专利名称：一种等温扩增核酸片段的方法
技术领域：
本发明涉及一种等温扩增核酸片段的方法，特别是用与靶序列三个区域互补的一对引物通过链替代反应扩增核酸片段，该方法可作为特异基因片段的快速扩增检测手段。
背景技术：
随着现代分子生物学和分子技术的发展，研究开发了许多核酸扩增技术。其中核酸环介导等温扩增技术(专利ZL 00818262.0, ZL01810370.7，ZL01812204.3，ZL02815992.6，ZL200610080379.7)，由于其具有特异性强、灵敏度高、反应速度快的特点，在核酸特异性扩增和检测领域具有取代PCR的趋势，成为生命科学领域研究的热点之一。核酸环介导等温扩增的主要原理是基于对靶序列的6个区域设计2对特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),在65°C左右的等温条件下保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应，存在环引物的情况下，扩增时间可进一步缩短为40分钟，同时具备不需要热循环、扩增效率更高、不需要特殊仪器等优点。然而环介导等温扩增技术需要针对核酸片段的6-8个区域设计引物，其中至少核酸片段的6个区域(F3C、F2C、F1、B1、B2C和B3C)与2对引物(实质是3对引物:F3, F1C_F2、B1C-B2、B3)完全匹配才能进行扩增，如果加上环引物(LF、LB)，需要设计4对引物，引物二聚体的产生很难避免，引物二聚体引起的假阳性问题也很难避免，限制了该技术的推广应用。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种采用一对引物等温扩增核酸片段的方法，该方法可作为特异基因片段的快速扩增检测手段。上述目的是通过如下技术方案实现的:
一对引物，其特征在于，针对核酸片段，采用PrimerPremier5.0等引物设计软件，设计两对类似于巢式？0 的又不具有重叠序列的引物？1、？2、1 2、1 1，其中，？2的互补序列F2C连在Fl的5’端；或R2的互补序列R2。连在Rl的5’端。引物组合，根据上述引物设计方法，四种引物组合方式分别为F2C_F1、Rl ;F1、R2C-R1 ；F2C-FUR2 ;F2、R2「R1，任何一种组合方式都可以实现核酸片段的等温扩增。等温扩增过程，其特征在于，DNA在65°C左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，本发明的整个反应过程分为核酸片段合成阶段、循环扩增阶段和多米诺扩增阶段，下面将以F2e-Fl、Rl为例阐述等温扩增过程，如附2、图3和图4。核酸片段合成阶段:引物F2C-F1的Fl结合到模板DNA的Fle上，引导合成互补的DNA链，如附图2 (I)和(2);双链合成后，引物Rl结合到DNA的Rle上，引导合成互补的DNA链，如附图2 (3)和(4);在65°C左右DNA处于动态平衡状态，可以解离 成两个单链，解离下的单链可作为循环扩增阶段的初始模板，如附图2 (5)。循环扩增阶段:初始模板上的F2。和F2互补结合，如图3 (6)，在具有链替代作用的DNA聚合酶催化作用下，由F2的3 ’端向5 ’端自发扩增，如图3 (7 )，同时，引物F2C_F1的Fl结合初始模板的Fle上，如图3 (6)，在具有链替代作用的DNA聚合酶催化作用下，由引物F2e-Fl的3’端向5’端扩增，如图3 (7)，由初始模板与引物F2e_Fl双向引发的扩增结果如图3 (8)所示，随后引物Rl结合到扩增产物的R1。上，在具有链替代作用的DNA聚合酶催化作用下向5’端扩增，如图3 (9)，并替代下双链部分的相应单链，扩增产物为I条双链和I条单链，如图3 (10)，分别作为模板通过两个途径循环扩增，途径一，引物Rl结合到单链的R1。上，在具有链替代作用的DNA聚合酶催化作用下，由引物Rl的3’端向5’端扩增形成双链，如图3 (12)和(13)，在65°C左右DNA处于动态平衡状态，形成的双链解离成单链，如图(5)，作为初始模板起始新轮扩增；途径二，在65°C左右，扩增产物双链DNA解离成单链，如图3 (14)，解离的单链通过碱基配对形成茎环结构，如图3 (15)，引物F2e-Fl的Fl结合到茎环结构的Fle上，如图3 (16)，在具有链替代作用的DNA聚合酶催化作用下，由引物F2e-Fl的3’端向5’端扩增，替代下双链部分的相应单链，形成具有部分单链结构的扩增产物，如图3 (8)，并由此开始循环扩增。多米诺扩增阶段:循环扩增阶段形成的η个双链结构，如图3 (10)和图4 (10)，在65°C左右DNA处于动态平衡状态，解离成2η个单链，如图4 (17)，解离的单链通过R1。和Rl的互补配对，搭接成长短不一的类似多米诺骨牌的结构，如图4 (18)，在DNA聚合酶催化作用下，在多米诺结构上由多个Rl。的3’端向5’端扩增，形成双链结构，如图4 (19)和(20)。另外三种引物组合方式(F1、R2C-R1 ;F2C_F1、R2 ;F2、R2C_R1)等温扩增核酸片段的过程与上述过程相似，不再赘述。催化等温扩增反应的酶，其特征在于，本发明中催化该扩增反应的酶为Bca(eX0-)DNA聚合酶，或Bst DNA聚合酶，或Bca (exo_) DNA聚合酶与Tag DNA聚合酶的混合物，或Bst DNA聚合酶与Tag DNA聚合酶的混合物，或其他具有相似作用的酶或酶的混合物。模板，其特征在于，核酸片段为DNA或mRNA，核酸片段为mRNA时，先使用逆转录酶将mRNA反转录成cDNA。
