专利名称：一种黄曲霉毒素b1降解剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于家禽养殖技术领域，具体涉及一种黄曲霉毒素BI降解剂及其应用。
背景技术：
全世界每年因霉菌毒素污染的粮食作物占粮食总产量得1/4以上，采取措施抑制霉菌毒素的产生并对污染的粮食和饲料进行脱毒处理，是减少损失及保护动物和人类健康的迫切要求。目前在动物生产中应用较为广泛的脱毒方法是通过添加吸附剂的方法对被污染的粮食和饲料作物进行脱毒处理。但是这种方法多是吸附剂与霉菌毒素的螯合，虽然可以有效的吸附霉菌毒素，但是这种简单的吸附在条件改变时霉菌毒素极易从吸附剂上解离且毒性依然存在，同时吸附剂还会吸附饲料中的一些营养物质而影响其利用率。因此采取更为有效和安全的方法对霉菌毒素进行脱毒处理便成为解决问题的关键。采用微生物降解霉菌毒素，由于其具有效率高、无残留、成本低廉和操作简便等优点引起了研究人员的广泛关注，尤其是利用微生物或者其产生的酶将霉菌毒素降解为无毒产物更成为目前研究的热点。对被霉菌毒素污染的粮食作物和饲料进行脱毒处理是扩大饲料资源、降低损失的有效方法，而如果能采取措施抑制原料储藏过程中霉菌的生长，则可从源头上减少霉菌毒素产生。因此可以考虑利用微生物之间的竞争作用，将具有抑制霉菌生长的微生物或其代谢产物按比例添加到饲料原料中抑制霉菌的生长，进而抑制毒素的产生，从而达到预防畜
禽霉菌毒素中毒的目的。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种黄曲霉毒素BI降解剂，在对AFB1有降解作用的益生菌和降解酶的基础上，将益生菌与AFB1降解酶配合应用于肉鸡生产中，观察其对肉鸡饲料中AFB1的解毒效果并探索其解毒机理，为其在动物生产中的应用提供依据。其技术方案如下:一种黄曲霉毒素B1降解剂，包括成分a和成分b，其组合比例为2: 3，其中所述成分a的制备方法为:乳酪杆菌CGMCC1.62、枯草芽孢杆菌CGMCC1.504、异常汉逊酵母CGMCC2.881，单独培养48h后，以2: I: I的比例混合后加载体低温干燥。所述成分b的制备方法为:以AFB1作为碳源和能源进行AFB1降解菌株的筛选，经过26S rDNA的鉴定结果显示，筛选到降解AFB1的真菌为米曲霉，在中国微生物菌种保藏中心的登记编号为CGMCC5817，对降解AFB1的真菌进行固体发酵培养，提取AFBi降解酶粗酶液，加入载体后低温干燥。成分a和成分b，按2: 3比例混合后制成黄曲霉毒素BI降解剂，其中乳酪杆菌、枯草芽孢杆菌和异常汉逊酵母三种菌的含量分别为2 X IO9个/g、I X IO9个/g和I X IO9个Zg^AFB1降解酶活力为135U/g。AFB1降解酶活力的定义为:在37°C的条件下每分钟降解IngAFB1为一个酶活单位。
发明所述黄曲霉毒素B1降解剂在肉鸡生产中的应用。本发明的有益效果:本发明通过筛选得到对黄曲霉菌生长及AFB1降解效果较好的菌株，并对AFB1降解酶进行分离纯化，之后将益生菌与AFB1降解酶配合应用于肉鸡生产中，观察其对肉鸡饲料中AFB1的解毒效果，最后运用基因芯片对肝脏中相关基因表达量进行了测定，为AFB1降解在动物生产中的应用，以及从基因水平上研究AFB1的致病机制并采取措施缓解其危害奠定了基础。
图1为益生菌组合与AFB1降解酶粗酶液配伍对AFB1的降解作用示意图，A、B、C表示的是统计分析中差异显著性，其中大写字母不同表示差异显著(p<0.05)，有一个大写字母相同表示差异不显著(P > 0.05)；
具体实施例方式下面结合附图具体实施方式
对本发明的方法作进一步详细地说明。1、试验菌株及材料实验所用的乳酪杆菌(Lactobacillus casei)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、异常汉逊酵母(Hansenula anomala)均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，并由河南农业大学生物技术与动物营养研究室保存。黄曲霉毒素BI购自Sigma公司，其测定采用德国RIDASCREEN公司Aflatoxin BI 30/15酶联免疫测定试剂盒。2、单一益生菌的制备(I)乳酪杆菌培养液的制备:按4% (v/v)的接种量在MRS培养基中接种乳酪杆菌，置于37°C恒温静止培养，待培养48h时收获。调节菌的含量为I X 109CFU/mL。(2)枯草芽孢杆菌培养液的制备:按4% (v/v)的接种量在LB培养基中接种枯草芽孢杆菌，置于37°C恒温振荡培养(150转/分)，待培养48h时收获。调节菌的含量为lX109CFU/mL。(3)异常汉逊酵母培养液的制备:按4% (v/v)的接种量在LB培养基中接种异常汉逊酵母，置于30°C恒温振荡培养(150转/分)培养，待培养48h时收获。