专利名称：一种培养筛选微生物菌种的方法
技术领域：
本发明涉及微生物菌种的筛选方法，具体是对极端环境样品中微生物菌 种的筛选分离培养方法。
技术背景微生物特别是极端环境(如酸/碱/温/冷/盐样品、深海样品、火山口样品、 高海拔样品、太空样品等)中的微生物，在自然生物、地球化学循环等方面 扮演着极为重要的角色。研究极端环境微生物不仅有助于我们了解和认识生 命起源与生命进化，极端环境的耐受机制以及其与环境之间的相互作用等； 而且其基因资源、酶资源及其代谢产物资源产业被称为21世纪可持续发展的 朝阳产业。微生物菌种资源，特别是具有特殊价值的菌种资源的争夺已成为 当今国际生物资源争夺的一个重要组成部分。微生物种类繁多、分布极为广泛，但目前受技术的限制，超过99%的微 生物是未知的，或在当前认识水平或试验条件下是"不可培养的"。为此，研究 建立新的微生物培养与选育方法，突破传统微生物培养方法的制约，以获得 更多的微生物的种类，是当今微生物工作者迫切需要解决的问题。近年来， 微生物分子生态学技术、宏基因组技术、生物信息技术、地球化学物质循环 分析相关技术及多学科强交叉学科平台的形成等，这些为建立新的微生物培 养与选育方法提供了强力的支持。发明内容本发明的目的是提供一种从各类样品中筛选所含微生物菌种的方法，即 通过建立样品中各类微生物的个性化富集培养体系，来富集分离样品中的微 生物菌种。本发明微生物菌种培养筛选方法的详细技术方案包括以下步骤1) 样品处理及DNA抽提溶解洗涤样品，收集菌体颗粒物质，去杂质， 收集沉淀物；酚一氯仿一异戊醇抽提沉淀物中的DNA;2) PCR扩增，克隆、酶切、测序及序列分析，检测样品中微生物种类多 样性分别采用细菌、古细菌和真菌通用引物扩增DNA抽提物，扩增产物经 凝胶电泳检测后用凝胶回收试剂盒纯化，纯化产物连接克隆后通过蓝白筛选阳性克隆子；再对阳性克隆子进行克隆序列的扩增，扩增产物经酶切电泳后 初步判断样品中所含微生物的种类数；对各种类进行测序分析，获知样品中 的微生物种类、丰度、生物多样性和分布规律；3)微生物菌种的个性化富集培养用扫描电镜分析样品的表面形态结构； 用能谱仪、X-射线采集样品矿物元素的成份及其有机物种类的信息；采集样 品所在的环境信息，包括温度、酸碱度、盐度等；通过序列比对分析，初步 判断各类微生物的种属及生长特征情况，参照已有的该类微生物的相关信息； 对于新种则参照与之在系统发育树中亲缘关系最近的微生物的生长环境特点 等信息；根据上述信息建立个性化富集培养体系；应用个性化富集培养体系 富集各类微生物，分离纯化各富集分离物，获得纯培养物。在本发明的步骤l)中，抽提沉淀物中的DNA的步骤具体为① 向沉淀物中加入高浓度细胞裂解液，充分混匀，放入沸水浴中8 15min;② 55 65。C水浴30min以上；③ 随后72。C水浴30min以上；④ 加入酚/氯仿/异戊醇混和液，混匀，在室温下静置10min左右，离心， 将上清液用酚/氯仿/异戊醇重复抽提，收集上清液；⑤ 上清液用-20。C 4。C的无水乙醇沉淀，沉淀温度为4°C ，沉淀时间30 min 以上，离心收集沉淀；⑥ 用浓度为70%的乙醇洗涤沉淀物两次；⑦ 沉淀物置于室温或真空干燥，用TE或无菌去离子水溶解沉淀，即得到 基因组DNA提取液。上述细胞裂解液包括以下各组分0.10 0.3Omol/L的EDTA; 0.005 0.15mol/L的Tris'HCl; 0.10 0.3Omol/L的NaCl水溶液；质量百分浓度为2°/。
7.5%的SDS;质量百分比浓度为0.30% 0.75%的CTAB。本发明区别于传统的选择性筛选培养、富集培养等方法，其优点是先用 分子生态相关技术检测样品中所含微生物的种类、丰度等特征信息；再根据 各种属的生长代谢特征、该菌所在样品的生长环境特点(如温度、酸碱度、 盐度和物质组成等)等系列信息建立分别适合各微生物生长的个性化富集培 养体系，有的放矢的富集与选育样品中特定的微生物。采用该方法能使得更 多的"不能培养的微生斷'变成可培养的。本方法克服了在分离培养样品中微生 物种类的过程中，存在的效率低、损失新种的概率大、样品耗量大、随机性与盲目性程度高等问题，针对各类样品特别是珍稀样品，能分离培养出更多 的微生物种类，从而提高了从样品培养和选育微生物的产率和种类数。
