裂殖壶菌WZYU011及其生产凝乳酶的方法与流程

(一)技术领域

本发明涉及一种凝乳酶的制备，特别涉及一种利用裂殖壶菌生产凝乳酶的方法。

(二)

背景技术：

裂殖壶菌(aurantiochytriumsp.)是一种海洋类真菌的异养型微生物，其细胞中富含dha等重要多不饱和脂肪酸，已成为世界上最常用的dha高产菌株。裂殖壶菌分布于海洋生境，能够利用自身的多酶体系高效分解环境基质，满足自身快速生长的需求，其数量级甚至超过细菌，而且作为分解者参与海洋环境物质循环，具有重要的生态学意义。

凝乳酶是奶酪生产中使牛奶凝固的关键酶，属于酸性蛋白酶，又称天冬氨酸蛋白酶，其产值占整个酶制剂总产值的15.5％，市场需求量巨大。凝乳酶的传统来源是哺乳期小牛的皱胃，因其具有较高的凝乳和蛋白水解能力而成为奶酪制作的首选酶。然而动物来源的酶成本昂贵，且提取程序和工艺较为复杂，已不能满足现代工业对于凝乳酶的要求。所以，研究者不断寻求新的凝乳酶资源。微生物具有生长速度快、生产成本低、占地面积小和易于控制生产条件等优点，而且微生物凝乳酶多属胞外酶，提取方便，使其具有较好的发展前景。目前微生物凝乳酶主要由米黑毛霉、微小毛霉和粟疫霉等霉菌通过固态发酵生产，霉菌容易产生菌丝体，影响产酶；另外与固态发酵相比，液态发酵技术具有发酵时间短、过程易于控制和产量高等优势。而关于裂殖壶菌来源的凝乳酶及其液态发酵生产的研究并未见报道。裂殖壶菌已通过fda安全认证，中国卫生部也将其加入安全的食品添加剂名录，故广泛应用于食品和饲料工业。该菌能够利用廉价基质快速生长，很大程度上降低了其发酵产品的成本，有利于工业化生产。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种新菌株--裂殖壶菌(aurantiochytriumsp.)wzyu011及利用裂殖壶菌wzyu011高效生产凝乳酶的方法。本发明首次使用已通过食品安全认证的海洋微生物裂殖壶菌，采用廉价原料高效生产凝乳酶，有效降低了凝乳酶的生产成本，且整个工艺流程简单，设备要求低，可控性强，适用于工业化生产。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株--裂殖壶菌(aurantiochytriumsp.)wzyu011，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccno:m2016619，保藏日期为：2016年11月7日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。

本发明还提供一种利用裂殖壶菌wzyu011生产凝乳酶的方法，所述方法为：将裂殖壶菌wzyu011接种至发酵培养基中，在25-35℃下，50-600rpm振荡培养，得到发酵液，将发酵液离心，弃细胞沉淀，得到含凝乳酶的粗酶液，将粗酶液分离纯化，获得凝乳酶；所述发酵培养基组成为：葡萄糖40-120g/l，酵母粉10-20g/l，蛋白胨5-20g/l，海盐20g/l，溶剂为水，ph值自然。

进一步，所述裂殖壶菌wzyu011接种前先进行斜面活化和种子扩大培养：(1)斜面培养：将裂殖壶菌wzyu011接种于斜面培养基上，25-35℃下培养1-3天；所述斜面培养基组成为：葡萄糖20g/l，酵母粉10g/l，蛋白陈5g/l，海盐20g/l，琼脂20g/l，溶剂为水，ph值自然；(2)种子培养：将斜面培养基上的菌体接入含100ml种子培养基的500ml三角瓶中，在25-35℃下，50-300rpm震荡培养1-3天，得到种子液；所述种子培养基组为：葡萄糖60g/l，酵母粉10g/l，蛋白陈5g/l，海盐20g/l，溶剂为水，ph值自然。

进一步，所述裂殖壶菌wzyu011发酵培养方法为：将种子液接入含发酵培养基的发酵罐中，在25-35℃下，转速50-600rpm，通气量40-100l/min，溶氧量20-60％的条件下，培养时间1-6天，获得发酵液。

进一步，所述种子液以体积浓度的1％-10％的接种量接种至发酵培养基。

进一步，所述发酵培养时间为1-6天。

进一步，所述发酵液在5000rpm，4℃下离心5min，获得粗酶液。

进一步，所述发酵培养基组成为：葡萄糖60g/l，酵母粉20g/l，蛋白胨10g/l，海盐20g/l，溶剂为水，ph值自然。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

