一株小盾壳霉菌株及其应用的制作方法

本发明涉及生物农药技术领域，尤其是涉及一株对植物菌核病具有生物防治作用的小盾壳霉菌株jn-cm(coniothyriumminitans)cgmccno.8325。

背景技术：

菌核病是由核盘菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)引起的一种世界性分布的植物病害，对油菜、向日葵、蔬菜等重要经济作物的产量和品质影响严重，给农业生产带来巨大损失。菌核病均在油菜、向日葵等油料作物开花期发病，发病部位位于地表上部10cm植物根茎部，发展速度快，发病面积每周以指数级数增加。以油菜为例，我国每年需防治面积都超过种植面积的50％，达到5000万亩以上。

现阶段我国防治菌核病的主要措施是使用化学杀菌剂，存在的主要问题：(1)长期使用化学农药，将导致核盘菌产生抗药性并使农药用量不断增加，作物体内农药残留不断升高，对人体健康产生危害和引起环境污染等系列问题。(2)使用化学农药杀灭核盘菌的同时也杀死了许多授花的蜜蜂等天敌昆虫，破坏了生态平衡，不利于油菜等作物的生长。(3)由于作物菌核病发病期和发病部位的特殊性，以及作物密集种植的特点，喷洒等传统施药方法无法有效到达作物根茎部等主要发病部位，防治效果大幅下降。

因此，采用生物农药防治菌核病就成了一种必然趋势，其中，以小盾壳霉对菌核病的防治效果最佳。小盾壳霉(c.minitans)是核盘菌的天然寄生性真菌(天敌)，与核盘菌共存于土壤之中，由美国学者campbell于1947年首先发现。自上世纪七十年代开始，国内外学者已经在盾壳霉的生物学特性，对核盘菌的生防作用机制等方面进行了深入的研究。研究表明，小盾壳霉通过重寄生作用侵染菌核，在溶菌和抗生作用下，导致菌核的腐烂和菌体的死亡，达到防治菌核病的目的。

长期使用小盾壳霉，可在土壤中可以形成一定的菌群优势，有效降低核盘菌在土壤中数量，产生长期防治的效果。更重要的是小盾壳霉具有对核盘菌专一、无抗性，无毒无残留，对环境友好等特点，是一种典型的以菌克菌的绿色生物防治技术。实践表明，有些农户希望能把小盾壳霉与化学农药或化肥一起混合使用，以简化手续，降低劳动强度和生产成本。为此，需要使小盾壳霉对菌核净等化学杀菌剂具有抗性作用。但是混用的前提是，小盾壳霉必须对所联用的化学杀菌剂具有稳定的抗性。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一株小盾壳霉菌株及其应用。本菌株可以防治多种植物菌核病。

本发明的技术方案如下：

本申请提供了一株小盾壳霉菌株(coniothyriumminitans)，所述菌株于2013年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.8325。

本申请还提供了小盾壳霉菌株(coniothyriumminitans)cgmccno.8325的所有生物学纯培养物。

本申请还提供了所述的小盾壳霉菌株(coniothyriumminitans)cgmccno.8325及其所有生物学纯培养物在植物菌核病生物防治中的应用。

本申请还提供了所述的小盾壳霉菌株(coniothyriumminitans)cgmccno.8325及其所有生物学纯培养物的应用方法：与菌核净、福美双、异菌脲、腐霉利等化学杀菌联合使用。

本发明有益的技术效果在于：

本发明自油菜地土壤中，采用核盘菌菌核诱捕法，分离到一株微生物菌株，通过对其进行进一步筛选，获得了既对核盘菌具有较强寄生作用又对化学杀菌剂腐霉利、菌核净、福美双、异菌脲具有较强抗性且遗传稳定的菌株。经常规鉴定和分子鉴定为小盾壳霉菌株jn-cm(coniothyriumminitans)cgmccno.8325。

本菌株在pda培养基上菌落的菌丝初期为无色，随着菌落的生长呈白色绒状，背面也为白色，菌落产孢后呈黑色或由褐色转变为黑色，孢子器吐出黑色水滴，水滴中包含溢出的分生孢子。菌落扁平，边缘纤毛状。分生孢子梗聚集，有横隔，有分枝，直立，壁光滑。产孢细胞呈瓶状，簇生于分生孢子梗顶端。分生孢子为单细胞，呈椭圆形，表面粗糙，有不规则突起，大小约为7-12μm×3-5μm。最适生长温度为20℃，最适生长ph为6。