图l:实施例中沉积物矿物元素的能谱图；图2:菌株DS-0205的光学显微图xi000;图3:菌株DS-0205的SEM图20KVx5500;图4:菌株DS-0205的TEM图100KV x46800;图5:菌株DS-0205的荚膜染色图；图6:菌株DS-0205固体培养7天后的菌落形态；具体实施方式
下面结合附图，以富集分离深海沉积样品中微生物进一步详述本发明的 具体实施(一)样品中总基因组的抽提(1) 在无菌条件下，称取深海沉积样品3g并移入体积为50ml的无菌带盖 的离心管中，加30ml无菌人工海水基本盐，充分振荡后置于摇床上以180rpm 速率匀速摇10-20 min，然后3000rpm离心3min，上清液转移到新的离心管 中；沉淀再重复洗涤两次，均收集上清液，沉淀保存备用。(2) 上清液，以12000rpm离心15min，收集沉淀。(3) 往沉淀中加入20ml灭菌磷酸盐缓冲液，充分振荡后置于摇床上以 180rpm速率匀速摇10min，以12000rpm离心15min，收集沉淀。(4) 重复步骤(3)两次。沉淀即为实验样品。显微镜下初步观察样品中微生 物的形态。(5) 把样品完全转移到5ml离心管中，加入高浓度细胞裂解液的配置(总 体积100ml)为Tris HCl(pH8.0， lmol/L) 12.5ml; EDTA(pH8.0, 0.5mol/L)， 50ml; 5ml浓度为5mol/L的NaCl溶液；25ml质量百分比浓度为20%的SDS; 7.5ml质量百分比浓度为10。/。的CTAB。充分振荡10min，立即放入沸水浴中 并开始计时8 15min。如果样品中以革兰氏阴性菌居多时，则沸水浴时间控 制在10min以内；如果样品中主要以革兰氏阳性菌或细胞壁外有荚膜或多糖 或胞外吸附众多的颗粒物的微生物居中多时，沸水浴时间最好控制在10 15min,每隔2 3min轻轻翻转离心管5 8次。(6) 接着转入55 65。C水浴中水浴lh，每隔15min轻轻翻转离心管5 8次。(7) 随后转入72。C水浴中水浴lh，每隔15min轻轻翻转离心管5 8次。(8) 向离心管中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(V/V/V: 25: 24: 1)，上下 轻轻倒转离心管15min后，随后室温静置10min，接着12000rpm离心5min， 轻轻收集上清液并转入到新的离心管中。(9) 重复步骤(8)—次。柳往离心管中加入2.5倍体积的-20'C冷冻的无水乙醇，上下轻轻倒转离 心管10次后，置于4'C冰箱中沉淀至少lh。沉淀完毕后12000rpm离心15min，收集沉淀。(11)向载有沉淀的离心管中加入2ml70。/。的乙醇，轻轻倒转溶液8次后静 置15min,随后12000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀。 肪重复步骤(ll)一次。(13)沉淀物置于室温或真空干燥后，加适量TE或无菌双蒸水溶解沉淀， 即为基因组DNA提取液，4'C保存备用。(二) PCR扩增，克隆、酶切、测序及序列分析分别用细菌、古细菌与真菌的16SrDNA、 16SrDNA和18SrDNA通用引 物扩增从样品中获得的总基因组DNA。选用的细菌16SrDNA通用引物为 (5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAGA-3'， 5'-GTTACCTTGTTACGACTT-3');选 用的古细菌16SrDNA通用引物为5'-TTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3'， 5'-CTTTCGGTCGCCCCTACT-3'; 选用的真菌 18SrDNA通用引物 为:5 '-ACCTGGTTGAT CCTG C國3'， 5 '國TGATCCTTCYGCAGGTTCAC陽3'。下面以真菌的扩增为例在50jxlPCR反应体系组成5pl的10xPCRbuffer， 3^1的2.5mMMgCl2， 的0.2mMDntp，每一条引物l(J， 4^1的DNA样品， 1^1的2.5单位的Taq polymerase, 34^1的ddH20。 