裂殖壶菌较其它凝乳酶生产菌株有很多优势：(1)生长速率快，在1-3天的时间内即可达到5-20g/l生物量，并生产大量凝乳酶，酶活力可达50-300u/ml；(2)能够利用葡萄糖、酵母粉和蛋白胨等传统廉价的原料，发酵培养基中的海盐组分能够替代其它菌种发酵生产凝乳酶所必须的无机盐，大大降低生产成本；(3)生产凝乳酶的方式为胞外分泌，大大简化了凝乳酶的提取和分离工艺，适合工业化生产；(4)安全性高，可以广泛应用于食品领域。在廉价培养基中，在1-5天的时间内，裂殖壶菌的凝乳酶产量可达50-300u/ml。(5)用该菌株发酵产酶过程比传统的霉菌相比，缩短生产周期，降低发酵成本，易于控制，使凝乳酶大规模生产和应用成为可能；该凝乳酶为胞外酶，易于分离、纯化和应用，且活力较高，适合工业化生产和应用；裂殖壶菌已通过各级安全认证，其来源的凝乳酶可用于食品、医药和饲料等各种领域。

(四)附图说明

图1是实施例1裂殖壶菌wzyu011在牛奶平板上产生的透明圈。

图2是实施例2裂殖壶菌wzyu011菌种平板菌落形态。

图3是实施例2裂殖壶菌wzyu011菌种显微细胞形态。

图4是实施例6裂殖壶菌wzyu011凝乳酶沉降奶粉溶液的效果；a200μl蒸馏水与5ml100g/l脱脂奶粉水溶液反应(对照)；b为500μl粗酶液与5ml100g/l脱脂奶粉水溶液反应；c为200μl粗酶液与5ml100g/l脱脂奶粉水溶液反应。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1产凝乳酶裂殖壶菌wzyu011的筛选

(1)菌株wzyu011筛选

在浙江省温州市乐清湾海边采集腐叶样品，洗净放于表面悬浮0.1g松花粉的yp培养液(1g/l酵母粉，1g/l蛋白胨，50mg/l氨苄青霉素，50mg/l链霉素，水配制，ph6.0)中，30℃黑暗培养1周，取50μl培养物涂布于yp平板(1g/l酵母粉，1g/l蛋白胨，50mg/l氨苄青霉素，50mg/l链霉素，琼脂20g/l，水配制，ph值6.0)上，28℃培养3天，直到长出单菌落，重复划线gyp平板纯化培养三次，得到纯的菌株。将纯的菌落点种于牛奶-gyp平板上，30℃倒置静止培养3天，观察透明圈(图1)，记为菌株wzyu011。

gyp平板培养基组分为(g/l):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白陈5，海盐20，琼脂20，溶剂为水，ph值自然，115℃灭菌30min，倒制平板。

牛奶-gyp平板组分为(g/l)：a：4％(w/v)的牛奶；b：4％(w/v)的琼脂；c：gyp固体培养基(g/l):葡萄糖60，酵母粉10，蛋白陈5，海盐20，琼脂20，溶剂为水，ph值自然。将灭菌的a，b两种培养基组分混合，倒入平板，待培养基凝固后倒入gyp固体培养基，制成牛奶-gyp双层平板。

(2)菌株wzyu011鉴定

生理生化特征：

将菌株wzyu011接种在gyp平板上，28℃培养2天，菌落呈黄白色，圆形，表面湿润光滑，微微隆起(图2)；在显微镜下细胞呈圆形或椭圆形，直径5-20μm，细胞表面比较明亮，有鳞片状结构，边缘清晰，细胞分裂增殖，有偶数个细胞聚集在一起的现象(图3)。

菌株wzyu011的18srdna序列见seqidno.1所示。与aurantiochytriumsp.菌株krs101和st-2012等菌株的18srdna序列相似度可达99％，故将将菌株wzyu011鉴定为裂殖壶菌(aurantiochytriumsp.)，命名为裂殖壶菌(aurantiochytriumsp.)wzyu011，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：cctccm2016619，保藏日期为：2016年11月7日，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。

实施例2裂殖壶菌wzyu011液体发酵生产凝乳酶

将-80℃保存的裂殖壶菌wzyu011菌株转接到斜面培养基上，30℃静止培养2天；将菌体接入含100ml种子培养基的500ml三角瓶中，30℃，200rpm震荡培养1天，得到种子液；将种子液按体积浓度4％的接种量转到含3l发酵培养基的发酵罐中，30℃，转速300rpm，通气量80l/min，溶氧量60％条件下培养3天，得到发酵液，生物量可达10g/l；将发酵液5000rpm，4℃下离心5min，弃细胞沉淀得到粗酶液，经测定凝乳酶活力是100u/ml。

