专利名称：经由镁螯合的pcr热启动的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过执行聚合酶链反应方法(PCR)扩增核酸的技术领域。更精确地，本发明提供了用于执行PCR的新型热启动替代方案，这防止非特异性的引发事件和假扩增产物的产生。
背景技术：
伴随核酸扩增和更特别地伴随PCR的主要问题是非特异性扩增产物的产生。在许多情况下，这是由于在其实际的热循环程序前的非特异性寡核苷酸引发和随后的引物延伸事件，因为耐热的DNA聚合酶在环境温度下也是适度活性的。例如，经常观察到由于最终由偶然发生的引物二聚化和后续延伸的扩增产物。为了克服这个问题，本领域众所周知的是进行所谓的“热启动” PCR，其中扩增反应所需的一种组分与反应混合物分开或维持无活性状态，直至反应混合物的温度首次升高。因为聚合酶在这些条件下不起作用，所以在引物无一可以特异性结合的时间段期间不存在引物延伸。为了达到这种作用，已应用几种方法:a) DNA聚合酶的物理分离物理分离可以例如通过固体蜡的屏障来获得，所述固体蜡使包含DNA聚合酶的区室与包含大量其他试剂的区室分开。在第一个加热步骤期间，蜡随后自动熔化且流体区室混合(Chou，Q.，等人，Nucleic AcidsRes20 (1992) 1717_23，US5, 411，876)。可替代地，在扩增反应前，DNA聚合酶被亲和固定化在`固体支持体上，并且仅通过热介导的释放而释放到反应混合物内(Nilsson, J.,等人,Biotechniques22 (1997) 744-51)。然而,这两种方法是费时的且不便于执行。b) DNA聚合酶的化学修饰对于这种类型的热启动PCR，DNA聚合酶由于化学修饰而可逆地灭活。更精确地，将不耐热的封闭基团引入Taq DNA聚合酶内，这使得酶在室温下无活性(US5，773，258)。这些封闭基团在高温下在前PCR步骤期间被去除，从而使得酶变得活化。此种不耐热的修饰例如可以通过使朽1康酐或乌头酐(Aconitric Anhydride)与酶的赖氨酸残基偶联来获得(US5，677，152)。携带此种修饰的酶同时是作为Amplitaq Gold(Moretti，T.，等人，Biotechniques25(1998)716-22)或 FastStart DNA 聚合酶(Roche MolecularBiochemicals)商购可得的。然而，封闭基团的引入是在酶所有空间可利用的赖氨酸残基上任意发生的化学反应。因此，化学修饰的酶制剂的再现性和品质可能有变化且几乎不能加以控制。c) DNA聚合酶的重组修饰Taq聚合酶的冷敏感突变体已借助于基因工程进行制备。这些突变体不同于野生型酶之处在于它们缺乏N末端(US6，241，557)。与天然或野生型重组Taq聚合酶形成对t匕，这些突变体在35°C下是完全无活性的，且因此它们可以在一些情况下用于执行热启动PCR0然而，N末端截短的冷敏感突变体形式需要低盐缓冲液条件，与野生型酶相比较具有较低的持续合成能力且因此仅能用于扩增短靶核酸。此外，因为截短形式缺乏5' -3'外切核酸酶活性，所以它不能用于基于TaqMan检测形式的实时PCR实验。d)经由核酸添加剂的DNA聚合酶抑制非特异性退火的引物延伸已显示通过添加短双链DNA片段得到抑制(Kainz，P.，等人，Biotechniques28 (2000) 278-82)。在这种情况下，引物延伸在低于短双链DNA片段的解链温度的温度下得到抑制，但不依赖对照模板(Competitor)DNA自身的序列。然而，过量的对照模板DNA影响核酸扩增反应产量的程度是未知的。可替代地，可以使用具有导致限定的二级结构的特定序列的寡核苷酸适体。此种适体已使用SELEX技术就对DNA聚合酶的极高亲和力进行选择(US5，693，502，Lin, Y.和Jayasena, S.D., J Mol Biol271 (1997) 100-11)。在实际热循环过程自身前扩增混合物内此种适体的存在再次导致与DNA聚合酶的高亲和力结合和随后其活性的不耐热抑制(US6, 020, 130)。