一株酿酒酵母及其用于提高葡萄酒酯类物质含量的用途的制作方法

本发明属于微生物领域，涉及一株酿酒酵母及其用于提高葡萄酒酯类物质含量的用途。

背景技术：

葡萄酒是以鲜葡萄或葡萄汁为原料，经酵母菌等发酵酿制而成的，酒精度不低于7.0％的酒精饮品。

葡萄酒是极具个性的饮品，不同产区的酒风格特征各不相同，这种差异性也正是葡萄酒的魅力所在。而目前我国的葡萄酒产品同质化严重，很少有能够代表产地特色的优质产品，其中最突出的就是香气质量差、缺乏产区特征，这也成为制约我国葡萄和葡萄酒产业发展的主要因素之一。

酿酒酵母作为葡萄酒发酵过程中的主导菌株，对葡萄酒品质，特别是在其产地香气特征的表现上起着决定性作用。其中由酿酒酵母代谢产生的酯类化合物是葡萄酒果香的主要来源，且不同的酯类物质在香气感知时相互之间具有累加效应，故在一定阈值范围内酯类化合物浓度的增加可以增强人们对葡萄酒果香的感知，进而提高葡萄酒的特征香气。

因此，针对性地开展产地特色的增香型葡萄酒酵母菌种选育从根本上提升葡萄酒的香气质量，对提高我国葡萄酒产品的市场竞争力有着重要意义。

技术实现要素：

本发明提供了一株酿酒酵母，采用该菌株酿造葡萄酒，可以提高其中的酯类物质含量，从而可以提高葡萄酒的品质。

本发明用于提高葡萄酒酯类物质含量的菌株为酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)sw1009，它属于子囊菌亚门(ascomycota)、半子囊菌纲(hemiascomycetes)、酵母目(saccharomycetales)、酵母科(saccharomycetaceae)。该菌株已于2017年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmccno.13440。

本发明提供的酿酒酵母菌株sw1009是在葡萄表皮筛选的1株耐受性较好，能产生较多酯类物质的酵母菌，通过wl培养基聚类培养得到。在wl培养基中培养时，四周乳白色，中间突出较大，略显绿色，不透明，生长旺盛，菌落较大，在ypd固体培养基上培养时，菌株呈现米白色，该菌株在ypd液体培养基中28℃培养时，6h即可启动发酵，11h即可充满倒立杜氏小管。

本发明还提供了采用酿酒酵母菌株sw1009发酵生产葡萄酒的方法，其特征是，

1)挑取酿酒酵母sw1009菌株接种于ypd液体培养基，26～30℃恒温振荡培养18～32小时，得到种子液；

2)然后将种子液接种于预冷的葡萄汁(预先冷至6～8℃)中(接种量为0.5×10⁶～3×10⁶cfu/ml)，于6～8℃下保持2-3天后，再对发酵醪液持续升温至17～19℃；

3)将发酵醪液于17～19℃下恒温发酵5～6天后，再将发酵醪液持续升温至26～28℃，于该温度下恒温发酵直至发酵醪比重介于0.992-0.995之间时，发酵结束。

本发明还提供了该酿酒酵母菌株sw1009在提高酯类物质含量方面的用途。

实验证明，该酿酒酵母菌株sw1009具有发酵力强、耐受性好(酒精耐受性和二氧化硫耐受性)、酯类物质含量高等优势。采用该菌株发酵赤霞珠葡萄生产葡萄酒，产酒精度为12.79％(v/v)，酯类物质总量为19.77mg/l(相同条件下发酵的商业酵母71b和d254酵母分别产生15.68mg/l，17.00mg/l)，主要酯类化合物为乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯，经感官评价可给葡萄酒增加成熟浆果的香气，因此它可以提高葡萄酒的品质。同时本发明的发酵工艺简单，对于葡萄酒生产厂家来说不需要另外添加新的设备，因此在葡萄酒行业上具有良好的应用前景。

附图说明

图1为菌株在wl培养基上的形态图；

图2为菌株发酵过程中酯类相关基因(atf1、faa1、eht1和iah1)表达量的变化趋势图；

图3为菌株发酵结束后葡萄酒的gc-ms离子流色谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

实施例1：酿酒酵母菌株sw1009的分离和鉴定

1.葡萄表皮酵母菌富集

取约20g完整的葡萄(烟台，赤霞珠葡萄)于100ml无菌水中，摇床170rpm室温富集30min。

2.酵母菌的分离纯化

将上述富集液体取1ml加入9ml无菌水中，进行梯度稀释，分别稀释到10^-1到10^-4不同浓度，吸取浓度梯度为10^-1到10^-4的菌液各0.1ml涂布于加入氯霉素(100mg/l)的wl培养基平板，28h培养7d，对平板菌落进行拍照，挑取不同形态特征单菌落接种于ypd固体培养基斜面，28h培养1d进行纯化，4℃保存，并且进行测序。本发明中的酵母在wl培养基的形态特征见图1。

