专利名称：一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法
技术领域：
本发明属于基因工程、蛋白质工程和发酵工程领域，涉及一种DNA分子的合成、突变、重组和载体构建技术，尤其涉及一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法。
背景技术：
链霉亲和素(Streptavidin,SA)是由阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)培养过程中分泌的一种小分子非糖基化蛋白质，全长编码区183个氨基酸(aa)，包含24aa的信号肽(见序列表中SEQ ID No: 1)，成熟分子159aa (见序列表中SEQ ID No: 2)。菌体外的天然活性形式为从13 139aa的成熟肽(见序列表中SEQ ID No: 3)，分子量15kD，其天然形式为同源四聚体，分子量60kD，SA的成熟活性结构为127个氨基酸的多肽，称为SA核心序列，具有抗蛋白酶的特性。1963年，Dr.Stapley首先发现并报道。本世纪以来，SA由于其与生物素(Biotin，又称维生素H、辅酶R)有极高的亲和力和特异性而受到国际生物学和医学界的高度重视。SA对其配体生物素的亲和力(10_16 M/L)比已知的抗原-抗体的亲和力(10_7 10_12 M/L)高4 6个数量级。高亲和力和高特异性并不是SA的唯一特性，SA与Biotin的结合速度极快，即便是在极低浓度和4°C环境下也是如此。另外，由于生物素是小分子，因而蛋白生物素化几乎不影响生物功能。SA-Biotin复合物可以耐受变性剂(如6M盐酸胍)、去垢剂(如SDS)、90°C高温和3 IlpH环境。与其他靶向标签(如Halo-Tag和SNAP-Tag)相比，SA有更多便利，不论是体外或体内，其可借助大肠杆菌的生物素连接酶(E.coli biotin ligase)将其配体标记到目标蛋白。SA的这些特性，引发了科学家对SA和其配体Biotin进行各种生物改造的兴趣。野生型SA (WtSA)分子与Biotin的结合速度(on-rate)虽然很快,但结合力不够稳定持久(high off-rate),这对需要连续长时间观察的动态实验(如细胞生物学领域)与影像研究较为不利。另一方面，WtSA与生物素的异乎寻常的亲和力(10_16mole/L)，又使得分离制备时，需要变性条件下洗脱。尽管WtSA对生物素的亲和力极高，但其对某些极具用途的生物素衍生物，如2-亚氨基生物素，则结合力不够理想(兼容性不理想)，这也提出了对SA进行分子改造的必要。尽管过去20年来，已经报道有200多种突变型SA (mtSA)，但关于SA突变后提高结合稳定性的研究很少。2012年，Mark Howarth, Oxford (GB)公开了稳定性结合SA突变体研究(美国专利申请号:US 2012/0214970 Al)，测试并保护了 3个双位点突变体S52G/R53D, S52G/R53N, S52G/R53S (见序列表中 SEQ ID No: 4，SEQ ID No: 5，SEQ ID No: 6)，指出该类突变体的主体序列必须在第23、27、43、45、49、79、88、90、92、108、110、120、128与野生型SA相同。早在2000 年，R.Charles Cantor (Boston University)对 SA 的亲和兼容性进行了研究，公开了 2个SA的突变体(EP0977770 Al )，它们是N23A、S27E或S27D (见序列表中SEQ ID No: 7, SEQ ID No: 8)， 该突变体对Biotin的亲和力降低了至少10个数量级，提高了对2-亚氨基生物素(2-1minobiotin)和Diaminobiotin的亲和力，可用于分离2-亚氨基生物素化的蛋白。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种全人工基因合成的密码子优化和突变引入的亲和兼容性链霉亲和素突变体SA128m4及其制备方法，亲和兼容性链霉亲和素突变体SA128m4既有兼容性亲和力，又有低的解离速度(off-rate)。本发明的目的将通过以下技术方案得以实现:
一种亲和兼容性链霉亲和素突变体，所述亲和兼容性链霉亲和素突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:9所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:10所示。优选的，上述的一种亲和兼容性链霉亲和素突变体，其中:所述亲和兼容性链霉亲和素突变体包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D。一种上述的亲和兼容性链霉亲和素突变体的制备方法，包括以下步骤:
O已知的具有127个氨基酸的链霉亲和素成熟氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO: 3所示，在其N端添加Met氨基酸作为起始密码安置，形成128个氨基酸序列，并在其中引入两个氨基酸的定点突变:S·52G、R53D，以及两个氨基酸的换位突变:Y22N、N23Y，得到的128个氨基酸的突变序列如序列表中SEQ ID N0:9所示；
2)将所述128个氨基酸的突变序列经DNAWorks逆翻译成核苷酸序列，所述核苷酸序列的密码子经DNAWorks优化(E.coli class II)，并且在其5’ -端添加了 NcoI酶切位点，3’_端添加终止密码TAA和XhoI酶切位点，在上下游酶切位点外侧各加4个保护碱基，DNA合成仪合成10条寡核苷酸引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11 20所示；