附图说明

图1分别为本菌株在pda培养基上培养3、7、10天的菌落形态。

图2分别为本菌株分生孢子和菌丝的光学显微照片。

图3分别为本菌株分生孢子和菌丝的电子显微镜照片。

图4为本菌株的its序列及其系统发育树。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明进行具体描述。其目的是为更好理解本发明的内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围。

实施例1：小盾壳霉菌株的分离

分别称取100g4个不同地区的油菜田土样于250ml塑料烧杯中，埋入50粒核盘菌菌核并混匀，盖上纱布防止污染，放入20℃恒温培养箱中，保持一定的土壤湿度诱捕培养28d后取出菌核。将已明显腐烂的菌核用去离子水洗涤，除去表面的土壤后放入0.5％naclo溶液中消毒1min，再用无菌水洗涤3次。将洗过的菌核用无菌玻璃棒充分捣碎，加无菌水用4层擦镜纸过滤，将滤液梯度适度稀释后涂布于pda平板上，20℃培养5d后观察平板内菌落生长情况，挑取盾壳霉疑似菌株进行纯化直至纯培养。

实施例2：小盾壳霉cgmccno.8325对核盘菌菌核致腐能力的测定

称取40目过筛后的江沙20g置于培养皿内，165℃下干热灭菌3h，冷却后每个培养皿内放入20个核盘菌菌核(大小约为7mm×5mm)，然后加入4ml上述分离纯化的小盾壳霉菌株的分生孢子悬液(10⁶cfu/ml)，充分搅拌混匀，置于20℃下避光培养28d后取出，观察盾壳霉对核盘菌菌核的寄生致腐作用。每个样品进行三组平行，并以4ml无菌水代替上述小盾壳霉菌株的孢子悬液作为对照组。以校正致腐率表示小盾壳霉菌株对核盘菌菌核的致腐能力，计算公式如下：

致腐率f＝腐烂菌核数/菌核总数×100％；

校正致腐率f＝(fj-f0)/(1-f0)×100％，其中fj表示样品组的致腐率，f0表示对照组的致腐率。

经测定，小盾壳霉菌株cgmccno.8325对油菜核盘菌菌核的校正致腐率为95.6±4.7％；对向日葵核盘菌菌核的校正致腐率为91.6±5.2％；对蔬菜核盘菌(来自于莴苣)菌核的校正致腐率为88.9±3.4％。

小盾壳霉菌株cgmccno.8325对各种植物核盘菌菌核都具有较高的校正致腐率，说明其对来自于不同植物的核盘菌均具有较强寄生作用。

实施例3：小盾壳霉cgmccno.8325对化学杀菌剂抗性的测定

将腐霉利(procymidone)、菌核净(dimetachlone)、福美双(thiram)和异菌脲(iprodione)等4种化学杀菌剂，分别制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、5.0和10.0μga.i./ml等不同浓度梯度的含药pda平板。用12mm打孔器切取10天菌龄的cgmccno.8325菌株，接种至上述平板中央，每种杀菌剂的每个浓度分别设置5个平行实验，以不加杀菌剂的pda平板为对照组。将接种后的平板放入20℃的培养箱中培养7天用十字交叉法测量每个平板内的菌落直径，将测量所得的菌落直径平均值减去接种块直径既得菌丝生长直径，按下式计算各杀菌剂浓度对菌株菌丝生长的抑制率a(％)。将抑制率对杀菌剂浓度进行回归分析，得到各杀菌剂对cgmccno.8325菌株菌丝生长的毒力方程。据此计算各杀菌剂对cgmccno.8325菌株菌丝生长的有效抑制中浓度(ec50，即对菌丝生长抑制率50％所对应的杀菌剂浓度)。

式中：a：抑制百分率；

di：不同浓度试剂下菌丝生长直径的平均值；

d0：对照组所菌丝生长直径的平均值。

经测定，各种化学杀菌剂对小盾壳霉菌株cgmccno.8325菌丝生长的有效抑制中浓度ec50分别为：腐霉利66.20μga.i./ml；菌核净552.33μga.i./ml；福美双98.10μga.i./ml；异菌脲133.78μga.i./ml。较高的ec50表明小盾壳霉菌株cgmccno.8325对上述4种化学杀菌剂具有一定的抗性。

取小盾壳霉cgmccno.8325的分生孢子悬液(10⁶～10⁷cfu/ml)100μl分别涂布于含100μga.i./ml的腐霉利、菌核净、福美双或异菌脲等4种杀菌剂的pda平板上，20℃避光培养5d，观察生长情况。发现小盾壳霉cgmccno.8325菌株在上述平板上均能生长，说明小盾壳霉cgmccno.8325菌株可以抗100μga.i./ml的4种化学杀菌剂。