然而，由于选择过程，迄今为止的所有可利用的适体仅能与一个特定种类的DNA聚合酶组合使用。e)Taq DNA 抗体达到Taq DNA聚合酶的不耐热抑制的替代方法是添加针对纯化的酶产生的单克隆抗体(Kellogg, D.E.，等人，Biotechniquesl6 (1994) 1134-7 ； Sharkey, D.J.，等人，Biotechnology (NY) 12 (1994) 506-9)。如同寡核苷酸适体,抗体与Taq DNA聚合酶在环境温度下以抑制方式以高亲和力结合(US5，338，671)。复合物在热循环过程自身前的预热步骤中分解。这导致总体上扩增的基本上费时的延长，特别是如果应用用于快速热循环的规程(W097/46706)。US5，985，619公开了使用热启动抗体用于执行PCR的具体实施方案，其中除Taq聚合酶外，将例如来自大肠杆菌(E.coli)的外切核酸酶III作为补料加入扩增混合物内，以消化非特异性引物二聚体中间物。如上文公开的，外切核酸酶III识别双链DNA作为底物，如例如靶/引物或靶/引物延伸产物杂交物。消化借助于切割在3'末端脱氧核苷酸残基的5'末端上的磷酸二酯键而发生。因为这种类型的外切核酸酶在环境温度下有活性，所以所有非特异性退火的引物和引物延伸产物因此被消化。在一些实施方案中，这导致扩增反应甚至增强的特异性。然而，依赖于预温育时间的持续时间的非特异性引物消化可以导致引物浓度中相当大和不受控制的减少，这依次可以影响扩增反应自身。f)经修饰的引物单独或与外切核酸酶组合使用EP0799888和GB2293238公开了给PCR反应添加:V封闭的寡核苷酸。由于:V封闭，这些寡核苷酸不能充当引物。封闭的寡核苷酸设计为与PCR引物竞争/相互作用，这导致非特异性产物的减少。另一个替代方案是硫代磷酸酯寡核苷酸引物与外切核酸酶III组合在PCR反应混合物中的使用(EP0744470)。在这种情况下，通常接受双链以及单链DNA底物的3'外切核酸酶降解双链体人为产物例如引物二聚体以及遗留(carry over)扩增子，同时使单链扩增引物不降解。类似地，已提议使用具有基 本修饰的3'末端和经由大肠杆菌内切核酸酶IV的模板依赖性去除的引物(US5，792，607)。一般想法的具体实施方案在EP1275735中找到。它的说明书公开了用于执行核酸扩增反应的组合物，其包含(i)耐热的DNA聚合酶，(ii)耐热的3' -5'外切核酸酶，和
(iii)具有经修饰的3'末端残基的用于核酸扩增的至少一种引物，这经由所述耐热的DNA聚合酶不延伸，以及使用这种组合物用于执行PCR反应的方法。此外，该方法涉及包含此种组合物的试剂盒。然而，公开的替代方案的主要缺点是，对于每种PCR反应需要经修饰的引物，这导致关于增加每次个别测定的成本增加的要求。g)其他PCR添加剂本领域已知的其他有机添加剂如DMS0、甜菜碱和甲酰胺(W099/46400 ；Hengen,P.N., Trends Biochem Sci22(1997)225-6 ；Chakrabarti, R.和 Schutt, C.E., NucleicAcids Res29 (2001) 2377-81)导致富含GC序列的扩增的改善，而不是引物二聚体形成的阻止。类似地，发夹推测通过去除蛋白质如组蛋白可以刺激体外连缀转录，以使得染色体DNA可接近(Hildebrand, C.E.,等人，Biochimica et BiophysicaActa477 (1977) 295-311)。已知单链结合蛋白(US5,449，603)或 tRNA (Sturzenbaum, S.R.,Biotechniques27 (1999) 50-2)的添加导致这些添加剂与引物的非共价结合。这种结合在PCR期间加热时被破坏。还发现DNA解旋酶的添加阻止引物的随机退火(Kaboev，0.K.，等人，Bioorg Khim25 (1999) 398-400)。此外，在几种情况下可以使用聚谷氨酸(W000/68411)，以抑制低温下的聚合酶活性。此外，已知聚阴离子聚合酶抑制剂可以依赖于应用的温育温度控制耐热的DNA聚合酶的活性。US6，667，165公开了热启动实施方案，其特征在于无活性的聚合酶抑制剂复合物在低于40°C温度下 形成。