专利名称：：一种抗HBV核心区的siRNA表达模板和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因药物，具体涉及一种抗HBV核心区的siRNA表达模板。技术背景乙型肝炎病毒(HBV)的持续感染是当前严重的全球健康问题之一，也是导致慢性肝病最常见的原因。目前全球约有3.5亿慢性乙型肝炎病毒感染者，其中75%分布在亚太地区。慢性乙型肝炎预后不良,可发展为肝硬化和肝癌。目前控制HBV持续感染的抗病毒疗法主要采用核苷类似物和重组干扰素类抗病毒药物。但迄今为止，慢性乙型肝炎的抗病毒治疗疗效尚不令人满意，高剂量重组干扰素的持续应答率仅约30%左右，核苷类似物如拉米夫定虽然抗病毒活性较强，但停药后病毒复制水平快速反跳及耐药病毒株的出现，使得临床抗病毒方案的实施受到极大的阻碍。RNA干预(RNAi)技术的出现为基因功能研究、抗肿瘤和抗病毒基因治疗等方面的研究展开了新的一页。双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干预(RNAinterference,RNAi)，具有干预作用的小片段双链RNA则称为siRNA,这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因"沉默"了。目前RNAi技术主要用于功能基因研究和抗肿瘤研究，抗病毒治疗研究才刚刚起步，但已显示了良好的前景和巨大潜力，如有研究者证实RNAi介导的基因沉寂疗法可以成功抑制艾滋病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)的复制与表达。Gitlin等人报道将针对脊髓灰质炎病毒的siRNA导入细胞，可产生抵御病毒感染的保护作用，Novina等人采用针对HIV-1受体CD4的siRNA明显降低了HIV感染细胞的能力。基因输送一直是基因治疗和转基因研究中的一个难题，目前普遍采用腺病毒载体和脂质体-DNA复合物进行基因输送，而这两种方法存在着安全隐患和效率低等方面的问题，纳米技术在生物领域的渗透形成了纳米生物技术，而纳米药物载体的研究是纳米生物技术的重点和热点。被制成基因载体的磁性纳米颗粒能与DNA结合，并把DNA导入细胞，在外部磁场导向作用下能达到最佳的细胞转染作用，完全克服了传统方法所遇到的困难。为了进一步研究RNAi对HBV复制的影响，本发明把siRNA技术和纳米技术结合，研制了一种新型基因药物，抑制HBV的复制和表达，这对探索乙肝治疗的新途径具有重要现实意义。
发明内容本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，通过采用siRNA技术结合纳米技术对HBV核心区进行封闭并抑制HBcAg的表达，最终抑制HBV表达和复制。为实现本发明目的，采用以下技术方案一段HBV核心区靶基因的siRNA表达模板的核苷酸序列为gatcccgttggaggcttgaacagtaggattgatatccgtcctactgttcaagcctccaattttttccaaa。将上述表达模板插入到siRNA表达载体中，得到重组表达质粒pRNA-HBcAg，再与磁性纳米颗粒结合，通过磁场导入2215细脱产生靶向HBV核心区的siRNA;经序列测定，它由70个核苷酸组成，与设计相符；经放射免疫法、RT-PCR、westernblotting、免疫组化等体外实验，表明pRNA-HBcAg可明显抑制HBV核心区和HBV-DNA的表达，同时也在一定程度上抑制了HBsAg和HbeAg的表达，从而达到抗HBV的目的。本发明的优点是1、靶向广泛选择的靶序列同时针对HBV的adr和adw两个亚型(这两个亚型囊括了大部分HBV)，而与人体基因组毫无冲突；2、纳米技术应用使用磁性纳米颗粒作为基因导入的载体，解决了安全性问题，同时利用磁场的作用解决了导向问题，而且纳米技术的运用使基因导入的效率有所提高；3、效果明显当前相关RNAi抗朋V的研究大都把靶点设在HBV核心区C端，而本发明设计的RNAi靶点在HBV核心区N端，是其特点。