一种裂殖壶菌菌株及其诱变方法和应用与流程

本申请是针对中国申请日为：2013年09月25日，申请号201310443058.9、名称为：“一种裂殖壶菌菌株及其诱变方法和应用”的发明专利申请提出的分案申请。

本发明属于微生物发酵领域，涉及一种裂殖壶菌菌株及其诱变方法和应用。

背景技术：

二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，dha)是哺乳动物生长所必需的多不饱和脂肪酸的一种，但由于需从外界摄取，因而被称为必需脂肪酸。研究表明，dha对婴幼儿大脑和视力发育具有非常重要的生理作用，并具有预防及治疗心血管疾病、防治老年痴呆、抑制癌变等生理功能，因而广泛用于食品、医药和饲料行业。

dha的传统来源为深海鱼油，但存在率低、资源有限和纯化工艺复杂等缺陷。海洋微生物被认为是dha最有前途的商业化来源，其中利用微藻(包括隐甲藻、真菌如裂殖壶菌和破囊壶菌等)培养生产dha具有更大的优势和生产潜能，但普遍存在发酵藻粉产率低、脂肪酸中dha含量不够高的缺陷。微藻中裂殖壶菌发酵生产dha的含量相对比较高，因此也被认为是最有希望实现dha产业化的微生物。

目前国内外有关如何提高dha含量的研究主要集中在以下几方面：(1)寻找高产dha的新菌株；(2)改进发酵工艺；(3)优化培养基；(4)添加外源因子。如培育的海洋真菌裂殖壶菌ouc88生产的dha占总脂肪酸的含量提高到23％～44％；在另一干法制取dha微藻油的方法的研究中，该方法可在1l发酵液中提取最高达27.6gdha；在第三种提高dha含量的研究中，通过优化裂殖弧菌菌株发酵培养基，使裂殖弧菌产生的dha占总脂肪酸含量达到35％；在第四种提高dha含量的研究中，通过外源添加因子促进微生物合成dha的方法，该方法通过在培养基中添加一种以上乙酸、柠檬酸和辛伐他汀，使dha占总脂肪酸含量最高达到42.65％。以上研究虽然都以提高菌株中脂肪酸的dha含量为目的，但往往考虑因素单一，并未综合探索如何大幅提高菌株中dha含量，使得生产dha的工艺复杂、成本增加，生产效率低，不利于实现裂殖壶菌生产dha的产业化。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供一种能快速生长且高效合成dha的裂殖壶菌tc5-2。

本发明实施例的另一目的是提供一种获得裂殖壶菌tc5-2的诱变方法。

本发明实施例的又一目的是提供一种裂殖壶菌tc5-2生产dha的应用。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种裂殖壶菌菌株，其分类名称为裂殖壶菌(schizochytriumlimacinum)tc5-2，并已于2013年3月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctccno：m2013075。

以及，一种裂殖壶菌tc5-2的诱变方法，包括以下步骤：

将裂殖壶菌菌种扩大培养得到种子液，将所述种子液接种至裂殖壶菌无菌发酵培养基中进行发酵培养，得对数生长期菌液；

将所述对数生长期菌液制成菌膜，并利用能量为10～30kev的n⁺离子束采用脉冲式对所述菌膜进行诱变处理，其中，所述诱变处理过程中的n⁺离子束的注入剂量为50×10¹⁷～200×10¹⁷ions/cm²；

将经诱变处理后的菌膜进行培养、筛选出dha产量高的裂殖壶菌tc5-2。

以及，上述裂殖壶菌株tc5-2或按照上述裂殖壶菌tc5-2的诱变方法获得裂殖壶菌tc5-2用于生产dha的应用。

上述新型的裂殖壶菌tc5-2繁殖能力强，且遗传性能稳定，是高产dha的理想菌株。

上述裂殖壶菌tc5-2的诱变方法中，通过n⁺离子束注入方式获得最佳诱变菌株tc5-2，该诱变方法简单易实施，诱变所得菌株突变率高，遗传性能稳定。

上述裂殖壶菌株tc5-2用于生产dha，其应用工艺简单，条件易控，效率高，且能显著提高总脂肪酸和dha的含量，有利于实现裂殖壶菌生产dha的产业化。

附图说明

图1是本发明实施例裂殖壶菌tc5-2的诱变方法工艺流程图；

图2是本发明实施例裂殖壶菌tc5-2的菌体形态图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种裂殖壶菌菌株，其分类名称为裂殖壶菌(schizochytriumlimacinum)tc5-2，并已于2013年3月12日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctccno：m2013075。该裂殖壶菌tc5-2的繁殖能力强，且遗传性能稳定，是高产dha的理想菌株。

