一种促进裂殖壶菌产油脂的方法与流程

本发明属于运动鞋用材料技术领域，具体涉及一种促进裂殖壶菌产油脂的方法。

背景技术：

多不饱和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids，pufas)在人体中具有重要的作用，如：维持细胞膜结构和功能，降低胆固醇和甘油三酯等功能。pufas分为omega-6(或ω-6)和omega-3(或ω-3)两个系列，大多数人可以从膳食中获得足够的ω-6pufa，但可能缺乏适量的ω-3pufa。ω-3pufa系列中的二十碳五稀酸(eicosapentaenoicacid，epa)和二十二碳六稀酸(docosahexaenoicacid，dha)因为对人体重要作用而引起广泛的关注(comprehensivereviewsinfoodscience&foodsafety，2010，9(6)：655-675；internationalfoodresearchjournal，2011，18：493-499；marinedrugs，2013，11(7)：2259-81)。epa对心血管系统具有良好作用，尤其是在治疗动脉硬化、高血脂、精神分裂症等方面尤为显著(processbiochemistry，2005，40：3627-3652)。dha又被称为“脑黄金”，具有促进大脑发育、降血脂、降血压、保护视力、防止老年痴呆等方面具有重要作用(中国油脂，2016，41(5)：60-64)。

传统pufas主要从鱼油中获得(marinedrugs，2013，11(7)：2259-81)，但是由于渔业中过度捕捞和海水污染等问题，鱼油产量和食品安全性等问题制约着ω-3pufa产量的发展。近20年来，利用微海洋微生物产ω-3pufa的方法日益兴起(journalofnutritionalscience，2015，4)。其中裂殖壶菌(schizochytriumsp.)为一种海洋真菌，由于其生长速度快、易于培养、胞内ω-3pufas含量高等特点而成为目前工业化生产pufas的主要菌株(生物加工工程，2013，11(5)：21-25)。

目前，针对裂殖壶菌进行传统的培养条件和培养方法的优化，裂殖壶菌产油脂量占生物量只有50％左右(中国海洋大学学报(自然科学版)，2007，37(2)：293-29；)，仍然较低，为了更好地应用于实际生产提高裂殖壶菌产油量则十分关键。

在裂殖壶菌传统优化培养基的基础上添加外源物有以下几种如：芝麻素(lipids，1991，26(7)：512-516)、姜黄素(biosciencebiotechnologyandbiochemistry，2000，64(8)：1641-5)以及辣椒素(biosciencebiotechnologyandbiochemistry，2001，65(8)：1859-1863)，但是这类物质在代谢过程中抑制油脂的去饱和。寻找对油脂积累有积极作用的外源添加剂对将裂殖壶菌应用于工业生产十分必要，苯甲酸对位衍生物这一类外源物中包含很多物质，其中如叶酸和对氨基苯甲酸，他们都是b族维生素中的一种，叶酸对微生物具有十分重要的作用，它是生化反应中一碳单位转移酶系的辅酶，是一碳单位的重要受体和供体(农产品加工·学刊，2006(5)：31-35；四川食品与发酵，2003(04))，并作为甲基供体参与细胞内的甲基化反应(chinesejournalofcancer，2003，22(6)：668-671)，对氨基苯甲酸是叶酸的组成部分之一，而对甲苯甲酸和苯甲酸钠都是对氨基苯甲酸的结构类似物，他们都可能有促进裂殖壶菌产油脂的作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种促进裂殖壶菌产油脂的方法。

本发明的技术方案如下：

一种促进裂殖壶菌产油脂的方法，在裂殖壶菌的发酵培养基中一次添加终浓度为100mg/l～3g/l的苯甲酸对位衍生物，添加苯甲酸对位衍生物的时机为发酵培养开始至发酵培养结束前1～2d中的任意时间。

在本发明的一个优选实施方案中，所述苯甲酸对位衍生物包括苯甲酸钠、对甲基苯甲酸、叶酸和对氨基苯甲酸。

在本发明的一个优选实施方案中，包括如下步骤：

(1)将保存在甘油管中的裂殖壶菌接入18～22ml的种子培养基中，接种量为2～10％，于20～30℃的温度及150～200rpm的转速下，培养24～48h，获得一级种子；