实施例4：小盾壳霉cgmccno.8325对化学杀菌剂抗性的遗传稳定性的测定

将小盾壳霉菌株cgmccno.8325在pda斜面上连续传代10次，按实例3所述方法测定传代后(f10)的ec50，结果为：腐霉利63.40μga.i./ml；菌核净646.03μga.i./ml；福美双75.61μga.i./ml；异菌脲128.39μga.i./ml。和实例3中所测得的传代前的数值相比，ec50均只是略有下降，仍然保持在较高水平。表明小盾壳霉cgmccno.8325对化学杀菌剂的抗性具有较高遗传稳定性。

将连续传代10次的小盾壳霉cgmccno.8325的分生孢子悬液(10⁶～10⁷cfu/ml)100μl按实例3所述方法，分别涂布于含100μga.i./ml的腐霉利、菌核净、福美双或异菌脲的pda平板上，20℃避光培养5d，观察生长情况。发现传代后(f10)的cgmccno.8325在上述平板上均能生长，说明小盾壳霉cgmccno.8325菌株在连续传代10次后仍可以抗100μga.i./ml的4种化学杀菌剂。再次证明小盾壳霉cgmccno.8325对化学杀菌剂的抗性具有遗传稳定性。

实施例5：小盾壳霉cgmccno.8325的个体与菌落形态观察

将小盾壳霉cgmccno.8325点植于pda平板中央，20℃培养观察，记录菌落生长变化情况。培养成熟后对菌株菌丝及孢子进行普通显微镜和扫描电镜观察。

cgmccno.8325菌丝初期为无色，随着菌落的生长，菌丝一边扩展，菌落表面一边形成白色分生孢子器，菌落扁平、中间部分突起，表面光滑，气生菌丝不发达，呈白色绒状，背面也为白色，生长速度中等，菌落扁平，边缘纤毛状。再经过一段时间的培养后，菌落逐渐变褐，菌落产孢后呈黑色或由褐色转变为黑色，孢子器吐出黑色水滴即为溢出的分生孢子(见附图1)。

cgmccno.8325分生孢子在光学显微镜下为单细胞，椭圆形，褐色，不透明；菌丝在光镜下无色、较粗、有分枝，有明显的横隔；分生孢子器黑色，近球形，高400～600μm，直径350～500μm，具孔口，聚生或散生于菌丝中，分生孢子梗有横隔，有分枝，直立，壁光滑。产孢细胞呈瓶状，簇生于分生孢子梗顶端(见附图2)。

cgmccno.8325分生孢子在扫描电镜下为椭球状，表面不光滑，有不规则突起，大小约为4～6μm×3～4μm；菌丝在扫描电镜下为圆柱形，表面不光滑，有细小突起，有明显的分枝，主干较粗，支干较细，有横隔，但不明显(见附图3)。

实施例6：cgmccno.8325的分子生物学鉴定

将cgmccno.8325接种至100mlpdb培养基中，20℃，150r/min培养10d，培养后的菌丝悬浮液进行离心(10000r/min)，去上清液，-80℃条件下冻存2～3h后取出，用液氮研磨破壁至粉末状，将破壁后的菌液按真菌基因组提取试剂盒方法提取基因组，提取得到的dna溶解液在-20℃条件下保存。

特异性基因片段的pcr扩增采用真菌通用引物(由上海生工生物工程有限公司合成)，引物序列如下：

上游引物(its1)：5ˊ－tccgtaggtgaacctgcgg－3ˊ

下游引物(its4)：5ˊ－tcctccgcttattgatatgc－3ˊ

以上述提取的cgmccno.8325染色体dna为模板，pcr反应体系如下：染色体dna模板2μl；10×taqbuffer5μl；dntps(2.5mm)5μl；

上游引物(5μm)0.5μl；下游引物(5μm)0.5μl；pfudna聚合酶2.5μl；ddh2o34.5μl；总体积50μl。

pcr反应条件如下：pcr反应条件为：94℃4min，94℃30s→55℃30s→72℃30s，35个循环，72℃10min。

pcr产物采用pcr产物纯化试剂盒(上海生工)进行纯化，纯化产物经琼脂糖凝胶电泳(1.4％琼脂糖)验证，并送生工生物工程(上海)有限公司测序，测序结果及构建系统发育树见附图4。

经常规和分子鉴定，本菌株被命名为小盾壳霉(coniothyriumminitans)jn-cm，该菌株已送至中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)保藏，保藏号为cgmccno.8325。