专利名称：一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法
一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法
技术领域：
本发明涉及生物基化学品的生物制造和生物炼制领域，具体地说，是以玉米秸杆等木质纤维素为原料，在高温条件下高效生物转化木质纤维素生产高浓度和高光学纯度乳酸的方法。
背景技术：
乳酸是合成多种化学品的重要中间体，可广泛应用在食品、药品、化妆品、制革、纺织、环保和农业生产中。目前最重要的用途是从L-乳酸生产可以取代聚乙烯和聚丙烯等聚合材料的可降解聚乳酸产品(Polymeric lactic acid,PLA)。这一可降解聚合材料产品已经大量工业化，是替代石油基聚合材料的最为重要的生物材料。随着聚乳酸产品的广泛应用，全球对乳酸的需求量也随之增加。目前，主要通过化学合成和生物发酵两种方法来生产乳酸，但以生物发酵法为主，全球大约90%的乳酸产量来源于生物发酵。发酵生产乳酸的原料可以是葡萄糖、蔗糖、糖蜜和淀粉等，工业上常用可溶性淀粉和糖蜜，但发酵法生产乳酸的成本约有70%米源于原料，因此，使用廉价的原料生产乳酸，可大大降低乳酸的生产成本。秸杆是粮食生产中的副产物，主要由纤维素、半纤维素和木质素三部分构成，其中可发酵性的纤维素和半纤维素约占秸杆干重的一半以上。我国的秸杆资源丰富，每`年的秸杆产量约为7亿吨，但是由于缺乏合理的利用模式，这些秸杆通常被就地焚烧掉，从而造成了巨大的环境污染和交通安全。因此，利用储量丰富、价格低廉的秸杆原料，采用生物发酵的方法生产乳酸具有广阔的前景。利用玉米秸杆生产乳酸的工艺主要包括秸杆的预处理、预处理后秸杆的生物脱毒、脱毒后纤维素的酶解与乳酸发酵以及乳酸的分离等。近年来，利用木质纤维素原料发酵生产乳酸的研究多有报道。Cui等人(Bioresource Technology, 2011,102(2), 1831-1836)研究了在 37 °C 下，混合培养Lactobacillus rhamnosus和Lactobacillus brevis在3%固体含量下同步糖化与发酵玉米稻杆生产乳酸，最终得到的乳酸浓度为20g/L左右。Maas等人(AppliedMicrobiologyand Biotechnology，2008，78 (5)，751-758)在 50°C下，在 14.8% 固体含量下同步糖化与发酵小麦秸杆生产乳酸得到40.7g/L。陈树林等(中国专利公开号CN101935618A)利用短乳杆菌发酵含可利用糖56.9g/L的木质纤维素稀酸水解液，在48h内产生39.lg/L的乳酸。王冬梅等(中国专利公开号CN1908184)利用黑曲霉进行第一次固态发酵64-72小时，发酵液过滤后滤液接种米根酶进行第二次液态发酵12-36小时，经过两次发酵后，每IOOg干物质可以产生6-12g左右的乳酸。尽管目前对利用木质纤维素生产乳酸的研究很多，但是由于缺乏能够处理高固体含量木质纤维素进行同步糖化与发酵的生物反应器，大多数研究都是在较低的固体含量下进行，发酵液中的乳酸浓度一般都低于50g/L，从而增加了后续乳酸分离的难度和成本。通常，大宗化学品在发酵液中的浓度低于100g/L，则此生产工艺不具有工业化的前景。此外，纤维素酶的最佳酶解条件是50°C，pH4.8左右，而乳酸发酵菌种的生长温度一般都低于450C。因此，在常规的利用木质纤维素原料同步糖化与发酵生产乳酸的研究中，采用的温度都低于40°C，使纤维素的酶解效率非常低，从而大大限制了乳酸的生产速率和产率。