3)将所述10条寡核苷酸引物通过PCR合成人工DNA序列，所述人工DNA序列编码128个氨基酸的突变序列，命名为SA128m4，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:21所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:9所示，包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D ；
4)构建原核表达工程载体pET28a-SA128m4；
5)构建原核表达工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA128m4 ；
6)原核表达工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA128m4的扩增、诱导表达；
7)SA128m4的提取与纯化；
8)SA128m4的生物活性测定，所述SA128m4的突变包含Y22N、N23Y、S52G、R53D，由于已知S52G、R53D突变可以使得结合稳定性加强，解离(off-rate)速度变慢，而新的Y22N、N23Y的转位突变则使得SA与Biotin氢键结合的空间位置发生变化，抑制了 SA对Biotin的过高亲和力，提高了对Biotin衍生物(2-1minobiotin, 2-亚氨基生物素)的亲和力。本发明的突出效果为:本发明提供了一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法，亲和兼容性链霉亲和素突变体SA128m4结合了 SA (S52G，R53D)突变的结合稳定性(low off-rate)和SA (N23A，S27D)的亲和兼容性，降低了对生物素的亲和力，提高了对生物素衍生物(如2-亚氨基生物素)的亲和兼容性，有利于在生物素化蛋白的分离、纯化，其产物可用作亲和色谱填料制备。以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式
作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
图1是重组表达载体pET28a_SA128m4的物理结构图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，但本发明并不局限于此。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例:
本实施例提供一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法。1.全人工基因合成和突变引入
1.1已知的具有127个氨基酸的链霉亲和素成熟氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO: 3所示，在其N端添加Met氨基酸作为起始密码安置，形成128个氨基酸序列，并在其中引入两个氨基酸的定点突变:S52G、R53D，以及两个氨基酸的换位突变:Y22N、N23Y，得到的128个氨基酸的突变序列(SEQ ID N0:9)；
1.2将上述128个氨基酸的突变序列经美国国家生化信息中心(NCBI)网上软件DNAWorks逆翻译成核苷酸序列,上述核苷酸序列的密码子经DNAWorks优化(E.coli classII)，并且在其5’ -端添加了 NcoI酶切位点，3’ -端添加终止密码TAA和XhoI酶切位点，在上下游酶切位点外侧各加4个保护碱基，DNA合成仪合成10条寡核苷酸引物(SEQ IDNO: 11 20)；
1.3将上述10条 寡核苷酸引物通过PCR合成人工DNA序列为403个碱基对的脱氧核糖核酸，所述人工DNA序列编码128个氨基酸的突变序列，命名为SA128m4 (SEQ ID N0:21),包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D (SEQ ID N0:9)；
1.4将PCR产物克隆进盘古基因科技(苏州)有限公司的TOPO克隆载体TopFast pACK4a-Bs,挑取单克隆扩增、PCR鉴定重组体；
1.5通过DNA序列分析获得了序列正确的SA128m4克隆(命名为pACK4a_SA128m4)。2.亚克隆技术构建原核表达载体
2.1用Ncol/Xhol双酶切消化pACK4a-SA128m4，琼脂糖电泳和胶回收法回收SA128m4目的片段，同法用Ncol/Xhol处理pET28a载体，胶回收纯化；
2.2 T4 DNA连接酶连接，转化ToplO感受态菌，挑取单菌落鉴定阳性克隆；
2.3测序分析验证插入片段正确，取得pET28a-SA128m4重组表达载体(如图1所示)；
2.4用该载体转化BL21 (DE3)感受态菌，取得表达菌株BL21-pET28a_SA128m4。3.测试表达
3.1LB培养基扩增表达菌株BL21-pET28a-SA128m4，IPTG诱导表达，诱导条件:IPTG
0.lmMole/L，25°C诱导 4 小时；
3.2取ImL菌液，离心收集菌体，PBS洗涤I次，0.5mL PBS重悬浮，超声裂解菌体；
3.3在4°C，12，000RPM,离心15min，保留上清和沉淀，分别上样SDA-PAGE，考马斯亮蓝染色-脱色，观察表达条带。SA128m4的表达量占细菌总蛋白的8%，其中可溶性表达>90%。4.SA128m4蛋白质纯化4.1 LB+M9培养基2L，摇瓶扩菌至OD ^ 0.5 ；