所构建的表达质粒pRNA-HBcAg可明显抑制HBV核心区的表达，从而抑制HBV的复制和表达，为研制治疗乙肝的基因药物开辟了一条有实用意义的新途径。图1为大肠杆菌转化后阳性克隆菌落。图2为测序图谱，框内标记的序列为正确的克隆序列。图3为siRNA的结构描述。图4为荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白GFP表达。图5为RT-PCR结果marker为DNA分子量；l为空白对照；2为阴性对照；3为pRM-HBcAg转染细胞。图6为免疫组化结果:A为对照；B为siRNA-HBcAg。图7为Western-blotting结果Marker为蛋白标准；l为空白对照；2为阴性对照；3为siRNA-HBcAg。具体实施方式实施例1:1.构建耙向基因的siRNA表达质粒1.1表达质粒的准备购买GenScript公司的pRNAT-U6.1/Neo质粒，它是一个为转染哺乳动物细胞设计的siRNA表达质粒，质粒中携带新霉素抗性基因作为筛选标志以建立稳定细胞株，位于CMV启动子下的GFP(绿色荧光蛋白)基因能够用来跟踪质粒的转染效率，U6启动子下设计有多克隆位点，本发明中我们利用其BamHI和HindIII的酶切位点进行克隆。1.2siRNA模板序列的设计GeneScript公司提供了在线siRNA模板序列设计的软件，利P该软件可设计siRNA模板序列，我们针对HBV核心区找到一段靶序列5'TCCTACTGTTCAAGCCTCCAA3，根据它再设计出一对siRNA模板序列(其结构见图3-A):5，-GATCCCGTTGGAGGCTTGAACAGTAGGATTGATATCCGTCCTACTGTTCAAGCCTCCMTTTTTTCCAAA-3，3，-GGCAACCTCCGAACTTGTCATCCTAACTATAGGCAGGATGACAAGTTCGGAGGTTAAAAAAGGTTTTCGA-5，1.3将合成的模板与酶切好的质粒连接将上述合成的一对模板DNA链分别用水配成lug/ul的溶液，各取5ul，加入2ul退火缓冲液(2MNaCl)和8ul水，混匀后于95'C水浴5分钟变性，再自然冷却退火成一条双链DNA，由于设计好了BamHI和HindIII的酶切位点粘端，可直接与BamHI和HindIII酶切(内切酶均购自美国Promega公司，操作方法详见内切酶产品说明书)好的质粒pRNAT-U6.1/Neo连接；然后取lul酶切好的质粒与3ul退火双链DNA，加3U/ul的T4连接酶lul，与10ul水混合，在T4连接酶作用下，16'C连接反应过夜。1.4转染DH5a感受态细胞将连接过夜的连接体系转化DH5a感受态细胞(大肠杆菌感受态细胞的制备和转化见《分子克隆实验指南》第二版第55页)，涂布于含Ampl00ug/ml的LB平皿上，37'C培养过夜，可见有若干个菌落生长(见图l)。1.5挑阳性克隆进行酶切鉴定和测序鉴定，以确定siRNA模板已正确插入质粒挑取生长良好的单个菌落接种于含A即100ug/ml的LB液体培养基中，37'C，270r/min摇床培养过夜，用质粒纯化试剂盒(Promega公司产品)提取质粒(方法按照试剂盒说明书操作)。并做PstI和SalI酶切(方法按照内切酶产品说明书操作)鉴定，初步证实质粒构建成功，把质粒送大连宝生物公司测序，测序结果(见图2)最终确定siRNA模板已正确插入质粒，模板序列经Primer5分析为发夹结构(见图3_B)。L6大量扩增重组质粒，为下一步作准备。2.购买磁性纳米颗粒并与siRNA表达质粒偶联①磁性纳米颗粒的准备购买法国OZ公司的磁性纳米颗粒产品，放4'C冰箱储存。②与siRNA表达质粒偶联吸取siRNA表达质粒与磁性纳米颗粒浆液按liig:2ul均匀混合，放室温静置30分钟即可进行细胞转染实验。3.体外实验3.1放射免疫实验检测药物对HBV的抑制情况。