PCR扩增步骤95。C4min; (94。C60s， 60。C90s， 72。C2.5min; 30~32循环;72。C6min。 PCR产物经凝胶 电泳检测后，用胶回收试剂盒纯化回收，随后按照真菌克隆试剂盒操作说明 进行操作，克隆子经蓝白筛选，扩增阳性克隆子；扩增片段经酶切后电泳检 测种数多样性，对具有不同酶切片段的克隆子进行测序，序列在 h加:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2sea/wblast2.cgi网站中讲《亍Blast分析，按照亲源关系远近依次选取一些有代表性种属序列，利用系统发育树软件ClustalX2.0绘制系统发育树，进而划定各所测序列可能代表的种属情况。序列比对分析发现代号为DS-1的克隆子的18SrDNA基因序列与i^odas;7on'(i/Mm ^^ov"rt^ | AB073271.ll的相似度达到了 99.5%，提示沉积样品里含有朋o^w/7onWww^oZjow^謂类酵母菌。(三)7 /20cfos; onWMm力o6ovaft/m类酵母菌的个性化富集培养 能谱仪检测结果发现沉积样品的元素组成及含量如表1,沉积物矿物元素的能谱图见附图1。表l沉积物矿物元素组成与含量元素组成Wt%At%OK44.7659.30NaK3.603.32MgK1.130.99A1K9.607.54SiK33.5025.28C1K0.680.40KK3.341.81CaK0.530.28FeK2.881.09X-射线结果发现沉积样品主成分为硅酸盐。样品取样点理化参数为水深约5200米，pH为7.60、温度为4'C、盐度 约为2%。供参考的已知种属的特征信息，已报道的海水或河水中 i^o^wponVZ/ww力o6ovaft/m的富集培养条件麦芽浸出物、酵母浸出物、葡 萄糖、海水等，最佳生长温度约为25°C。根据上述信息，及/zo^wponW/wm Wo6ova^m类酵母菌的个性化富集培养体 系被设定为酵母浸出物、葡萄糖、pH为7.60、培养温度为15°C、生长大 气压为l个标准大气压、配置用水为人工海水，液体培养。人工海水基本盐的 组分(g/1)是NaCl: 24.4770; Na2S04: 3.9170; KCl: 0.6640; MgCl2*6H20: 4.9810; CaCl2'H20: 1.1020; NaHC03: 0.1920; KH2P04: 0.1500; MnCl2'4H20: 0.2000; FeSO4'7H2O:2.0000; Na2S204: 1.0000。取约0.5克沉积样品放在建立好的个性化富集培养体系中开始富集、富集 一个星期后、再进行固体培养，固体培养基成分与液体培养基成分相同，所 用凝固剂为琼脂粉。通过划线分离3次以上后，获得一种呈大小不一的粉红色 点状隆起菌落，菌落表面粘稠，边缘光滑、完整、无透明圈，光镜下检测发 现菌体形如头盔、呈单细胞多多细胞珠连、有明显的厚荚膜层，有分裂生殖的现象。经检测发现该菌的18rDNA序列与DS-l的克隆子18SrDNA的序列完 全相同，为此认为该菌与DS-1为同一菌。随后经ITSl-5.8SrDNA-ITS2间序列 检测分析结果，形态学分析结果、生理生化结果发现DS-l与朋o^^on'^謹 Wo^w^/m属内菌有较高的相似性，但仍存在一些差异。为此，认为DS-1属 于i /zc^os/ oW(i/w附d/o6ov^腦内的一个新菌株(朋ot/os/ orW, (i/o6ovaf謂 JCM 0205)，根据18SrDNA序列和ITSl-5.8SrDNA-ITS2间序列的登陆 DQ854820 (18SrDNA)， DQ981849 (ITSl-5.8SrDNA-ITS2区域序列)。该菌 分离培养结果如附图2 附图6所示。隆起菌株及/2<^0^0〃'^^^060卩^"附JCM0205描述如下形如头盔，呈能 运动的单细胞或双细胞状，如附图2。在扫描电镜下呈中央凹陷的半球状，凹 陷的直径大小约为1.5nm 5|im，凹陷深度变化约为0.5pm 2.0^im，在细胞 表面有许多网状纤维，如附图3。在透射电镜下发现DS-0205外表面有一个 厚约为0.3nm lnm细胞壁，而在菌体近中央也有一个环状的细胞壁，胞内 液泡不仅数量少而且体积偏小，如附图4。荚膜染色结果显示DS-0205胞外有 一层很厚的荚膜，如附图5，图中箭头所示为荚膜。在15'C琼脂培养5-7天后， 在有氧条件下，菌落形如表面柔软，边缘完整，呈粉红色/红色，菌落表面 粘稠发光，边缘光滑、完整、无透明圈；菌落呈大小不一的粉红色点状隆起， 见附图6。然而，厌氧培养时，菌落颜色最初为乳白色，随着培养时间延长变 为粉红色/红色。