3.高产酯酿酒酵母的初筛

将步骤1)所得到的菌株进行发酵力和耐受性(酒精耐受性和二氧化硫耐受性)试验，酿酒酵母菌株sw1009的发酵力和耐受性结果见表1-2，将得到的耐受性较好的菌株，使用赤霞珠进行发酵试验，进一步选取酯类含量较高的菌株进行鉴定。同时在实验过程中选取富产酯的商品酵母菌株71b和工业生产中常用的商品酵母菌株d254为对照。

3.1菌株发酵力分析

取10mlypd液体培养基分装于试管，放入倒置的杜氏发酵管(确保充满液体培养基并无气泡)，121℃灭菌20min。待培养基冷却后，培养基中加入100mg/l的氯霉素，用竹签挑取少许酵母菌体接入上述灭菌ypd液体培养基中，28℃静置培养，每隔4h观察一次，记录酵母菌的起始发酵时间和气体充满杜氏管的时间。实验结果见表1。

表1酵母菌株发酵力实验结果

3.2菌株酒精耐受性分析

取10mlypd液体培养基分装于试管，放入倒置的杜氏发酵管(确保充满液体培养基并无气泡)，121℃灭菌20min。待培养基冷却后，在超净工作台中，用移液枪补加100mg/l的氯霉素，并且加入无水乙醇，使培养基中乙醇体积分数分别为12％(v/v)，用竹签挑取少许酵母菌体接入上述灭菌ypd液体培养基中，28℃静置培养7d，记录酵母菌生长发育情况，将耐受12％(v/v)酒精度的酵母，继续接种于14％(v/v)的ypd液体培养基中培养，随后依次进行16％(v/v)、18％(v/v)、20％(v/v)酵母菌耐受性分析。实验结果见表2。

表2酵母菌株耐受性实验结果

3.3菌株二氧化硫耐受性分析

取10mlypd液体培养基分装于试管，放入倒置的杜氏发酵管(确保充满液体培养基并无气泡)，121℃灭菌20min。待培养基冷却后，在超净工作台中，用移液枪补加100mg/l的氯霉素，并且加入偏重亚硫酸钾水溶液(其浓度为50％的so2溶液)，使培养基中so2浓度为300mg/l，用竹签挑取少许酵母菌体接入上述灭菌ypd液体培养基中，28℃静置培养7d，记录酵母菌生长发育情况，将耐受300mg/lso2的酵母，继续接种于400mg/lso2的ypd液体培养基中培养，随后依次进行500mg/l和600mg/l酵母菌耐受性分析。实验结果见表2。

将得到的耐受性较好的菌株，使用赤霞珠进行发酵试验，进一步选取酯类含量较高的菌株sw1009进行鉴定。

4.菌株sw1009鉴定

4.1微生物学特性：在wl培养基中培养时，四周乳白色，中间突出较大，略显绿色，不透明，生长旺盛，菌落较大，在ypd固体培养基上培养时，菌株呈现米白色。

4.2分子生物学鉴定

对菌株sw1009进行26s测序，得到以下结果(seqno.1)：gaggaaaagaaaccaaccgggattgccttagtaacggcgagtgaagcggcaaaagctcaaatttgaaatctggtaccttcggtgcccgagttgtaatttggagagggcaactttggggccgttccttgtctatgttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtgtggcgaggagtgcggttctttgtaaagtgccttcgaagagtcgagttgtttgggaatgcagctctaagtgggtggtaaattccatctaaagctaaatattggcgagagaccgatagcgaacaagtacagtgatggaaagatgaaaagaactttgaaaagagagtgaaaaagtacgtgaaattgttgaaagggaagggcatttgatcagacatggtgttttgtgccctctgctccttgtgggtaggggaatctcgcatttcactgggccagcatcagttttggtggcaggataaatccataggaatgtagcttgcctcggtaagtattatagcctgtgggaatactgccagctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgcagcccgtct。

然后将其sw1009菌株26s序列与其他菌株进行比对，比对结果如表3所示。

表3sw1009菌株26s序列比对结果

从表3可以看出：本发明的sw1009菌株的26s序列，与genbank中的收录的13株酿酒酵母saccharomycescerevisiae的相似度均为99％，且其微生物特性符合酿酒酵母种的描述。鉴于以上结果，将sw1009菌株鉴定为酿酒酵母saccharomycescerevisiae。该菌株已经于2017年3月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmccno.13440。

实施例2：

1.赤霞珠葡萄发酵试验

1)配制ypd液体培养基，成分(g/l)：酵母膏(或酵母浸粉)10，蛋白胨20，葡萄糖20，其余为是水；ph6.5±0.2；将配制的ypd液体培养基分装于100ml三角瓶，每瓶50ml，121℃灭菌20min。