在40°C _55°C之间，抑制剂与模板DNA竞争结合Taq聚合酶，而在高于55°C的温度下，抑制剂从聚合酶活性位点排代。然而，当使用具有较低退火温度的引物时，抑制剂趋向减少可获得的产物产量。h)镁螯合因为耐热的聚合酶早就已知仅在Mg2+阳离子的存在下是有活性的，所以已尝试在热循环规程开始前螯合镁，以避免错误引发和非特异性引物延伸。如US6，403，341中公开的，Mg2+可以以沉淀物的形式存在，并且因此在扩增反应开始时不能利用。温度在第一轮热循环期间增加后，沉淀物溶解且Mg2+变得在前3个循环内完全可用。此种溶液已显示是相当可应用的，并且能够提供良好的热启动结果。另一方面，此种溶液不允许制备包含除引物和靶核酸外的所有试剂的主混合物，这是执行核酸扩增反应所必需的。因此，测定间数据再现性和数据比较是复杂的。考虑到概述的现有技术，本发明的目的是提供用于热启动PCR的改善的替代组合物和方法，这允许不仅在扩增过程自身前还在热循环过程期间抑制非特异性引发和引物延伸。更精确地，本发明的目的是提供用于热启动PCR的替代组合物和方法，在其中不能发生非特异性退火引物的延伸。
发明内容
能够催化聚合酶链反应的大多数耐热的聚合酶依赖二价阳离子通常为Mg2+的存在。本发明基于通过向聚合酶链反应混合物中添加二价阳离子结合化合物来产生热启动效果的原理，所述二价阳离子结合化合物以温度依赖性方式结合二价阳离子。因此，在第一个方面，本发明涉及具有不超过30个氨基酸的长度包含二价阳离子结合位点的合成肽。优选地，根据本发明的所述合成肽以0.0lmM-1OOOO U M的亲和常数结合所述二价
阳离子。因为大多数耐热的聚合酶是Mg2+依赖性的，所以所述二价阳离子结合位点优选是结合Mg2+的基序(motive)。在具体实施方案中，根据本发明的合成肽包含至少一次氨基酸序列基序X1X2X3，其中Xl是带负电荷的氨基酸，优选地天冬氨酸X2是甘氨酸或脂族氨基酸X3是带负电荷的氨基酸在第二个方面，本发明涉及包含下述的组合物-耐热的DNA聚合酶-至少一类二价阳离子，优选地Mg2+-脱氧核苷酸 -缓冲液-如上文公开的具有不超过30个氨基酸的长度包含二价阳离子结合位点的合成肽优选地，根据本发明的所述组合物进一步包含至少一种核酸化合物，例如应变得扩增的引物和/或靶核酸。在第三个方面，本发明涉及包含下述的试剂盒-如上文公开的肽，和-耐热的DNA聚合酶在第四个方面，本发明涉及用于扩增特定靶核酸的方法，其包括下述步骤-提供怀疑包含所述靶核酸的样品-加入如上文公开的组合物，和-执行聚合酶链反应在具体实施方案中，所述聚合酶链反应进行实时监控。在进一步具体的实施方案中，对由所述扩增产生的所述扩增产物实施解链曲线分析。
图1图1显示了如实施例1中公开的具有序列DTRTDIET的镁结合肽的效果。当肽存在于PCR反应混合物中时，引物二聚体产物形成(1=0> )被抑制，而对特异性产物形成(一)没有影响。泳道1:来自Roche Applied Science的分子量标记VI
2，7:50ng 模板 DNA3，8:25ng 模板 DNA4，9: IOng 模板 DNA5，10:5ng 模板 DNA6，11:1ng 模板 DNA泳道2-6的产物在不存在肽的情况下进行扩增，泳道7-11的产物在具有序列H-DIETDIET-NH2的2mM肽的存在下进行扩增。当肽存在于PCR反应混合物中时，引物二聚体产物形成()被抑制，而对特
异性产物形成(一)没有影响。图2图2显示了序列H-ro⑶FD⑶-NH2的镁结合肽的效果。当肽存在于PCR反应中时，引物二聚体产物形成(减少，平行观察到特异性产物形成(一)的增加。泳道1:来自Roche Applied Science的分子量标记VI2:25ng 革巴 DNA,无肽3:25ng 革巴 DNA, 3mM 妝4: IOng | E DNA,无肽5: IOng 革巴 DNA, 3mM 妝图3图3A:在不存在镁结合肽的情况下具有102-106个G6TOH RNA拷贝的RT-PCR。图3b:在不存在镁结合肽的情况下具有102-106个G6TOH RNA拷贝的RT-PCR的解链曲线分析。