发明内容本发明目的在于使用能够处理高固体含量木质纤维素原料进行同步糖化与发酵的生物反应器，在温度高达48°C和固体含量达30% (w/w/)的条件下同步糖化与发酵木质纤维素原料生产高浓度和高光学纯度乳酸的方法。本发明的构思:一种高温条件下高效生物转化木质纤维素生产高浓度乳酸的方法，具体地说是将发明人所在实验室筛选分离的耐高温的乳酸片球菌Pediococcusacidilactici DQ2，活化之后接种于能够处理高固体含量木质纤维素原料进行同步糖化与发酵的生物反应器中，加入纤维素酶，乳酸片球菌把纤维素酶解生成的可发酵性糖同步转化为乳酸；乳酸片球菌Pediococcusacidilactici DQ2可在48°C,pH5.5的条件下正常生长发酵，该条件与纤维素酶的最佳酶解条件(50°C、pH4.8)非常接近，因此可实现高效的同步糖化与发酵木质纤维素原料生产高浓度乳酸。基于可处理高固体含量木质纤维素原料固步糖化与发酵的生物反应器和耐高温的乳酸片球菌Pediococcusacidilactici DQ2,本发明可以实现在高温下生物转化木质纤维素生产高浓度乳酸。本发明的目的是通过以下技术方案米实现的:一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法，其具体步骤为，(I)极低水用量的木质纤维素原料高温稀酸预处理:取干基玉米秸杆，按2: I的固液比(w/w)加入浓度为5% (w/w)的稀硫酸，搅拌均匀后，浸泡12-16小时；然后按100%的装填率(即将预处理反应器装满)将预浸好的玉米秸杆装填入预处理反应器中进行预处理，温度为190°C、1.2MPa，维持3分钟；预处理结束后，迅速打开预处理反应器的排气阀，使反应器内压力迅速降至常压；然后取出物料并冷却至室温，盛入塑料袋中备用；预处理方法包括稀酸预处理、机械预处理、碱法预处理、蒸汽爆破预处理、氨纤维膨爆预处理、热水预处理、生物预处理等，优选稀酸预处理；对木质纤维素原料进行预处理可以破坏木质纤维素的固有结构，提高可酶解性；(2)预处理后木质纤维素原料的固态生物脱毒从Amorphotheca resinae ZNl斜而接一环抱子于PDA斜面培养基,25°C静置培养3天后，用20mL无菌水将斜面上的孢子洗出，接入盛有200g稀酸预处理后且pH调整至6.0的玉米秸杆的生物脱毒反应器中，维持25°C、60%的湿度进行脱毒共培养3天；将上述脱毒共培养3天的200g秸杆接入盛有2000g稀酸预处理后且pH调整至6.0的玉米秸杆的生物脱毒反应器中，维持25°C、60%的湿度进行脱毒共培养3天；脱毒后将物料保存于_20°C冰箱中待用；生物脱毒所脱除的有害物质为木质纤维素在预处理过程中的一些降解产物，主要包括有机酸类如甲酸、乙酸，呋喃类如糠醛、羟甲基糠醛，酚类化合物如香兰素、对羟基苯甲醛等；用于高浓度乳酸发酵的木质纤维素原料经过预处理和抑制物脱除的原料，抑制物脱除方法包括生物脱毒、水洗脱毒、过碱化处理(Overliming)、活性炭吸附、树脂吸附等，优选生物脱毒。抑制物脱除可以除去预处理过程产生的对纤维素酶解和乳酸片球菌生长和发酵起抑制作用的化合物，从而提高纤维素转化率和乳酸得率；(3)利用液体培养基培养乳酸片球菌Pediococcus acidilactici DQ2:液体培养基组分为葡萄糖10 50g/L,酵母粉I 10g/L,蛋白胨I 20g/L,硫酸铵0.1 10g/L，七水合硫酸镁0.1 10g/L，四水合硫酸锰0.1 10g/L，磷酸二氢钾0.1 20g/L，乙酸钠I 10g/L，种子培养条件为:温度30 50°C，转速50 500rpm，时间12 36小时，0D_值I 10 ；OD600值是指含有菌体的溶液在600nm波长处的吸光值；乳酸片球菌Pediococcus acidilactici DQ2是发明人所在实验室自行筛选分离的菌种。
