不受血清内源性氨干扰的测定尿素含量的检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种不受血清内源性氨干扰的测定尿素含量的检测试剂盒，包含试剂R1和试剂R2；试剂R1含1～500mmol/LpH＝3.0～8.0的缓冲液、1～80KU/L谷氨酸脱氢酶、0.5～2KU/L?NADH、1～100mmol/Lα-酮戊二酸、1‰～5‰表面活性剂和0.1～1g/L防腐剂；试剂R2含1～500mmol/L?pH＝3.0～8.0的缓冲液、1～60KU/L尿素酶、0.5～2KU/LNADH、1～100mmol/Lα-酮戊二酸、10～500mmol/L氯化钠、1～50mmol/L酶保护剂和0.1～1g/L防腐剂。本发明的试剂盒消除内源性氨干扰，具有稳定性佳，抗干扰能力强的特点。
【专利说明】不受血清内源性氨干扰的测定尿素含量的检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及一种不受血清内源性氨干扰的测定尿素含量的检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]临床上尿素(Urea)用于诊断肾小球肾炎、肾病晚期、肾功能衰竭、慢性肾盂肾炎、前列腺肿大、尿路结石、尿道狭窄、膀胱肿瘤致使尿道受压等。
[0003]尿素的测定方法包括:化学法、脲酶一波氏法等。化学法又可分为:(I) 二乙酰一肟显色法，原理为:尿素可与二乙酰作用，在强酸加热条件下，生成粉红色的二嗪化合物，在540nm比色，因二乙酰不稳定，常用二乙酰一肟代替，后者遇酸水解成二乙酰。此法专一性差，线性范围狭窄，且试剂中含有烈性化学物，易腐蚀仪器和污染环境。(2)邻苯二甲醛比色法:尿素在强酸性环境下，与邻苯二甲醛缩合产生橙红色产物，比色测定之。(3) 二苯吡喃醇比浊法:尿素与二苯吡喃醇结合形成不溶性沉淀，比色测定之。采用化学法检测尿素，特异性均不高，如瓜氨酸对二乙酰反应有正干扰；甘氨酸、精氨酸、瓜氨酸及磺胺类药物对邻苯二甲醛反应有正干扰。加之要用强酸或强碱环境，或需要较高温度(90°C)反应，较难实现自动化，故这类方法己经较少使用。脲酶一波氏法:测定原理:首先用脲酶水解尿素，产生2分子氨和I分子二氧化碳。然后，氨在碱性介质中与苯酚及次氯酸反应，生成蓝色的吲哚酚，此过程需用亚硝基氰化钠催化反应。蓝色吲哚酚的生成量与尿素含量成正比，在630nm波长比色测定。此法的不足在于空气中氨气对试剂或玻璃器皿的污染或使用铵盐抗凝剂可使结果偏高。高浓度氟化物可抑制尿素酶，引起结果假性偏低。脲酶-谷氨酸脱氢酶偶联法通过在同一条件下测定空白管、标准管和测定管在340nm处吸光度的下降速率，即可计算出样品中尿素的含量。但是该方法受样本内源性氨的干扰严重，试剂稳定性差。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服上述现有试剂盒存在的缺陷，提供一种不受血清内源性氨干扰的测定尿素含量的检测试剂盒。用本发明的测试试剂盒来检测血清中的Urea含量，可达到操作简便、稳定性佳、抗干扰能力强，快速、测定结果准确可靠的目的。
[0005]本发明测定Urea含量的原理为:尿素在尿素酶(Urease)的催化下，水解生成氨和二氧化碳，氨在α -酮戊二酸和还原型辅酶I (NADH)存在下，经谷氨酸脱氢酶(GLDH)催化，生成谷氨酸，同时NADH被氧化成NAD+，引起340nm波长处吸光度的下降；吸光度的下降与血清中尿素的浓度成正比，通过监测340nm波长处吸光度的变化，可测定血清中尿素的浓度。
[0006]特别的，本发明在Rl试剂中加入了谷氨酸脱氢酶和NADH，消除内源性氨的干扰，以提闻试剂的抗干扰能力。
[0007]即在没有加入R2之前，样本中的内源性氨先和试剂Rl进行反应，用来消除内源性氨的干扰，反应方程式为:
[0008]
【权利要求】
1.一种不受血清内源性氨干扰的测定尿素含量的检测试剂盒，其特征在于，包含试剂Rl和试剂R2 ;所述试剂Rl含有I?500mmol/L pH = 3.0?8.0的缓冲液、I?80KU/L谷氨酸脱氢酶、0.5?2KU/L NADH、I?100mmol/L α -酮戊二酸、1%。?5%。表面活性剂和0.1?lg/L防腐剂；所述试剂R2含有I?500mmol/L pH = 3.0?8.0的缓冲液、I?60KU/L尿素酶、0.5 ?2KU/L NADH、1 ?100mmol/L α -酮戊二酸、10 ?500mmol/L 氯化钠、I ?50mmol/L酶保护剂和0.1?lg/L防腐剂。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂Rl含有100?300mmol/LpH = 5.0?8.0的缓冲液、20?60KU/L谷氨酸脱氢酶、I?1.5KU/L NADH、50?10mmol/La-酮戊二酸、1%。?5 %。表面活性剂和0.2?0.8g/L防腐剂；所述试剂R2含有100?300mmol/L pH = 5.0 ?8.0 的缓冲液、10 ?30KU/L 尿素酶、I ?1.5KU/L NADH、50 ?100mmol/La -酮戊二酸、100 ?300mmol/L 氯化钠、10 ?40mmol/L 酶保护剂和 0.2 ?0.8g/L防腐剂。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂Rl、R2中包含的缓冲液分别选自 TRIS、MOPS、HEPES 或 BICN。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂Rl、R2中包含的缓冲液均为TRIS。
5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述酶保护剂为二甲基亚砜。
6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为吐温20、吐温80或曲拉通X-100。
7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂Rl、R2中包含的防腐剂分别选自叠氮化钠、proclin300、聚赖氨酸或乙酸钠。
8.一种根据权利要求1?7中任一项所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，试剂Rl加入样本后37°C孵育5分钟，再加入试剂R2，37°C孵育1.5分钟，连续监测3分钟的吸光度变化率，与Urea标准品的尿素含量与吸光度关系曲线进行比较，得到样本的尿素含量。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述监测采用的主波长为340nm,副波长为405nm。
10.根据权利要求8所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，所述试剂Rl和试剂R2的体积比为4: I。
【文档编号】G01N21/33GK104198421SQ201410401509
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月14日 优先权日:2014年8月14日
【发明者】李伟奇, 陈瑛, 房君江, 张秀文, 林清玉 申请人:上海睿康生物科技有限公司