相应地，本发明实施例还提供一种裂殖壶菌tc5-2的诱变方法，其诱变方法工艺流程如图1所示，该方法包括以下步骤：

s01.裂殖壶菌出发菌株的培养：以诱变前的裂殖壶菌为出发菌株，将出发菌种扩大培养得到种子液，将所述种子液接种至裂殖壶菌无菌发酵培养基中进行发酵培养，得对数生长期菌液；

s02.采用离子束诱变：在无菌条件下，将步骤s01中的对数生长期菌液制成菌膜，并利用能量为10～30kev的n⁺离子束采用脉冲式对所述菌膜进行诱变处理，其中，诱变处理过程中n⁺离子束的注入剂量为50×10¹⁷～200×10¹⁷ions/cm²；

s03.将经诱变后的菌膜进行培养、筛选处理：将步骤s02中诱变后的菌膜进行培养、筛选出dha产量高的裂殖壶菌tc5-2。

上述步骤s01中，裂殖壶菌tc5-2的出发菌株可以选用已知的裂殖壶菌，优选来源于广西北海海滩红树林分离筛选所得的裂殖壶菌菌株。

该步骤s01中，该裂殖壶菌无菌发酵培养基可以直接选用现有裂殖壶菌无菌发酵培养基，优选为下述利用裂殖壶菌tc5-2生产dha的方法中使用的无菌发酵培养基。通过对现有的发酵培养基进行改进，本发明的裂殖壶菌无菌发酵培养基营养丰富，可促进细胞的快速分裂和生长繁殖，显著提高菌种的生长率和繁殖率。

上述步骤s02中，采用氮离子束注入方式诱变菌种，致使裂殖壶菌发生变异，且随注入剂量的稳定增加，致死率也呈缓慢增长的趋势，见表1所示。优选地，上述氮离子束注入剂量可以是50×10¹⁷、100×10¹⁷、150×10¹⁷、200×10¹⁷ions/cm²。

上述步骤s03中，将经步骤s02离子束诱变处理的诱变菌种进行编号筛选。具体筛选方法是将编号的诱变菌种进行扩大培养，比较各种诱变菌株生产dha的含量，选出dha产率最高的诱变菌种。经筛选，发现裂殖壶菌tc5-2的dha产率最高，高达46.3％，因此选定裂殖壶菌tc5-2为最佳菌株，其菌体形态如图2所示。

该步骤s03中，诱变菌种的扩大培养可以将该诱变菌种直接接种至上述s01中的现有裂殖壶菌无菌发酵培养基进行扩大培养，优选直接接种至下述利用裂殖壶菌tc5-2生产dha的方法中使用的无菌发酵培养基进行扩大培养。

由上所述，上述裂殖壶菌tc5-2的诱变方法中，通过n⁺离子束注入方式获得最佳诱变菌株tc5-2，该诱变方法简单易实施，诱变所得菌株突变率高，遗传性能稳定。

相应地，本发明实施例还提供裂殖壶菌tc5-2的应用，具体是将裂殖壶菌tc5-2用于生产dha。

在具体实施例中，利用裂殖壶菌tc5-2生产dha的方法包括如下步骤：

将上述裂殖壶菌tc5-2接种至裂殖壶菌无菌发酵培养基中进行扩大培养。

作为优选实施例，上述裂殖壶菌无菌发酵培养基包括如下含量的组分：

上述无菌发酵培养基的碳源为葡萄糖，氮源为玉米浆、大豆蛋白胨和酵母膏。除此之外，培养基中还添加复配的人工海水，除利用海水中天然存在的无机盐外，培养基另外再通过添加人造海水以提供充足的p源、s源以及mn²⁺、zn²⁺等离子，除保证一定的盐度外，还保持细胞的渗透压平衡，并为细胞的生长繁殖提供了必需物质。

