专利名称：一种假单胞菌的筛选方法及其转化生产表面活性剂的方法
技术领域：
本发明涉及一种假单胞菌及应用该菌种以原油为主要碳源生产表面活性 剂的方法。
背景技术：
生物表面活性剂(Biosurfactaiit，简称BS)是指严格具有亲水基团和疏 水基团、由微生物产生的化学物质；以其水溶性好、界面活性高、润湿性良 好、吸附量小、引入人工无法合成的基团、无毒安全、工艺简单等优点用于 工农业生产的各个领域。 一些研究已经证明生物表面活性剂的作用也是微生 物提高采收率的重要机理之一，其作用机理是乳化烃类，形成水包油的乳化 液，降低油水界面张力，提高岩石的亲水性能以及原油的可流动性。以往对 生物表面活性剂的研究采用的碳源主要为食品类，其缺点是成本高，特别是 目前人类粮食紧缺的情况下，采用原油为主要碳源，不仅降低了成本而且容 易适应地层环境。本研究采用以原油为主要碳源，筛选并驯化出高效产表面 活性剂的菌株，以期适应油田的环境，产生更好的驱油效果。
美国人贝克曼(Beckman)于1926年提出微生物提高原油采收率 (microbiologically enhanced oil recovery ，简称MEOR)，并且得到大量研究以 后，1991年，美国把MEOR列为传统采油后的第四类提高采收率方法，现已 应用于许多油田。当前，随着原油价格的高涨，MEOR得到了越来越多的关 注与应用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题之一是公开细菌的筛选与培养方法。
本发明需要解决的技术问题之二是公开一种以细菌生产表面活性剂的方 法，使其在48小时可将发酵液表面张力降低至30mN/m以下。
本发明用于转化生产表面活性剂的微生物是一种假单胞菌(Ae^omo"w "en^/朋ra)，并按照菌种筛选分离的顺序命名为ZK1。
该菌种具有如下的性质
1. 形态生理生化特征
形态特征杆菌，菌落呈深绿色，湿润，粘稠，圆形，边缘整齐，
不透明。
生理生化特征革兰氏阴性细菌，产表面活性剂。
2. 采用的培养基-斜面保存及平板分离培养基蛋白胨10;葡萄糖10;酵母粉5;牛肉 膏5; NaC15;琼脂15-20;以上单位均为质量/体积比g/L，溶于去离子水， 用NaOH溶液调节pH至7.2，使用YXQ-SG46-280S型压力蒸汽灭菌器112°C 灭菌30分钟。
摇瓶培养基NaC15; NH4N031; (NH2)2CO0.5; MgSO40.05; NaH2P04 1; K2HP04OH20 2; FeSO4'7H2O0.01; CaCl20.01; MnSO40.01;原油20;
甘油10;以上单位均为质量/体积比g/L，溶于去离子水；使用YXQ-SG46-280S 型压力蒸汽灭菌器12rC灭菌20分钟。
3.培养条件及利用菌种以原油为主要碳源生产表面活性剂的方法 培养温度27-47°C，更适宜温度37°C。
培养方式有氧条件下进行发酵培养。 (1)菌种筛选从油田含油污水取样加入到摇瓶培养基中，棉塞密封瓶 口，在27-47。C， 160rpm培养7天，通过上述方法培养，并选择能使表面张 力明显下降最多的菌株，挑取单菌落在斜面保存培养基上培养24-30h并保存 于4'C的冰箱中；
其中摇瓶培养基NaC15; (NH4)2S041; (NH2)2CO0.5; MgSO40.05; NaH2P04l; K2HP04*3H20 2; FeS04*7H20 0.01; CaCl20.01; MnSO40.01;原 油20，甘油10;其余为去离子水，以上单位均为质量/体积比g/L， 121。C灭
菌20分钟；
斜面保存培养基蛋白胨10;葡萄糖10;酵母粉5;牛肉膏5; NaCl 5;
琼脂15-20;以上单位均为质量/体积比g/L，其余为去离子水，用NaOH溶液 调节pH至6-8; 112"C灭菌30分钟。