4.2加IPTG诱导(0.1mMoIe/L), 25°C诱导表达4小时；
4.3收集菌体，超声破碎菌体，离心收集上清；
4.4饱和硫酸铵(加至80%)共沉淀，离心收集沉淀，去离子水重悬；
4.5分子筛Siiphadex G-50,分选加脱盐，5%甘油水溶液洗柱，收集SA128m4蛋白组份，20mM磷酸盐缓冲液，pH5.0 (含IOmM NaCl, 5%甘油)透析平衡；
4.6Mono S阳离子交换层析:20mM憐酸盐缓冲液,ρΗ5.0(含IOmM NaCl, 5% Glycerol)平衡离子交换柱，上样，5倍柱体积平衡液淋洗，20mM磷酸盐缓冲液，pH7.0(含IOOmM NaCl,5% Glycerol)，洗脱目标产物 SA128m4 ；
4.7Mono Q阴离 子交换层析:pH8.5, 20mM的Tris-Cl缓冲液(含5% Glycerol)平衡色谱柱，将上一步收集的SA组份以柱平衡液透析平衡后上柱，5倍柱体积淋洗，离子梯度洗脱 SA (20mM 的磷酸盐缓冲液，pH8.5,200mM NaCl)；
4.8Sephadex G-200凝胶过滤层析(60cmX 5cm)，收集合并含有SA的活性峰，并对其含量，纯度进行鉴定，超滤浓缩。5.SA128m4 活性测定
BioCORE 100 生物传感器测定亲和力，SA128m4 与 Biotin 的 Kd = 1.52 X 1(T8M/L，与2-亚氨基生物素的Kd = 1.23X 1(T6M/L。SA128m4 的比活性(Specific Activity)达到 14.8U/mg (wtSA 的比活性为 13 16U/mg, IU 结合 Biotin lM-g) SA128m4与生物素结合的半寿期为12小时(据报道，wtSA为6.6小时，单体SA(Monomeric SA)为 3 分钟)。本发明尚有多种实施方式，凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种亲和兼容性链霉亲和素突变体，其特征在于:所述亲和兼容性链霉亲和素突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO: 9所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:10所/Jn ο
2.根据权利要求1所述的一种亲和兼容性链霉亲和素突变体，其特征在于:所述亲和兼容性链霉亲和素突变体包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D。
3.一种基于权利要求1所述的亲和兼容性链霉亲和素突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤: O已知的具有127个氨基酸的链霉亲和素成熟氨基酸，其氨基酸序列如序列表中SEQID NO: 3所示，在其N端添加Met氨基酸作为起始密码安置，形成128个氨基酸序列，并在其中引入两个氨基酸的定点突变:S52G、R53D，以及两个氨基酸的换位突变:Y22N、N23Y，得到的128个氨基酸的突变序列如序列表中SEQ ID NO:9所示； 2)将所述128个氨基酸的突变序列经DNAWorks逆翻译成核苷酸序列，所述核苷酸序列的密码子经DNAWorks优化，并且在其5’-端添加了 NcoI酶切位点，3’-端添加终止密码TAA和XhoI酶切位点，在上下游酶切位点外侧各加4个保护碱基，DNA合成仪合成10条寡核苷酸引物，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11 20所示； 3)将所述10条寡核苷酸引物通过PCR合成人工DNA序列，所述人工DNA序列编码128个氨基酸的突变序列，命名为SA128m4，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:21所示，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID N0:9所示，包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D ； 4)构建原核表达工程载体pET28a-SA128m4； 5)构建原核表达工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA128m4 ；` 6)原核表达工程菌株BL21(DE3)-pET28a-SA128m4的扩增、诱导表达； 7)SA128m4的提取与纯化； 8)SA128m4的生物活性测定。
全文摘要
本发明揭示了一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法，所述亲和兼容性链霉亲和素突变体的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:9所示，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示，包含4个氨基酸的突变，分别为Y22N、N23Y、S52G、R53D。本发明提供了一种亲和兼容性链霉亲和素突变体及其制备方法，降低了对生物素的亲和力，提高了对生物素衍生物(如2-亚氨基生物素)的亲和兼容性，有利于在生物素化蛋白的分离、纯化，其产物可用作亲和色谱填料制备。
文档编号C12N15/70GK103242435SQ201310069078
公开日2013年8月14日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者李万波, 黄勇, 陕婧婧, 管春爱, 贾翔 申请人:盘古基因科技(苏州)有限公司