在进一步优选实施例中，上述人造海水包含如下含量的组分：

上述无菌发酵培养基还添加种类丰富的维生素。将各种功能不同的维生素混合后，共同参与机体代谢的调节，从而适合更多的裂殖壶菌菌种生长，进一步促进裂殖壶菌中dha的积累。如本发明通过对比实验，即不添加复合维生素(对比实施例2)时，其dha含量与添加复合维生素(实施例6)相比，减少40.7％，表明复合维生素提高裂殖壶菌tc5-2的dha含量。

在进一步优选实施例中，上述复合维生素溶液包含如下含量的组分：

另外，上述培养基中还添加10～30μmol/l外源因子烯草酮。

该培养基中加入微量的烯草酮后，能有效提高裂殖壶菌tc5-2中脂肪酸和dha含量的积累。与不添加烯草酮(对比实施例3)相比，添加烯草酮(实施例6)的菌株dha含量增加48.33％，表明烯草酮对裂殖壶菌dha合成有促进作用，能显著提高裂殖壶菌中dha的含量。

作为优选实施例，上述扩大培养的条件可以按照其他裂殖壶菌常规的培养条件进行扩大培养。但是为了提高dha的产率和效率，在优选实施例中，该扩大培养的条件为：在前40小时内温度为21-25℃，然后温度控制为15-20℃。

在进一步优选实施例中，上述扩大培养过程中的通气量为0.5～2.0vvm，且该扩大培养在气升式反应器中进行。

这样，上述扩大培养优选先在较高的培养温度下提高细胞浓度，然后降低温度以积累dha；同时，本发明优选使用气升式反应器显著降低机械搅拌对菌体生长的抑制，便于dha的积累。另外，通入一定量的空气有助于提高培养基中氧浓度，有利于异养需氧型的裂殖壶菌的生长和繁殖。

由上所述，上述裂殖壶菌tc5-2不仅经优化处理的无菌发酵培养基培养，同时添加外源因子烯草酮，并结合优化的发酵工艺进行dha的工业化生产，培养条件考虑全面，应用工艺简单，条件易控，效率高，且能显著提高总脂肪酸和dha的含量，有利于该菌株及其应用工艺的大力推广。

现以裂殖壶菌tc5-2的诱变、筛选以及生产dha的方法为例，对本发明实施例进行进一步详细说明。

实施例1

裂殖壶菌tc5-2的诱变，包括以下步骤：

s11.裂殖壶菌的培养：以诱变前的裂殖壶菌(广西北海海滩红树林分离筛选所得的裂殖壶菌株)为出发菌株，挑选出发菌株的单菌落，在10ml液体无菌发酵培养基(无菌发酵培养基包含的成分为：人造海水600g/l；大豆蛋白胨30g/l；酵母膏40g/l；葡萄糖90g/l；玉米浆15g/l；复合维生素溶液5g/l；烯草酮20μmol/l。其中，人造海水配方为：nacl28g/l、mgcl25g/l、kcl1g/l、cacl21.5g/l、nahso46g/l、na2co38g/l、na2so410g/l、mgso43g/l、mnso45g/l、kh2po44g/l、k2hpo47g/l、znso43g/l；复合维生素溶液配方为：维生素b13g/l、维生素b210g/l、维生素b58g/l、维生素b64g/l、维生素pp10g/l、生物素12g/l、叶酸45g/l、肌醇4g/l。)试管中，25℃和150r/min条件下振荡培养36小时后，以10％接种量接种到装有50ml发酵培养基(同上)的三角瓶中，25℃和150r/min条件下振荡培养36小时，即得对数生长期菌液；

s12.离子束诱变：在无菌条件下，往每个灭菌的空平皿里加入1ml上述对数生长期菌液，涂匀制成菌膜，将能量为20kev的n⁺离子束以双等离子体源脉冲式注入由对数生长期菌液制成的菌膜中，其中注入剂量为下文表1中实施例1的剂量。

实施例2

裂殖壶菌tc5-2的诱变，该诱变参照实施例1的诱变步骤，其中，在s12的离子束诱变步骤中，双等离子体源脉冲式注入由对数生长期菌液制成的菌膜中，注入剂量为下文表1中实施例2的剂量。