该菌株经基因鉴定为假单胞菌Pseudomonas aeruginosa,按照筛选分离的 顺序命名为ZK1该细菌是已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存。
一种利用假单胞菌Pseudomonas aeruginosa生产其转化生产表面活性剂的 方法，其特征包括
(1)斜面培养将假单胞菌i^ew^ wowayaerwg/"o幼菌种接种于斜面保 存培养基上，27-47。C培养24-30小时；
其中斜面保存培养基蛋白蹄10;葡萄糖10;酵母粉5;牛肉膏5;
NaC15;琼脂15-20;以上单位均为质量/体积比g/L，其余为去离子水，用 NaOH溶液调节pH至6-8， 112。C灭菌30分钟；(2) 种子培养将步骤(1)斜面培养后的菌株，无菌条件下用接种环
接于液体发酵培养基中，27-47。C条件下，摇床振荡培养24-30小时，制得种 子液；
其中液体发酵培养基蛋白胨10;葡萄糖10;酵母粉5;牛肉膏5;
NaC15;以上单位均为质量/体积比g/L，溶于去离子水，以碱性物质调pH值 为7.0， 12rC灭菌30min;
(3) 摇瓶培养以种子液与摇瓶发酵培养基体积比为4%的接种量，接 种子液于摇瓶培养基中，27-47'C有氧条件下，摇床振荡培养3-7天，制得发 酵液；
其中摇瓶发酵培养基NaC15; NH4N031; (NH2)2CO0.5; MgSO4 0.05; NaH2P04l; K2HP04*3H20 2; FeS04*7H20 0.01; CaCl20.01; MnSO40.01;
原油20;甘油10;以上单位均为质量/体积比g/L，溶于去离子水；121。C灭 菌20分钟；
(4) 发酵液预处理取步骤(3)的发酵液在8000转/分钟离心20min 去除菌体，并去除上层浮油得到上清液；
(5) 分离样品将步骤(4)中离心后的上清液用盐酸调pH值为2.0， 用和上清液等体积的乙酸乙脂萃取，合并有机相，4(TC减压蒸馏，所得到的 黄色油状物为糖脂粗产物。
本发明公开细菌的筛选与培养方法，并公开一种以细菌生产表面活性剂 的方法，使其在48小时可将发酵液表面张力降低至30mN/m以下。
具体实施例方式
实施例l:利用假单胞菌产表面活性剂的方法
(1)菌种筛选从油田含油污水中取样加入到摇瓶培养基中，棉塞密 封瓶口，在THZ-C恒温振荡器中27'C， 160rpm培养7天，发酵液中原油乳， 以涂平板方法分离得到单一菌株，再通过上述方法培养，得到能使表面张力 明显下降最多的菌株。挑单菌落保存在斜面保存培养基上培养30小时并保存 于4'C冰箱；
将保存菌株无菌条件下用接种环接于液体斜面及平板分离保存培养基 中，在THZ-C恒温振荡器中27'C条件下，摇床振荡培养30小时，将培养的 菌液以占培养基体积4%的量加入到摇瓶培养基中24小时可完全乳化发酵液 中原油；该菌株经基因鉴定为假单胞菌尸"w^附o"maen^'"a^，按照筛选分 离的顺序命名为ZK1该细菌是已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存；(2) 斜面培养将筛选得到的假单胞菌接种于斜面保存培养基上，在
THZ-C恒温振荡器中27。C培养30小时；
(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接于液 体发酵培养基中，在THZ-C恒温振荡器中27'C条件下，摇床振荡培养30小 时，制得种子；
(4) 摇瓶培养以4%体积/体积百分比接种量，接种子于液体产酶培养 基中，在THZ-C恒温振荡器中27'C有氧条件下，摇床振荡培养7天，制得 发酵液；
(5) 发酵液预处理取步骤(4)的发酵液使用ALCPK121R型冷冻离 心机8000转/分钟离心20min去除菌体，并去除上层浮油；
(6) 分离样品(5)中上清液用6mol/L的盐酸调pH值为2.0，用和 上清液等体积的乙酸乙脂萃取2次，合并有机相，4(TC减压蒸馏，所得到的 黄色油状物为糖脂粗产物；
