菌、枯草芽孢杆菌=5,9:3.7:1.4:1.4，每克产品的活菌总数为1.24Xl(T个/g。其制备方法与实施例l相同。产品性能为产品效力以产品中各种菌的活菌数表示(个/g)。每克产品活菌总数为1.24X10"个/g，其中猪拟杆菌为5.9Xl()9个/g，乳酸杆菌为3.7Xl()9CFU/g，啤酒酵母菌及枯草芽孢杆菌分别在1.4Xl(^CFU/g和1.4X109CFU/g。使用方法同实施例1。其产生的效果是2007年7月到2007年12月的时间里，在河北省栾城进行了喂养实验。具体方法同实施l。(1)其对仔猪增重的效果见表3。(2)其对仔猪腹泻的预防效果见表4。表3.仔猪增重统计表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4.试验组与对照组仔猪发病率、死活率统计表<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>权利要求1、一种预防仔猪腹泻的微生态制剂，其特征在于其组成以活菌数的数量比表示为猪拟杆菌∶乳酸杆菌∶啤酒酵母菌∶枯草芽孢杆菌＝(6～5)∶(4～3)∶(2～1)∶(2～1)；且每克产品的活菌总数大于1010个；其中，所说的猪拟杆菌是采用以下方法制备得到的(1)从健康仔猪的肠道内容物中分离拟杆菌属的菌株，经过纯化、鉴定，确定为猪拟杆菌，安全性实验后，保藏备用；(2)制备方法采用二级厌氧分批发酵，种子培养基配方为胰酶解酪蛋白15.0g，脂胨5.0g，酵母浸膏5.0g，牛肉膏5.0g，葡萄糖5.0g，氯化钠5.0g，KH2PO42.5g，可溶性淀粉3.0g，L-cys盐酸盐0.5g，质量分数为0.5％的氯化血红素1mL，质量百分数为1％维生素K1溶液0.1mL，加水到1000mL，PH7.2～7.4；发酵培养基是将种子培养基中的L-cys盐酸盐增加到0.8g，氯化血红素增加到2mL，维生素K1增加到0.2mL，加水到1000mL，PH7.2～7.4，以质量分数为3％～5％的接种量接种，37℃厌氧培养45h～48h，得到浓度为大于1010个/mL发酵液，经过2000转/分钟的离心机处理20分钟，得到猪拟杆菌的湿菌体。2、如权利要求l所述的预防仔猪腹泻的微生态制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)制备猪拟杆菌；a、从健康仔猪的肠道内容物中分离拟杆菌属的菌株，经过纯化、鉴定，确定为猪拟杆菌，安全性实验后，保藏备用；制备方法采用二级厌氧分批发酵，种子培养基配方为胰酶解酪蛋白15.0g，脂胨5.0g，酵母浸膏5.0g，牛肉膏5.0g，葡萄糖5.0g，氯化钠5.0g，KH2P042.5g，可溶性淀粉3.0g，L-cys盐酸盐0.5g，质量分数为0.5%的氯化血红素lmL，质量百分数为1。/。维生素K!溶液0.1mL，加水到1000mL，PH7.27.4;发酵培养基是将种子培养基中的L-cys盐酸盐增加到0.8g，氯化血红素增加到2mL，维生素Id增加到0.2mL，加水到1000mL，PH7.27.4，以质量分数为3%5%的接种量接种，37'C厌氧培养45h48h，得到浓度为大于101()个/mL发酵液，经过2000转/分钟的离心机处理20分钟，得到猪拟杆菌湿菌体；b、猪拟杆菌、乳酸杆菌、啤酒酵母菌、枯草芽孢杆菌用活菌数计数法进行计数，得到活菌的数量，然后按比例混合，用海藻酸钠包被，低温干燥，制成微囊，即得成品。全文摘要本发明公开了一种预防仔猪腹泻的微生态制剂及其制备方法。本发明的组成为，猪拟杆菌、乳酸杆菌、啤酒酵母菌、枯草芽孢杆菌四种益生菌的活菌数量比为(6～5)∶(4～3)∶(2～1)∶(2～1)，且每克产品的活菌总数1.3×10<sup>10</sup>个/g。本发明在考虑肠道中好氧微生物及厌氧微生物比例的基础上设计了不同益生菌的比例，同时添加了肠道中的优势菌猪拟杆菌，对腹泻预防效果稳定、明显。该微生态制剂不仅能有效、快速的在仔猪体内建立微生态平衡，减少抗生素的使用，还能缩短仔猪对饲料的适应期，降低仔猪死亡率，提高仔猪免疫力和饲料利用率，增加养殖效益。文档编号A61P1/12GK101229196SQ20081005443公开日2008年7月30日申请日期2008年1月14日优先权日2008年1月14日发明者任宏伟,薇刘,吴彦彬,李亚丹,李小俊,裴艳涛,边艳青申请人:河北师范大学