调节菌的含量为 lX109CFU/mL。其中，MRS培养基的组成:胰蛋白胨10g、牛肉蛋白胨10g、酵母5g、葡萄糖20g、K2HPO4 2g、乙酸钠5g、柠檬酸铵2g、MgSO4 0.2g、MnSO4 0.05g，用800mL蒸馏水溶解后加入ImL Tween80，调 pH 为 6.2 6.6，之后定容至 IOOOmL,在 121。。、1.034X IO5Pa 条件下高压蒸汽灭菌20min ；LB培养基的组成:胰蛋白胨10g，酵母5g，NaCl 10g，用800mL蒸馏水溶解后调pH为7.0，之后定容至IOOOmL,在121 °C、1.034X IO5Pa条件下高压蒸汽灭菌20min。3、AFB1降解菌株的筛选以AFB1作为碳源和能源进行AFB1降解菌株的筛选。经过26S rDNA的鉴定结果显示，筛选到降解AFB1的真菌为米曲霉，在中国微生物菌种保藏中心的登记编号为CGMCC5817。
4、降解AFB1的米曲霉所产粗酶液的提取挑取降解AFB1米曲霉菌株，将其涂布于PDA固体平皿，置于30°C恒温培养至孢子大量产生时收获(约96h)。在平皿中加入适量灭菌生理盐水(含体积分数0.05%的TweenSO)，用涂布棒将平皿上的孢子刮下，用四层纱布过滤以除去菌丝残体，将孢子浓度调整为I X 108CFU/mL,按每瓶5mL接种于固体发酵培养基中，混合均匀后置于30°C恒温培养箱中培养5d后收获。按照固液比1: 2的比例将固体发酵培养物与生理盐水混合均匀，室温浸泡Ih (浸泡过程中间断搅拌)。浸泡完成后先用8层纱布过滤发酵培养物，之后将滤液IOOOOXg条件下离心5min,再用定性滤纸过滤,最后用0.20 μ m的滤膜过滤除菌后保存于4°C冰箱，即为米曲霉所产降解AFB1的粗酶液。5、粗酶液对AFBi的降解作用选取粗酶液6mL (另取6mL高温灭活的粗酶液作为对照组)，加入AFB1使其浓度约为100 μ g/L，混合均匀后置于30°C恒温培养，48h后取样测定其中AFB1含量。经测定粗酶液对AFB1的降解率为77.05%。经过热变性试验证明AFBi降解酶的粗酶液为蛋白质。6、益生菌与粗酶液配合对AFB1的降解作用(I)试验设计将益生菌组合(按上文推荐的比例组合，每种菌的含量为lX109CFU/mL)与降解AFB1粗酶液按表I的组合比例进行调配，使反应体系的最终体积均为60mL。加入AFB1使其在体系中的最终浓度约为50μ g/L，将其置于37°C恒温气浴振荡器中振荡培养。以相同体积的PBS缓冲液加同等剂量的AFB1作为空白对照。表I益生菌组合与降解AFB1粗酶液配伍对AFBl的降解的试验设计
权利要求
1.一种黄曲霉毒素B1降解剂，其特征在于，包括成分a和成分b，其组合比例为2: 3，其中: 所述成分a的制备方法为:乳酪杆菌CGMCC1.62、枯草芽孢杆菌CGMCC1.504、异常汉逊酵母CGMCC2.881，单独培养48h后，以2: I: I的比例混合后加载体低温干燥； 所述成分b的制备方法为:以AFB1作为碳源和能源进行AFB1降解菌株的筛选，经过26SrDNA的鉴定结果显不，筛选到降解AFB1的真囷为米曲霉，在中国微生物囷种保减中心的登记编号为CGMCC5817，对降解AFB1的真菌进行固体发酵培养，提取AFBi降解酶粗酶液，力口入载体后低温干燥； 成分a和成分b，按2: 3比例混合后制成黄曲霉毒素BI降解剂，其中乳酪杆菌、枯草芽孢杆菌和异常汉逊酵母三种菌的含量分别为2 X IO9个/g、I X IO9个/g和I X IO9个/g，AFB1降解酶活力为135U/g，AFB1降解酶活力的定义为:在37°C的条件下每分钟降解IngAFB1为一个酶活单位。
2.权利要求1所述黄曲霉毒素B1降解剂在肉鸡生产中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种黄曲霉毒素B1降解剂，包括成分a和成分b，其组合比例为2∶3，其中所述成分a的制备方法为乳酪杆菌CGMCC1.62、枯草芽孢杆菌CGMCC1.504、异常汉逊酵母CGMCC2.881，单独培养48h后，以2∶1∶1的比例混合后加载体低温干燥。所述成分b的制备方法为以AFB1作为碳源和能源进行AFB1降解菌株的筛选，经过26S rDNA的鉴定结果显示，筛选到降解AFB1的真菌为米曲霉，在中国微生物菌种保藏中心的登记编号为CGMCC5817，对降解AFB1的真菌进行固体发酵培养，提取AFB1降解酶粗酶液，加入载体后低温干燥。本发明为黄曲霉毒素B1降解剂在动物生产中的应用，以及从基因水平上研究AFB1的致病机制并采取措施缓解其危害奠定了基础。
文档编号C12R1/245GK103190538SQ201310067190
公开日2013年7月10日 申请日期2013年2月23日 优先权日2013年2月23日
发明者尹清强, 左瑞雨, 王平, 常娟, 郑秋红, 刘智勇, 范首武 申请人:郑州欧克拜生物技术有限公司