(7) 对产物进行TLC及FT-IR分析，发现主要产物是鼠李糖酯；
(8) 该产物可在24小时内完全乳化发酵液中原油且48小时可将发酵液 表面张力降低至26mN/m。 '
实施例2:利用假单胞菌产表面活性剂的方法
(1) 菌种筛选从油田含油污水中取样加入到摇瓶培养基中，棉塞密封 瓶口，在THZ-C恒温振荡器中37", 160rpm培养7天，发酵液中原油乳， 以涂平板方法分离得到单一菌株，再通过上述方法培养，得到能使表面张力 明显下降最多的菌株。挑单菌落保存在斜面保存培养基上培养27小时并保存
于4t:冰箱；
将保存菌株无菌条件下用接种环接于液体斜面及平板分离保存培养基 中，在THZ-C恒温振荡器中37t:条件下，摇床振荡培养27小时，将培养的 菌液以占培养基体积4%的量加入到摇瓶培养基中24小时可完全乳化发酵液 中原油;该菌株经基因鉴定为假单胞菌户"i^omo"^ aen^/"w"，按照筛选分离 的顺序命名为ZK1该细菌是已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存；
(2) 斜面培养将筛选得到的假单胞菌接种于斜面保存培养基上，在 THZ-C恒温振荡器中37'C培养27小时；
(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接于液 体发酵培养基中，在THZ-C恒温振荡器中37X:条件下，摇床振荡培养27小 时，制得种子；(4) 摇瓶培养以4%体积/体积百分比接种量，接种子于液体产酶培养
基中，在THZ-C恒温振荡器中37。C有氧条件下，摇床振荡培养5天，制得 发酵液；
(5) 发酵液预处理取步骤(4)的发酵液使用ALCPK121R型冷冻离 心机8000转/分钟离心20min去除菌体，并去除上层浮油；
(6) 分离样品(5)中上清液用6mol/L的盐酸调pH值为2.0，用和 上清液等体积的乙酸乙脂萃取2次，合并有机相，4(TC减压蒸馏，所得到的 黄色油状物为糖脂粗产物。
(7) 对产物进行TLC及FT-IR分析，发现主要产物是鼠李糖酯；
(8) 该产物可在24小时内完全乳化发酵液中原油且48小时可将发酵液 表面张力降低至29mN/m。
实施例3:利用假单胞菌产表面活性剂的方法
(1) 菌种筛选从油田含油污水中取样加入到摇瓶培养基中，棉塞密封 瓶口，在THZ-C恒温振荡器中47'C， 160rpm培养7天，发酵液中原油乳， 以涂平板方法分离得到单一菌株，再通过上述方法培养，得到能使表面张力 明显下降最多的菌株。挑单菌落保存在斜面保存培养基上培养24小时并保存 于4。C冰箱；
将保存菌株无菌条件下用接种环接于液体斜面及平板分离保存培养基 中，47'C条件下，摇床振荡培养24小时，将培养的菌液以占培养基体积4% 的量加入到摇瓶培养基中24小时可完全乳化发酵液中；该菌株进行保藏，经 基因鉴定为假单胞菌Aw^fomo"osaen^/mwa，按照筛选分离的顺序命名为 ZK1该细菌是已知现有菌种，各大菌种保藏库中均有保存；
(2) 斜面培养将筛选得到的假单胞菌接种于斜面保存培养基上，在 THZ-C恒温振荡器中47'C培养24小时；
(3) 种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接于液 体发酵培养基中，在THZ-C恒温振荡器中47-C条件下，摇床振荡培养24小 时，制得种子；
(4) 摇瓶培养以4%体积/体积百分比接种量，接种子于液体产酶培养 基中，在THZ-C恒温振荡器中WC有氧条件下，摇床振荡培养3天，制得 发酵液；
(5) 发酵液预处理取步骤(4)的发酵液使用ALCPK121R型冷冻离 心机8000转/分钟离心20min去除菌体，并去除上层浮油；(6) 分离样品(5)中上清液用6mol/L的盐酸调pH值为2.0，用和 上清液等体积的乙酸乙脂萃取2次，合并有机相，4(TC减压蒸馏，所得到的 黄色油状物为糖脂粗产物。