(2)将上述一级种子接入18～22ml的种子培养基中，接种量为2～10％，于20～30℃的温度及150～200rpm的转速下，培养24～48h，获得二级种子；

(3)将二级种子接入45～55ml的发酵培养基中，接种量为2～10％，于20～30℃的温度及150～200rpm的转速下，培养4～7dh，期间择机一次加入苯甲酸对位衍生物，以发酵生产多不饱和脂肪酸，得发酵液，添加苯甲酸对位衍生物的时机为发酵培养开始至发酵培养结束前1～2d中的任意时间；

(4)对上述发酵液中的油脂进行提取和纯化。

进一步优选的，所述种子培养基的ph为6～8，配方为：葡萄糖30g/l、酵母抽提物10g/l、硫酸钠12g/l、氯化钾0.5g/l、硫酸镁2g/l、硫酸钾0.65g/l、磷酸二氢钾1g/l、硫酸铵1g/l、二水合氯化钙0.17g/l。

进一步优选的，所述发酵培养基的ph为6～8，配方为：葡萄糖90g/l、谷氨酸钠5g/l、固体玉米将干粉5g/l、硫酸钠12g/l、氯化钾0.5g/l、硫酸镁2g/l、硫酸钾0.65g/l、磷酸二氢钾1g/l、硫酸铵1g/l、二水合氯化钙0.17g/l、七水合硫酸锌3mg/l、六水合氯化钴0.04mg/l、五水合硫酸铜2mg/l、六水合硫酸镍2mg/l、七水合硫酸铁10mg/l、泛酸钙3.2mg/l、四水合氯化锰3mg/l、二水合钼酸钠0.04mg/l、维生素b19.5mg/l、维生素b120.15mg/l。

进一步优选的，所述步骤(4)包括如下步骤：

1)准确吸取适量发酵液于1具塞试管中，混匀后再加入适量浓盐酸，于60～70℃水浴加热40～50min至菌体消化完全；

2)再加入适量正己烷，加塞充分摇匀，静置分层，取上层有机相置于已恒重的磨口锥形瓶中，用正己烷重复洗涤3～5次，直至上层有机相无色；

3)通过氮吹的方法除去有机溶剂至恒重，计算总油脂产量。

本发明的有益效果：本发明的通过在发酵培养基中添加适量苯甲酸对位衍生物中的苯甲酸钠相较于裂殖壶菌在原始培养基中油脂产量提高了32.12％，添加对甲基苯甲酸油脂产量提高了38.21％，叶酸的添加使油脂产量提高了56.84％，对氨基苯甲酸使油脂产量提高了66.51％，但这类物质的添加对ω-3pufa并无抑制作用。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同苯甲酸钠浓度下裂殖壶菌发酵液中油脂的变化量曲线图。

图2为本发明实施例2中不同对甲基苯甲酸浓度下裂殖壶菌发酵液中油脂的变化量曲线图。

图3为本发明实施例3中不同叶酸浓度下裂殖壶菌发酵液中油脂的变化量曲线图。

图4为本发明实施例4中不同对氨基苯甲酸浓度下裂殖壶菌发酵液中油脂的变化量曲线图。

图5为本发明实施例4中的脂肪酸的分析鉴定结果。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

下述实施例中，种子培养基的ph为6～8，配方为：葡萄糖30g/l、酵母抽提物10g/l、硫酸钠12g/l、氯化钾0.5g/l、硫酸镁2g/l、硫酸钾0.65g/l、磷酸二氢钾1g/l、硫酸铵1g/l、二水合氯化钙0.17g/l；发酵培养基的ph为6～8，配方为：葡萄糖90g/l、谷氨酸钠5g/l、固体玉米将干粉5g/l、硫酸钠12g/l、氯化钾0.5g/l、硫酸镁2g/l、硫酸钾0.65g/l、磷酸二氢钾1g/l、硫酸铵1g/l、二水合氯化钙0.17g/l、七水合硫酸锌3mg/l、六水合氯化钴0.04mg/l、五水合硫酸铜2mg/l、六水合硫酸镍2mg/l、七水合硫酸铁10mg/l、泛酸钙3.2mg/l、四水合氯化锰3mg/l、二水合钼酸钠0.04mg/l、维生素b19.5mg/l、维生素b120.15mg/l。

实施例1

(1)将保存在甘油管中的裂殖壶菌atcc1381(来源于美国atcc菌株保藏中心)接入装有20ml种子培养基的100ml摇瓶中，接种量为2％～10％，在20～30℃的摇床中，以150～200rpm的转速，培养24～48h，获得一级种子；

(2)将一级种子接入装有20ml种子培养基的100ml摇瓶中，接种量为2％～10％，在20～30℃的摇床中，以150～200rpm的转速，培养24～48h，获得二级种子；