凝乳酶活力测定方法是：取0.4ml粗酶液与1ml含40mg/l牛血红蛋白溶液混合(牛血红蛋白购自美国sigma公司，溶于20mmph为3.4的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)，温度40℃下保温1h后迅速加入0.4ml15％(w/v)tca(三氯乙酸)水溶液终止反应。tca加入对照管中的时间要在加入底物前面。将试管于冰浴中静置20min，然后10000rpm离心20min，取上清，使用分光光度计，于280nm处下测定吸光度。酶活定义是在1h内，测得溶液吸光度在280nm下每增加0.01作为一个酶活单位u。

斜面培养基组分为(g/l):葡萄糖20，酵母粉10，蛋白陈5，海盐20，琼脂20，溶剂为水，ph值自然，115℃灭菌30min；种子培养基为(g/l):葡萄糖60，酵母粉10，蛋白陈5，海盐20，溶剂为水，ph值自然，115℃灭菌30min；发酵培养基为(g/l):葡萄糖40，酵母粉10，蛋白胨5，海盐20，溶剂为水，ph值自然，115℃灭菌30min。

实施例3裂殖壶菌wzyu011液体发酵生产凝乳酶

将-80℃保存的裂殖壶菌wzyu011菌株转接到斜面培养基上，25℃静止培养3天；将菌体接入含100ml种子培养基的500ml三角瓶中，25℃，300rpm震荡培养3天，得到种子液；将种子液按体积浓度10％的接种量转到含3l发酵培养基的发酵罐中，25℃，转速600rpm，通气量40l/min，溶氧量40％条件下培养6天，得到发酵液，生物量可达19.5g/l；将发酵液5000rpm，4℃下离心5min，弃细胞沉淀得到粗酶液，经实施例2方法测定凝乳酶活力是150u/ml。

斜面培养基、种子培养基组成同实施例2，发酵培养基为(g/l):葡萄糖60，酵母粉15，蛋白胨10，海盐20，溶剂为水，ph值自然，115℃灭菌30min。

实施例4裂殖壶菌wzyu011液体发酵生产凝乳酶

将-80℃保存的裂殖壶菌wzyu011菌株转接到斜面培养基上，35℃静止培养1天；将菌体接入含种子培养基的500ml三角瓶中，35℃，50rpm震荡培养1天，得到种子液；将种子液按体积浓度1％的接种量转到含3l发酵培养基的发酵罐中，35℃，转速50rpm，通气量100l/min，溶氧量20％条件下培养1天，得到发酵液，生物量可达5.1g/l；将发酵液5000rpm，4℃下离心5min，弃细胞沉淀得到粗酶液，经实施例2方法测定凝乳酶活力是50u/ml。

斜面培养基和种子培养基组成同实施例2，发酵培养基为(g/l):葡萄糖120，酵母粉20，蛋白胨20，海盐20，溶剂为水，ph值自然，115℃灭菌30min。

实施例5裂殖壶菌wzyu011液体发酵生产凝乳酶

将-80℃保存的裂殖壶菌wzyu011菌株转接到斜面培养基上，28℃静止培养2天；将菌体接入含100ml种子培养基的500ml三角瓶中，28℃，200rpm震荡培养2天，得到种子液；将种子液按体积浓度10％的接种量转到含3l发酵培养基的发酵罐中，28℃，转速500rpm，通气量70l/min，溶氧量50％条件下培养5天，得到发酵液，生物量可达20.3g/l；将发酵液5000rpm，4℃下离心5min，弃细胞沉淀得到粗酶液，经实施例2方法测定凝乳酶活力是300u/ml。

斜面培养基和种子培养基组成同实施例2，发酵培养基为(g/l):葡萄糖50，酵母粉15，蛋白胨10，海盐20，溶剂为水，ph值自然，115℃灭菌30min。

实施例6裂殖壶菌wzyu011来源凝乳酶在牛奶凝聚中的应用

将实施例5制备的粗酶液200μl和500μl分别与5ml100g/l脱脂奶粉水溶液(脱脂奶粉购自中国完达山公司，溶于蒸馏水中)混合，充分振荡混匀，在温度35℃下保温，1分钟后奶粉溶液便开始凝聚，观察拍照(图4)。

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<110>浙江工业大学

<120>裂殖壶菌wzyu011及其生产凝乳酶的方法

<130>

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