所述的发酵菌种为乳酸片球菌Pediococcus acidilactici DQ2,此菌可在温度50°C, pH 5.5的条件下快速发酵葡萄糖生成高浓度乳酸，此条件与纤维素酶的最适酶解条件相同，利用此菌种发酵木质纤维素原料生产高浓度乳酸，可以在同一反应器内实现木质纤维素糖化和乳酸发酵过程的高度同步和集成；所述菌株为乳酸片球菌Pediococcus acidilactici DQ2,但本发明所涉及的菌种不限于所提供的菌种，还包括能够发酵生产乳酸的其他菌种，如Lactobacillusrhamnosus,Lactobacillus delbrueckii等，以及通过诱变、基因工程等操作改造的上述菌株或其他菌株；(4)发酵罐中同步糖化与发酵生产乳酸:本发明使用的适合于同步糖化与发酵的反应器为自行设计，详细结构参见Zhang等人(Biotechnology and Bioengineering, 2010,105, 718-728)发表的文献。该新型生物反应器由罐体、加料口、放料口、无菌空气入口、气体分散器、pH电极、溶氧电极、温度电极、功率测定仪和一个新型螺带式搅拌桨组成。反应器容积为5L，搅拌桨由正螺旋螺带桨、涡轮/翼型搅拌桨和底桨，正螺旋螺带桨通过支撑杆固定在搅拌轴上，并自上而下盘旋在搅拌轴周边；涡轮/翼型搅拌桨设置于正螺旋螺带桨形成的框体内，固定在正螺旋螺带桨的上下两个端部之间的搅拌轴上；底桨固定在搅拌轴的底端，紧贴罐体底部。将步骤(2) (3)培养获得的发酵菌种和原料加入到适合于同步糖化与发酵的反应器，调整到所需的固体含量(15-45%，《/ )，加入营养盐，以及纤维素酶，在481:，？!1 5.5的条件下同步糖化与发酵木质纤维素原料生产乳酸；所述的木质纤维素的干基质量占发酵罐中添加的所有物质总质量的质量分数为10 50%，纤维素酶为5 30FPU/g DM,发酵温度30 50°C ;所述的营养盐相对于发酵罐中总的液体体积的浓度分别是酵母提取物0.1 10g/L，硫酸铵0.1 10g/L，七水合硫酸镁0.1 10g/L，磷酸二氢钾0.1 20g/L。乳酸球菌在发酵罐中发酵温度30 50°C ;木质纤维素干基质量占发酵罐中添加的所有物质总质量的质量分数为15 45%;纤维素酶量为5 30FPU/gDM ;发酵pH 4.5
6.5，发酵时间为24 96小时；FPU为纤维素酶滤纸酶活，DM (Dry matter)是指木质纤维素干物质。所述的木质纤维素原料选自固体秸杆原料或者固体秸杆处理物；其中:
所述的木质纤维素原料选自玉米秸杆、麦秸、稻草、木屑、能源植物或者林业废弃物中，优选玉米秸杆。所述的木质纤维素原料处理物选自采用稀酸、蒸汽爆破、氨气爆破、生物法方式预处理后的玉米秸杆、麦秸、稻草、木屑、能源植物、林业废弃物中的一种。所述的乳酸，包括游离态的乳酸，以及调节发酵pH所生成的乳酸盐，如乳酸钠，乳酸钙，乳酸铵等。与现有技术相比，本发明的积极效果是:(I)本发明以木质纤维素为原料发酵生产乳酸，基质成本低廉，来源广泛，充分利用了可再生资源，“不与人类争粮，不与粮争地”，能够满足乳酸不断扩大的市场需求；(2)本发明使用自行设计的适合于木质纤维素原料高固体含量同步糖化与发酵的反应器，有效解决了高粘度体系的混合和传质问题，为在高固体含量下发酵纤维素原料生产高浓度乳酸提供了保障，进而降低了分离纯化工段的成本；(3)本发明可以在温度高达48°C的条件下以木质纤维素为原料生产乳酸，可以有效提高纤维素的酶解效率，减少纤维素酶用量，减少冷却水的使用，从而降低生产成本；此夕卜，高温也可以降低发酵过程染菌的风险；(4)本发明以木质纤维素为原料高效发酵生产乳酸，可以借鉴现有纤维乙醇生产相关技术，实现从木质纤维素生产高附加值的聚乳酸，实现基于木质纤维素的大宗精细化学品生物炼制。
图1实施例1发酵过程曲线图；图2实施例2发酵过程曲线图。
具体实施方式以下提供本发明一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法的具体实施方式
。实施例1清参见附图1，烘干的玉米秸杆与稀硫酸溶液混合至含水量33% (w/w)，硫酸浓度
2.5% (w/w), 190°C预处理3min ;预处理后物料调节pH至5.5,含水量60% (w/w),加入生物脱毒所用菌种Amorphotheca resinae ZN1,25°C固态培养7天；收获物料，物料在115°C下灭菌20分钟，冷却后加入发酵罐中，调节发酵罐中固体含量为25% (w/w)，纤维素酶用量为15FPU/gDM，50 V预先糖化8h，5M氢氧化钠控制发酵过程pH在5.5，48 °C下发酵72小时，最终乳酸浓度81.80g/L。实施例2清参见附图2，烘干的玉米秸杆与稀硫酸溶液混合至含水量33% (w/w)，硫酸浓度