2)挑取酿酒酵母sw1009菌株接种于ypd液体培养基，放置于恒温培养振荡器，28℃，170r/min培养24h，取100μl菌体悬浮液稀释200倍，取稀释液10μl于血球计数板，显微镜下计数，每个菌体计数三次。

3)计数结束后按照1×10⁶cfu/ml的接种量接种于破碎赤霞珠葡萄汁(商业酵母71b和d254按照说明书操作)，接种结束后放置于8℃下保持温度2天，再对发酵醪液持续升温至18℃，于18℃下恒温发酵5天后，再将发酵醪液持续升温至26℃，于该温度下恒温发酵。

发酵过程监控发酵醪的比重，待发酵醪比重(相对于20℃的水的比重)介于0.992-0.995之间时，发酵结束。经检测，sw1009产酒精度为12.79％(v/v)，同样的发酵条件下71b产酒精度12.5％(v/v)，d254产酒精度12.84％(v/v)。

2.赤霞珠葡萄酒香气成分的采集

将上述发酵产生的香气化合物使用ctc自动进样器进行前处理，取8ml葡萄酒于20ml的顶空进样瓶，顶空瓶中提前放入2g的氯化钠，顶空瓶在agitator中预热10min，后通过dvb/car/pdms萃取头萃取50min，吸取香气物质，最后进去安捷伦7890b气相色谱进样口，解析10min。

3.gc-ms分析条件

采用5977a质谱仪进行分析，不分流模式进样，恒流模式，柱流量0.8ml/min，程序升温，初始温度40℃，以1℃min升到45℃，保持2min，以3℃/min升到84℃，保持2min，以3℃/min升到120℃，保持3min，以3℃/min升到200℃，以5℃/min升到230℃，运行时间71.667min，msd传输线250℃，质谱选择scan模式进行扫描。

赤霞珠葡萄酒的香味成分的gc-ms离子流色图谱如图3所示，赤霞珠葡萄酒的香味成分的分析结果见表4。它与商业酵母71b和d254的香气成分含量比较见表5。

表4sw1009发酵赤霞珠葡萄酒酯类物质

表5不同酵母发酵赤霞珠葡萄酒酯类物质比较

从表1-2可以看出：相比现有的商用酵母71b和d254，本发明的酿酒酵母菌株sw1009的发酵力和二氧化硫耐受性略有提高；酒精耐受性提高明显，比商用酵母71b提高6％，比商用酵母d254提高4％，提高幅度分别为42.8％和25％。

从表5可以看出：相比现有的商用酵母71b和d254，本发明的酿酒酵母菌株sw1009的酯类物质成分的总含量提高明显，比商用酵母71b提高4.09％，比商用酵母d254提高2.77％；提高幅度分别为26.08％和16.29％。从表5还可以看出：本发明的葡萄酒中共检测出18种酯类物质，主要酯类物质成分为：乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯，癸酸乙酯和乙酸-2-苯乙酯。相比商用酵母71b和d254，本发明的酿酒酵母菌株sw1009酿造的葡萄酒的辛酸乙酯、己酸乙酯和乙酸-2-苯乙酯含量明显提高，尤其是辛酸乙酯的含量较高，分别提高了3.8％和2.92％。辛酸乙酯有似白兰地的香气并有甜味，己酸乙酯是具有曲香、菠萝香型的香气，乙酸苯乙酯是一种带有密甜底香的玫瑰香气，三者对提高葡萄酒的香气都有重要作用，因此本发明提高了葡萄酒的品质。

4.发酵过程酯类相关基因相对表达量分析乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯。

发酵过程中取样，共取6个点，使用全式金公司试剂盒对酿酒酵母rna进行提取，并且进行cdna合成，以及荧光定量pcr分析，实验结果见图2。其中atf1编码酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)中1种醇乙酰转移酶(aatase)，此酶参与乙酸酯的生成；iah1是最终的酯酶基因，一个由ala85-cys86-ser87-ala88-gly89组成的假定活性位点序列，参与乙酸酯的水解；酵母中乙酯的形成通过乙醇o-酰基转移酶催化，该酶主要由eht1和eeb1基因编码；乙基酯生物合成受其前体物质中链脂肪酸(mcfas)浓度的直接影响，同时也受长链脂肪酸酰基coa的浓度调控，faa1基因编码酰基coa合成酶，调控长链酰基coa的合成。由图2可以看出，发酵过程中，酿酒酵母菌株sw1009的4个与酯类相关的基因表达量处于较高的表达量状态。

sequencelisting

<110>山东省农业科学院农产品研究所

<120>一株酿酒酵母及其用于提高葡萄酒酯类物质含量的用途

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<213>酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）sw1009的26s序列

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