实施例3

裂殖壶菌tc5-2的诱变，该诱变参照实施例1的诱变步骤，其中，在s12的离子束诱变步骤中，双等离子体源脉冲式注入由对数生长期菌液制成的菌膜中，注入剂量为下文表1中实施例3的剂量。

实施例4

裂殖壶菌tc5-2的诱变，该诱变参照实施例1的诱变步骤，其中，在s12的离子束诱变步骤中，双等离子体源脉冲式注入由对数生长期菌液制成的菌膜中，注入剂量为下文表1中实施例4的剂量。

将实施例1-4诱变处理后的菌膜进行致死率的测定，测定结果如表1所述：

表1

由表1可知，在注入剂量分别呈50、100、150、200×10¹⁷ions/cm²梯度递进的条件下，注入剂量与菌种的致死率保持类似正比增长的趋势。考虑到菌种的正负突变率，n⁺离子束注入剂量选定为100×10¹⁷ions/cm²。

实施例5

经n⁺离子束诱变后的诱变菌种的筛选：

将按照上述实施例2的诱变方法处理后的诱变菌膜用9ml培养液洗出，然后分别稀释涂平板。25℃条件下培养72小时，待长出菌落后，挑选菌落，并按照下表2中进行编号，随后摇瓶培养，72小时后检测所得各个菌株的脂肪酸及dha，由此确定dha产量最高的诱变菌株。其中，经72小时后各编号菌株的脂肪酸及dha的检测结果见下表2。

表2

由表2可知，编号为tc5-2的诱变菌株dha产量最高，且总脂肪酸含量的产量也高，为生产dha的理想菌株。

实施例6

利用实施例5中筛选的裂殖壶菌tc5-2进行扩大培养用于提取dha。

将实施例5中筛选的裂殖壶菌tc5-2接种至实施例1步骤s11中的无菌发酵培养基中，并将接种后的培养基置于5l机械搅拌反应器进行扩大培养从而发酵产dha，控制温度20℃，控制搅拌速度200r/min,通气量0.5vvm。培养60h后进行检测，菌株量达到32.3g/l，总脂肪酸含量达到56.3％，dha含量达到46.3％。

对比例1

将实施例1步骤s11的出发菌株不经诱变处理直接按照实施例6的培养条件进行培养60h后进行检测，菌株量达到22.6g/l，总脂肪酸含量达到45.4％，dha含量达到38.2％。

比较实施例6与对比例1可知，出发菌株经诱变处理，诱变后筛选出的裂殖壶菌tc5-2菌株量提高42.9％，总脂肪酸含量提高24.01％，dha含量提高21.2％，此数据表明在同样的发酵条件下，氮离子束诱变获得的裂殖壶菌tc5-2的菌株量、总脂肪酸含量以及dha含量都显著提高。

对比例2

按照实施例6对裂殖壶菌tc5-2进行扩大培养用于提取dha，与实施例6不同之处在于，无菌发酵培养基不含有5g/l的复合维生素溶液，即将实施例5中筛选的裂殖壶菌tc5-2接种至如下无菌发酵培养基：

人造海水600g/l；大豆蛋白胨30g/l；酵母膏40g/l；葡萄糖90g/l；玉米浆15g/l；烯草酮20μmol/l。其中，人造海水配方为：nacl28g/l、mgcl25g/l、kcl1g/l、cacl21.5g/l、nahso46g/l、na2co38g/l、na2so410g/l、mgso43g/l、mnso45g/l、kh2po44g/l、k2hpo47g/l、znso43g/l。

培养60h后进行检测，菌体量达到15.3g/l，总脂肪酸含量达到32.5％，dha含量达到27.5％。与实施例6相比，其菌体量减少52.6％，总脂肪酸减少42.3％，dha含量减少40.7％，表明复合维生素溶液为裂殖壶菌提供丰富的营养环境，进一步有利于裂殖壶菌tc5-2的dha含量的提高。

对比例3

按照实施例6对裂殖壶菌tc5-2进行扩大培养用于提取dha，与实施例6不同之处在于，无菌发酵培养基不含烯草酮组分，即将实施例5中筛选的裂殖壶菌tc5-2接种至如下无菌发酵培养基：