2.5% (w/w), 190°C预处理3min,预处理后物料调节pH到5.5,含水量60% (w/w),加入生物脱毒所用菌种Amorphotheca resinae ZN1,25°C固态培养7天；收获物料，物料在115°C下灭菌20分钟，冷却后加入发酵罐中，发酵罐中固体含量为质量分数30%，纤维素酶用量为15FPU/gDM，50°C预先糖化8h， 5M氢氧化钠控制发酵过程pH在5.5，48°C下发酵72小时，最终乳酸浓度101.60g/L。本发明所涉及的木质纤维素原料不限于玉米秸杆，还可以为麦秸、稻草、木屑、能源植物或者林业废弃物中的一种；木质纤维素处理物选自采用稀酸、蒸汽膨爆、液氨膨爆、生物法预处理后的麦秸、稻草、木屑、能源植物、林业废弃物中的一种。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护 范围内。
权利要求
1.一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法，其特征在于，具体步骤为， (1)极低水用量的木质纤维素原料高温稀酸预处理: 取干基玉米秸杆，按2: I的固液质量比加入质量浓度为5%的稀硫酸，搅拌均匀后，浸泡12 16小时；然后按100%的装填率(即将预处理反应器装满)将预浸好的玉米秸杆装填入预处理反应器中进行预处理，温度为190°C、1.2MPa，维持3分钟；预处理结束后，迅速打开预处理反应器的排气阀，使反应器内压力迅速降至常压；然后取出物料并冷却至室温，盛入塑料袋中备用； (2)预处理后木质纤维素原料的固态生物脱毒 从Amorphotheca resinae ZNl斜面接一环抱子于PDA斜面培养基,25°C静置培养3天后，用20mL无菌水将斜面上的孢子洗出，接入盛有200g稀酸预处理后且pH调整至6.0的玉米秸杆的生物脱毒反应器中，维持25°C、60%的湿度进行脱毒共培养3天；将上述脱毒共培养3天的200g秸杆接入盛有2000g稀酸预处理后且pH调整至6.0的玉米秸杆的生物脱毒反应器中，维持25°C、60%的湿度进行脱毒共培养3天；脱毒后将物料保存于_20°C冰箱中待用； (3)利用液体培养基培养乳酸片球菌Pediococcusacidilactici DQ2: 液体培养基组分为葡萄糖10 50g/L，酵母粉I 10g/L，蛋白胨I 20g/L，硫酸铵0.1 10g/L，七水合硫酸镁0.1 10g/L，四水合硫酸锰0.1 10g/L，磷酸二氢钾0.1 20g/L，乙酸钠I 10g/L，种子培养条件为:温度30 50°C，转速50 500rpm，时间12 36小时，0D600值I 10 ; 0D600值是指含有菌体的溶液在600nm波长处的吸光值； (4)发酵罐中同步糖化与发酵生`产乳酸: 将步骤(2) (3)培养获得的发酵菌种和原料加入到适合于同步糖化与发酵的反应器，调整到所需的固体质量百分比为15 45%，加入营养盐，以及纤维素酶，在48°C，pH 5.5的条件下同步糖化与发酵木质纤维素原料生产乳酸。
2.如权利要求1所述的一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法，其特征在于，所述的发酵菌种为乳酸片球菌Pediococcus acidilacticiDQ2,此菌可在温度50°C,pH 5.5的条件下快速发酵葡萄糖生成高浓度乳酸，此条件与纤维素酶的最适酶解条件相同，利用此菌种发酵木质纤维素原料生产高浓度乳酸，可以在同一反应器内实现木质纤维素糖化和乳酸发酵过程的高度同步和集成。