本发明的有益的积极效果:
1.本发明所提出的一对引物等温扩增核酸片段的方法，可作为特异基因片段的快速扩增检测手段。2.本发明所提出的等温扩增核酸片段的方法具有下列各项优点:
(I)特异性强，用于等温扩增的I对引物与靶基因的3个区段完全配对才能扩增，因而具有比PCR更高的特异性。(2)灵敏度高，该等温扩增方法能在模板DNA纯度很低的情况下进行扩增，很少受培养介质和生物学物质的影响，纯化步骤可以忽略。(3)速度快，该方法是等温扩增反应，没有PCR反应中温度变化的耗时，在20min 60min内即可完成反应过程。(4)易推广，该反应是一个等温扩增过程，不用控制温度的变化，所以只需一个简单的等温器，不需要昂贵的PCR仪，对操作人员的分子生物学技术要求不高。(5)引物二聚体引起的假阳性率低，环介导等温扩增技术需要针对靶序列的6-8个区域设计引物，其中至少靶序列的6个区域(F3。、F2C、Fl、B1、B2C和B3C)与2对引物(实质是3对引物:F3，Flc-F2, Blc-B2, B3)完全匹配才能进行扩增，如果加上环引物(LF、LB),需要设计4对引物，引物二聚体引起的假阳性率高，而本发明所提出的方法，只需要设计I对引物，与靶序列的3个或4区域配对就能扩增，因此，相对而言，本发明中引物二聚体引起的假阳性率低。(6)核酸片段长度范围宽，环介导等温扩增引物设计软件限制核酸序列长度最短为200bp，该发明提出的方法可以扩增短至几十个碱基长度。该发明提出的等温扩增核酸片段的方法，可广泛适用于专业化验、海关检疫、卫生防疫、基层卫生医疗部门、食品质量监督部门和食品企业等各层次的需求，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
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图1:引物设计示意图。图2:核酸片段合成阶段示意图。图3:循环扩增阶段示意图。图4:多米诺扩增阶段示意图。(五)具体实施例
核酸等温扩增的方法有很多，例如环介导等温扩增、滚环扩增、依赖解旋酶的等温扩增、切刻内切酶核酸等温扩增，正如发明内容部分所叙述，本发明所提出的等温扩增核酸片段的方法不同于现有的任何核酸等温扩增方法，本方法可广泛用于人致病性病原体的检测以及人类遗传性疾病诊断、鱼贝类致病性病原体的检测、农牧养殖业中病原体的检测、植物病源微生物的检测以及食品中病源微生物的检测。实施例1:
大肠杆菌0157:H7特异基因rfm的扩增检测 引物设计
通过查阅文献和用BLAST软件分析筛选出大肠杆菌0157:叫基因片段r/M，针对该片段的四个区域设计出等温扩增引物并合成，得到如下的引物；引物设计通PrimerPremier5.0引物设计软件完成。上游引物F2C-F1 TTCACACTTATTGGATGGTCT-CTCTCTTTCCTCTGCGGTCC 下游引物 Rl AGGTGGAATGGTTGTCACGA
反应体系(反应总体积为25μ1 )
权利要求
1.一对引物等温扩增核酸片段的方法，其特征在于:使用与核酸片断3个区域互补的一对引物，在DNA聚合酶的作用下通过链替代反应等温扩增核酸片段。
2.根据权利要求1所述的一对引物等温扩增核酸片段的方法，其特征在于:针对特异性革El序列，采用PrimerPremier5.0等引物设计软件，设计两对类似于巢式PCR又不具有重叠序列的引物F1、F2、R2、R1，其中，F2的互补序列F2C连在Fl的5’端，或R2的互补序列R2C连在Rl的5，端。
3.根据权利要求2所述的一对引物等温扩增核酸片段的方法，其特征在于:所述的引物设计方法，引物组合方式分别为F2C-F1、R1 ；FUR2C-R1 ;任何一种组合方式都可以实现核酸片段的等温扩增。
4.根据权利要求1所述的一对引物等温扩增核酸片段的方法，其特征在于:该反应是在具有链替代作用的DNA聚合酶的催化下进行的，反应温度为65°C左右。
5.根据权利要求4一对引物等温扩增核酸片段的方法，其特征在于:所述的具有链替代作用的DNA聚合酶，为Bca (exo-)DNA聚合酶，或Bst DNA聚合酶，或Bca (exo-)DNA聚合酶与Tag DNA聚合酶的混合物，或Bst DNA聚合酶与Tag DNA聚合酶的混合物，或其他具有相似作用的酶或酶的混合物。
6.根据权利要求1所述的一对引物等温扩增核酸片段的方法，其特征在于:核酸片段为DNA或mRNA，核 酸片段为mRNA时，先使用逆转录酶将mRNA反转录成cDNA。
全文摘要
本发明公开了一对引物等温扩增核酸片段的方法，使用与核酸片断3个区域互补的一对引物，在DNA聚合酶的作用下通过链替代反应等温扩增核酸片段；针对特异性靶序列，采用PrimerPremier5.0等引物设计软件，设计两对类似于巢式PCR又不具有重叠序列的引物F1、F2、R2、R1，其中，F2的互补序列F2C连在F1的5’端，或R2的互补序列R2C连在R1的5’端。一对引物与核酸片段的3个区域互补，在DNA聚合酶的作用下通过链替代反应等温扩增核酸片段。该方法可作为特异基因片段的快速扩增检测手段。
文档编号C12Q1/68GK103146684SQ20131006845
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者王德国, 曲海涛, 张文超, 张小辉, 王树芬, 郭山鹿 申请人:许昌学院