权利要求
1.一种培养筛选微生物菌种的方法，其特征在于包括以下步骤1)样品处理及DNA抽提溶解洗涤样品，收集菌体颗粒物质，去杂质，收集沉淀物；酚-氯仿-异戊醇抽提沉淀物中的DNA；2)PCR扩增，克隆、酶切、测序及序列分析，检测样品中微生物种类多样性分别采用细菌、古细菌和真菌通用引物扩增DNA抽提物，扩增产物，纯化，纯化产物连接克隆后通过蓝白筛选阳性克隆子；对阳性克隆子进行克隆序列的扩增，扩增产物经酶切电泳后初步判断样品中所含微生物的种类数；对各种类进行测序分析，获知样品中的微生物种类、丰度、生物多样性和分布规律；3)微生物菌种的个性化富集培养用扫描电镜分析样品的表面形态结构；用能谱仪、X-射线采集样品矿物元素的成份及其有机物种类的信息；采集样品所在的环境信息，包括温度、酸碱度、盐度等；通过序列比对分析，初步判断各类微生物的种属及生长特征情况，参照已有的该类微生物的相关信息；对于新种则参照与之在系统发育树中亲缘关系最近的微生物的生长环境信息；根据上述信息建立个性化富集培养体系；应用个性化富集培养体系富集各类微生物，分离纯化各富集分离物，获得纯培养物。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤l)中抽提沉淀物中的DNA 的过程为① 向沉淀物中加入高浓度细胞裂解液，充分混匀，放入沸水浴中8 15min;② 55 65。C水浴30min以上；③ 随后72。C水浴30min以上； 加入酚/氯仿/异戊醇混和液，混匀，在室温下静置10min左右，离心， 将上清液用酚/氯仿/异戊醇重复抽提，收集上清液；⑤ 上清液用-2(TC 4'C的无水乙醇沉淀，沉淀温度为4。C，沉淀时间30 min 以上，离心收集沉淀；⑥ 用浓度为70%的乙醇洗涤沉淀物两次；⑦ 沉淀物置于室温或真空干燥，用TE或无菌去离子水溶解沉淀，得到基 因组DNA提取液。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述细胞裂解液各组分的浓度 分别为EDTA: 0.10 0.30mol/L; Tris.HCl: 0.005 0.15mol/L; NaCl: 0.10 0.30mol/L; SDS的质量百分浓度为2% 7.5%; CTAB质量百分比浓度为 0.30% 0.75%。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于所述细胞裂解液的组成为pH8.0， lmol/L的Tris . HC1、 pH8.0， 0.5mol/L的EDTA、 5mol/L的NaCl水溶液、质 量百分比浓度为20。/。的SDS，质量百分比浓度为10。/。的CTAB，各组分的体 积百分比为12.5: 50: 5: 25: 7.5。
全文摘要
本发明公开了一种培养筛选微生物菌种的方法，先通过提取各样品的总基因组，再利用PCR技术及RFLP分子生物学技术检测物样品中微生物的种类、丰度、生物多样性及其分布规律，用能谱仪分析样品的矿物元素的成份，并结合取样时获得的取样点的理化信息构建针对样品中各类微生物的个性化富集培养体系，以个性化富集培养体系来筛选分离样品中各类微生物，特别是目的微生物。与传统的选择性微生物筛选培养方法相比，本发明使得一些不可培养的微生物变成可培养的；克服了损失新种概率大、样品耗量大、随机性与盲目性程度高、效率低等问题，提高了从样品培养和选育微生物的产率和种类。
文档编号C12Q1/68GK101250578SQ20081003087
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月24日 优先权日2008年3月24日
发明者曾乐平, 黄菊芳 申请人:中南大学