人造海水600g/l；大豆蛋白胨30g/l；酵母膏40g/l；葡萄糖90g/l；玉米浆15g/l；复合维生素溶液5g/l。其中，人造海水配方为：nacl28g/l、mgcl25g/l、kcl1g/l、cacl21.5g/l、nahso46g/l、na2co38g/l、na2so410g/l、mgso43g/l、mnso45g/l、kh2po44g/l、k2hpo47g/l、znso43g/l；复合维生素溶液配方为：维生素b13g/l、维生素b210g/l、维生素b58g/l、维生素b64g/l、维生素pp10g/l、生物素12g/l、叶酸45g/l、肌醇4g/l。

培养60h后进行检测，菌体量达到30.1g/l，总脂肪酸含量达到43.5％，dha含量达到31.2％。与实施例6相比，其菌体量减少6.81％，总脂肪酸减少22.74％，dha含量减少32.58％，表明外源因子烯草酮促进裂殖壶菌tc5-2合成dha。

实施例7

按照实施例5中筛选的裂殖壶菌tc5-2进行扩大培养用于提取dha：采用机械搅拌反应器发酵产dha。

将实施例5中筛选的裂殖壶菌tc5-2接种至实施例1步骤s11中的无菌发酵培养基中，并将接种后的培养基置于5l机械搅拌反应器中进行扩大培养从而发酵产dha，控制温度25℃，控制溶氧30％，通气量1.5vvm。培养60h菌株量达到41.2g/l，总脂肪酸含量达到52.5％，dha含量达到45.8％。

将该实施例7与实施例6相比，本实施例的扩大培养能使其菌体量增加27.55％，总脂肪酸减少6.75％，dha含量减少1.04％，表明适当提高培养温度和通气量能促进细胞的生长和繁殖，但不利于总脂肪酸和dha的积累，这可能与高温促进细胞的繁殖但抑制dha的合成有关。

实施例8

利用实施例5中筛选的裂殖壶菌tc5-2进行扩大培养用于提取dha：采用气升式反应器发酵产dha。

将实施例5中筛选的裂殖壶菌tc5-2接种至实施例1步骤s11中的无菌发酵培养基中，并将接种后的培养基置于10l气升式反应器进行扩大培养从而发酵产dha，控制温度25℃，通气量1.5vvm。培养60h菌株量达到40.1g/l，总脂肪酸含量达到55.2％，dha含量达到49.2％。

将该实施例8与实施例7的机械搅拌反应器培养相比，其菌体量略微下降2.67％，但总脂肪酸增加5.14％，dha含量增加7.42％。表明气升式反应器发酵降低了机械搅拌的剪切力，有利于dha含量的积累。

实施例9

按照实施例8对裂殖壶菌tc5-2进行扩大培养用于提取dha，与实施例8不同之处在于在扩大培养中，控制温度25℃，通气量调至0.5vvm。培养60h菌株量达到35.2g/l，总脂肪酸含量达到48.4％，dha含量达到46.2％。

将该实施例9与实施例8相比，其菌体量减少12.22％，总脂肪酸减少12.32％，dha含量减少6.10％。表明单独减小通气量，会使菌体量、总脂肪酸以及dha含量同时减少。这是因为裂殖壶菌属于异养需氧型微生物，减小通气量抑制其细胞的生长速率，尤其是直接降低菌体量和总脂肪酸的含量。

实施例10

利用实施例5中筛选的裂殖壶菌tc5-2进行扩大培养用于提取dha：采用气升式反应器温度变换控制发酵产dha

将实施例5中筛选的裂殖壶菌tc5-2接种至实施例1步骤s11中的无菌发酵培养基中，并将接种后的培养基置于10l气升式反应器进行扩大培养从而发酵产dha，在培养过程中，前40小时控制温度25℃，然后控制温度15℃，通气量2.0vvm。培养60h菌株量达到38.6g/l，总脂肪酸含量达到57.2％，dha含量达到52.4％。

将该实施例10与实施例8的恒温培养相比，其菌体量略微下降2.67％，但总脂肪酸增加5.14％，dha含量增加7.42％。表明前期在较高的培养温度下培养可提高细胞浓度，然后降低培养温度有利于积累dha。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。