3.如权利要求1所述的一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法，其特征在于，所述的菌株为乳酸片球菌Pediococcus acidilactici DQ2,但本发明所涉及的菌种不限于所提供的菌种，还包括能够发酵生产乳酸的其他菌种，如Lactobacillusrhamnosus,Lactobacillus delbrueckii等，以及通过诱变、基因工程等操作改造的上述菌株或其他菌株。
4.如权利要求1所述的一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法，其特征在于，所述的木质纤维素的干基质量占发酵罐中添加的所有物质总质量的质量分数为10 50%，纤维素酶为5 30FPU/g DM,发酵温度30 50°C。
5.如权利要求1所述的一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法，其特征在于，所述的营养盐相对于发酵罐中总的液体体积的浓度分别是酵母提取物0.1 10g/L，硫酸铵0.1 10g/L，七水合硫酸镁0.1 10g/L，磷酸二氢钾0.1 20g/L。
6.如权利要求1所述的一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法，其特征在于，乳酸球菌在发酵罐中发酵温度30 50°C ;木质纤维素干基质量占发酵罐中添加的所有物质总质量的质量分数为15 45%;纤维素酶量为5 30FPU/gDM ;发酵pH 4.5 6.5，发酵时间为24 96小时；FPU为纤维素酶滤纸酶活，DM是指木质纤维素干物质。
7.如权利要求1所述的一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法，其特征在于，所述的木质纤维素原料选自固体秸杆原料或者固体秸杆处理物；其中: 所述的木质纤维素原料选自玉米秸杆、麦秸、稻草、木屑、能源植物或者林业废弃物中； 所述的木质纤维素原料处理物选自采用稀酸、蒸汽爆破、氨气爆破、生物法方式预处理后的玉米秸杆、麦秸、稻草、木屑、能源植物、林业废弃物中的一种。
8.如权利要求1所述的一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法，其特征在于，所述的乳酸，包括游离态的乳酸，以及调节发酵PH所生成的乳酸盐，为乳酸钠，乳酸钙，乳酸铵。
9.如权利要求1所述的一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法，其特征在于，所述的生物反应器由罐体、加料口、放料口、无菌空气入口、气体分散器、pH电极、溶氧电极、温度电极、功率测定仪和一个新型螺带式搅拌桨组成，搅拌桨由正螺旋螺带桨、涡轮/翼型搅拌桨和底桨，正螺旋螺带桨通过支撑杆固定在搅拌轴上，并自上而下盘旋在搅拌轴周边；涡轮/翼型搅拌桨设置于正螺旋螺带桨形成的框体内，固定在正螺旋螺带桨的上下两个端部之间的搅拌轴 上；底桨固定在搅拌轴的底端，紧贴罐体底部。
全文摘要
本发明涉及一种高温条件下由木质纤维素生产高浓度乳酸的方法，具体步骤为，极低水用量的木质纤维素原料高温稀酸预处理(1)预处理后木质纤维素原料的固态生物脱毒；(2)利用液体培养基培养乳酸片球菌Pediococcusacidilactici DQ2；(3)发酵罐中同步糖化与发酵生产乳酸；(4)将步骤(2)(3)培养获得的发酵菌种和原料加入到适合于同步糖化与发酵的反应器，调整到所需的固体含量，加入营养盐，以及纤维素酶，在48℃，pH 5.5的条件下同步糖化与发酵木质纤维素原料生产乳酸。本发明的优点在温度48℃的条件下以木质纤维素为原料生产乳酸，提高纤维素的酶解效率，减少纤维素酶用量，减少冷却水的使用，降低生产成本，并降低发酵过程染菌的风险。
文档编号C12R1/01GK103103224SQ20111035564
公开日2013年5月15日 申请日期2011年11月10日 优先权日2011年11月10日 公开号201110355643.发明者鲍杰, 赵凯, 楚德强, 张建 申请人:华东理工大学