(7) 对产物进行TLC及FT-IR分析，发现主要产物是鼠李糖酯；
(8) 该产物可在24小时内完全乳化发酵液中原油且48小时可将发酵液 表面张力降低至27mN/tn。
权利要求
1. 一种假单胞菌Pseudomonas aeruginosa的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤从油田含油污水取样加入到摇瓶培养基中，棉塞密封瓶口，在27-47℃，160rpm培养7天，通过上述方法培养，并选择能使表面张力明显下降最多的菌株，挑取单菌落在斜面保存培养基上培养24-30h并保存于4℃的冰箱中；其中摇瓶培养基NaCl 5；(NH4)2SO4 1；(NH2)2CO 0.5；MgSO4 0.05；NaH2PO4 1；K2HPO4·3H2O 2；FeSO4·7H2O 0.01；CaCl2 0.01；MnSO4 0.01；原油20，甘油10；其余为去离子水，以上单位均为质量/体积比g/L，121℃灭菌20分钟；斜面保存培养基蛋白胨10；葡萄糖10；酵母粉5；牛肉膏5；NaCl 5；琼脂15-20；以上单位均为质量/体积比g/L，其余为去离子水，用NaOH溶液调节pH至6-8；112℃灭菌30分钟。
2. —种利用假单胞菌Pseudomonas aeruginosa生产其转化生产表面活性 剂的方法，其特征包括(1) 斜面培养将假单胞菌/^ew^W20"os "en^^ora菌种接种于斜面保 存培养基上，27-47'C培养24-30小时；其中斜面保存培养基蛋白胨10;葡萄糖10;酵母粉5;牛肉膏5;NaCl 5;琼脂15-20;以上单位均为质量/体积比g/L，其余为去离子水，用 NaOH溶液调节pH至6-8， 112。C灭菌30分钟；(2) 种子培养将步骤(1)斜面培养后的菌株，无菌条件下用接种环 接于液体发酵培养基中，27-47'C条件下，摇床振荡培养24-30小时，制得种 子液；其中液体发酵培养基蛋白胨10;葡萄糖10;酵母粉5;牛肉膏5;NaC15;以上单位均为质量/体积比g/L，溶于去离子水，以碱性物质调pH值 为7.0， 12rC灭菌30min;(3) 摇瓶培养以种子液与摇瓶发酵培养基体积比为4%的接种量，接种子液于摇瓶培养基中，27-47i:有氧条件下，摇床振荡培养3-7天，制得发 酵液；其中摇瓶发酵培养基NaCl 5; NH4N03 1; (NH2;)2CO 0.5; MgS04 0.05; NaH2P04l; K2HP04*3H20 2; FeS04*7H20 0.01; CaCl20.01; MnSO40.01;原油20;甘油10;以上单位均为质量/体积比g/L，溶于去离子水；12广C灭 菌20分钟；(4) 发酵液预处理取步骤(3)的发酵液在8000转/分钟离心20min去除菌体，并去除上层浮油得到上清液；(5) 分离样品将步骤(4)中离心后的上清液用盐酸调pH值为2.0， 用和上清液等体积的乙酸乙脂萃取，合并有机相，4(TC减压蒸馏，所得到的 黄色油状物为糖脂粗产物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的氮源为NH4N03和 (NH2)2CO。
全文摘要
本发明涉及一种假单胞菌的筛选方法及其转化生产表面活性剂的方法。菌种筛选从油田含油污水取样加入到摇瓶培养基中，棉塞密封瓶口，在27-47℃，160rpm培养7天，通过上述方法培养，并选择能使表面张力明显下降最多的菌株，挑取单菌落在斜面保存培养基上培养24-30h并保存于4℃的冰箱中。本发明还公开一种以细菌生产表面活性剂的方法，使其在48小时可将发酵液表面张力降低至30mN/m以下。
文档编号C12N1/20GK101457214SQ20091007629
公开日2009年6月17日 申请日期2009年1月9日 优先权日2009年1月9日
发明者理 俞, 靖 王, 章厚名, 董汉平, 云 陈, 黄立信 申请人:中国石油大学(北京)