借磁场的导向作用，将siRNA-纳米颗粒转染2215细胞，用荧光显微镜监测其转染效率。转染前一天用胰酶(0.25g/100ml)消化培养瓶中的细胞，用含IOW(v/v)胎牛血清的DMEM调整细胞密度为2X10s个/ml，6孔细胞培养板每孔加入2ml细胞悬液，细胞培养箱培养24h左右，使细胞全部贴壁；每孔转染2ug重组质粒(对照孔转染2ug空质粒pRNAT-U6.1)。荧光显微镜下观察转染效率，可见转染后细胞有绿色荧光蛋白GFP表达(见图4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由上表结果可知，药物对HBV-DNA复制的抑制率达到9(m以上，而对HBsAg(抑制率:26.1%)和HBeAg(抑制率19.3%)都有一定程度的抑制。3.2通过RT-PCR和Westernblot检测siRNA封闭基因表达的效果，用免疫组化实验进行定位。RT-PCR采用TrizalReagents(Gibico/BRL)提取细胞总RNA，设计PCR引物为PI:5，-AACTTTTTCACCTCTGCCTA-3，P2:5，_CTAACATTGAGATTCCCGAG-3，e-actin作为阳性内对照；PCR条件为94。C预变性3分钟，然后进入循环94'C60秒，58°C60秒，72'C90秒，共30个循环，最后72'C延伸10分钟，缓慢降到4'C,凝胶电泳结果如下转染pRNA-HBcAg的细胞mRNA表达明显低于未转染细胞及空白质粒对照细胞，表明pRNA-HBcAg可明显抑制HBV核心区mRNA表达。未转染细胞及空白质粒转染细胞HBV核心区mRNA表达无明显影响。e-actin作为阳性内对照，可见清晰表达(图5)。Westernblotting:加入PBS500yl，200W超声破碎60秒，4'C离心2min,取上清，测蛋白含量，用1(WPAGE胶(10%PAGE胶的配方见《分子克隆实验指南》第二版第883页)电泳分离蛋白，进行Westernblotting实验(Western印迹法见《分子克隆实验指南》第二版第888页)，实验所需的一抗为鼠抗HBV核心区单抗，稀释200倍后使用；二抗为HRP标记羊抗鼠抗体，稀释500倍后使用；两个抗体均购自SantaCruz公司。观察实验结果pRNA-HBcAg转染细胞HBV核心区蛋白表达明显下降，而未转染细胞及空白质粒转染细胞HBV核心区蛋白表达无明显影响(图7)。免疫组化取出载玻片，4呢多聚甲醛(v/v)固定，分别滴加小鼠抗HBV核心区单抗、生物素化二抗、辣根酶标记链酶卵白素工作液，滴加MB显色剂，显色10min。结果pRNA-HBcAg转染细胞核内HBV核心区蛋白表达明显下降，而空白对照细胞及空质粒对照细胞HBV核心区蛋白表达无明显影响(如图6)。<110>苏先狮<120>—种抗HBV核心区的siRNA表达模板和应用<160>1<210>1<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><400>1gatcccgttggaggcttgaacagtaggattgatatccgtcctactgttcaagcctccaat60tttttccaaa70权利要求1、一种抗HBV核心区的siRNA表达模板，其特征在于所述表达模板的核苷酸序列为gatcccgttggaggcttgaacagtaggattgatatccgtcctactgttcaagcctccaat60tttttccaaa702、一种权利要求1所述的抗HBV核心区的siRNA表达模板在制备抑制HBV药物中的应用。全文摘要本发明通过采用siRNA技术结合纳米技术对HBV核心区进行封闭并抑制HBcAg的表达，最终抑制HBV表达和复制。本发明靶向广泛，效果明显，通过采用纳米技术提高了基因导入的效率。文档编号C12N15/113GK101235372SQ20081003072公开日2008年8月6日申请日期2008年2月29日优先权日2008年2月29日发明者苏先狮申请人:苏先狮