上述种子培养基的ph为6～8，其中含有碳源、氮源、磷源、硫源、玉米浆粉、酵母粉、硫酸铵和谷氨酸钠，碳源为葡萄糖，氮源包括有机氮源和无机氮源，磷源为磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，硫源为硫酸镁或硫酸铵；

(3)将二级种子接入装有50ml发酵培养基的250ml摇瓶中，接种量为2％～10％，在20～30℃的摇床中，以150～200rpm的转速，培养7d，期间择机一次加入苯甲酸钠，以发酵生产多不饱和脂肪酸，得发酵液，添加苯甲酸钠的时机为发酵培养开始至发酵培养结束前1～2d中的任意时间，

上述苯甲酸钠的添加方法如下：将苯甲酸钠溶于水配成100×～1000×浓缩液，通过0.22μmmce的滤膜过滤除菌后，取适量加入发酵培养基，使其终浓度为0～4g/l；

(4)分别取第4～7d的发酵液测不同苯甲酸钠浓度下总油脂的含量，并对脂肪酸进行分析鉴定，具体结果如图1所示；

总油脂含量的测定方法如下：

1)准确吸取3ml发酵液于10ml具塞试管中，混匀后再加入4ml质量分数为38％的浓盐酸。于60～70℃水浴加热40～50min至菌体消化完全；

2)再加入3～5ml正己烷，加塞充分摇匀，静置分层，取上层有机相置于已恒重的磨口锥形瓶中。用正己烷重复洗涤3～5次，直至上层有机相无色；

3)通过氮吹的方法除去有机溶剂至恒重，计算总油脂(totalfattyacid，tfa)产量。

分析鉴定的具体方法如下：

1)准确称取一定量(约0.1g)的步骤(4)所得的油脂，置于50ml磨口锥形瓶中，加入5ml的0.5mol/l的koh-ch3oh溶液于65℃水浴回流至油滴消失(大约10min)，从冷凝管顶部加入5ml30％的三氟化硼乙醚反应30min；

2)冷却后加入5ml正己烷振荡，加入适量内标物(如十七烷酸甲酯)然后加入足量的饱和食盐水，静置分层后取上层正己烷相并加入无水硫酸钠脱水，过滤，所得样品即可进行气象色谱分析；气象色谱条件：选用sp2560色谱柱(avondale，pennsylvania)(30m*0.25mm*0.25m)，采用程序升温：初始温度100℃，然后按20℃/min升温到180℃，再按15℃/min升温至220℃，保持20min；柱压13.582psi，进样口温度250℃，fid检测器温度260℃。

实施例2

添加的苯甲酸对位衍生物为对甲基苯甲酸，添加方法如下：将对甲基苯甲酸溶于无水乙醇配成100×～1000×浓缩液，通过0.22μmpvdf的滤膜过滤除菌后，取适量加入发酵培养基，使其终浓度为0～3g/l，分别取第4～7d的发酵液测不同对甲基苯甲酸浓度下总油脂的含量，并对脂肪酸进行分析鉴定，其余同实施例1，具体结果如图2所示。

实施例3

添加的苯甲酸对位衍生物为叶酸，添加方法如下：将叶酸溶于无水乙醇配成100×～1000×浓缩液，通过0.22μmpvdf的滤膜过滤除菌后，取适量加入发酵培养基，使其终浓度为100mg/l～3g/l，分别取第4～7d的发酵液测不同叶酸浓度下总油脂的含量，并对脂肪酸进行分析鉴定，其余同实施例1，具体结果如图3所示。

实施例4

添加的苯甲酸对位衍生物为对氨基苯甲酸，添加方法如下：将对氨基苯甲酸溶于碱性水配成100×～1000×浓缩液，通过0.22μmmce的滤膜过滤除菌后，取适量加入发酵培养基，使其终浓度为100mg/l～3g/l，分别取第4～7d的发酵液测不同对氨基苯甲酸浓度下总油脂的含量，并对脂肪酸进行分析鉴定，其余同实施例1，具体结果如图4和图5所示。

由上述实施例可知，本发明的方法发酵培养基中添加适量苯甲酸对位衍生物中的苯甲酸钠相较于裂殖壶菌在原始培养基中油脂产量提高了32.12％，添加对甲基苯甲酸油脂产量提高了38.21％，叶酸的添加使油脂产量提高了56.84％，对氨基苯甲酸使油脂产量提高了66.51％，但这类物质的添加对ω-3pufa并无抑制作用。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。