图3c:在ImM镁结合肽的存在下具有102-106个G6TOH RNA拷贝的RT-PCR。图3d:在ImM镁结合肽的存在下具有102-106个G6TOH RNA拷贝的RT-PCR的解链曲线分析。图4泳道2-6的产物在不存在肽H-DIETDIETDIET-NH2的情况下进行扩增，泳道7_11在具有序列H-DIETDIETDIET-NH2的2.0mM肽的存在下进行扩增。当肽存在于PCR反应混合物中时，引物二聚体产物形成被抑制，而对特异性产物形成(一)没有影响。泳道1,12:来自 Roche Applied Science 的分子量标记 V2，7:50ng 模板 DNA3,8:25ng 模板 DNA4，9:1Ong 模板 DNA5,10:5ng 模板 DNA6，11:1ng 模板 DNA
具体实施例方式能够催化聚合酶链反应的大多数耐热的聚合酶依赖二价阳离子通常为Mg2+的存在。本发明基于通过向聚合酶链反应混合物中添加二价阳离子结合化合物来产生热启动效果的原理，所述二价阳离子结合化合物以温度依赖性方式结合二价阳离子。因此，在第一个方面，本发明涉及具有不超过30个氨基酸的长度包含二价阳离子结合位点的合成肽。还可以使用具有小于17个氨基酸的长度的较小合成肽。因为关于二价阳离子的结合位点需要至少3-4个氨基酸残基(参见下文)，所以尺寸下限是代表二价阳离子结合位点单体的由3-4个氨基酸组成的肽。如果所述合成肽包含超过一个二价阳离子结合位点基序，即如果它们包含2次、3次或4次所述基序，这也在本发明的范围内。然而，除代表二价阳离子结合序列基序的氨基酸外，根据本发明的所述合成肽可以包含更多的氨基酸，其可以不是此种基序的部分，但可以有助于所述肽的其他特征。例如，另外的氨基酸残基可以增加所述肽在不同溶剂中的溶解度。在本发明的背景中，术语“合成肽”定义为由酰胺键连接的氨基酸链，其已借助于缩合进行化学合成。然而，明确排除的是已借助于分离和(任选的)断裂得自活生物的肽或肽片段。此种合成肽可以根据本领域一般众所周知的方法使用。合成基于其中氨基酸在缩合反应中借助于形成酰胺键与新生肽链连接的自动化循环反应。偶联的氨基酸的反应性侧链由可适当去除的保护基覆盖。技术发展水平的全面概括在Fields，G.B.，Noble, R.L.，J.Peptide ProteinRes.35(1990) 161-214中给出。此种化学合成导致具有一般的H2N末端(通常称为“H”)和具有羧基酰胺化物的C末端(通常称为“_NH2”)的肽的产生。根据本发明的肽能够结合二价阳离子。结合的强度主要依赖于二价阳离子的性质连同肽的基本肽序列基序。优选地，根据本发明的所述合成肽在中性PH下以
0.0lmM-1OOOOiiM的亲和常数结合所述二价阳离子。具有较强的亲和率的化合物例如EDTA当加入扩增反应时已显示导致有害作用，而另一方面，当此种肽化合物加入核酸扩增反应时，需要最低限度的亲和率以产生可测量的阳性效果。更优选地，所述亲和常数具有
0.1mM-1OOOmM的值。最优选 地，所述亲和常数具有ImM-1OOmM的值。因为大多数耐热的聚合酶是Mg2+依赖性的，所以所述二价阳离子结合位点优选是结合Mg2+的基序。在下文的部分中，应用下述氨基酸分类。无亚类:甘氨酸(Gly)G脯氨酸(Pro)P非极性，脂族:丙氨酸(Ala)，A缬氨酸(Val)，V亮氨酸(Leu)，L异亮氨酸(Ile)I芳族:苯丙氨酸(Phe)，F酪氨酸(Tyr)，Y色氨酸(Trp)W极性，不带电的:
丝氨酸(Ser)，S苏氨酸(Thr)，T半胱氨酸(Cys),C甲硫氨酸(Met)，M天冬酰胺(Asn)，N谷氨酰胺(Gln)，0带正电荷的:赖氨酸(Lys)，K精氨酸(Arg)，R组氨酸(His)H带负电荷的:天冬氨酸(Asp)，D谷氨酸(Glu)E优选地，根据本发明的 合成肽包含至少一次氨基酸序列基序X1X2X3，其中Xl是带负电荷的氨基酸，优选地天冬氨酸X2是甘氨酸或脂族氨基酸X3是带负电荷的氨基酸。在一个实施方案中，X3是谷氨酸。如果是这种情况，那么X2优选是异亮氨酸。同样优选地，与X3邻近的C末端有X4，所述X4是极性不带电的氨基酸例如苏氨酸。最优选地，X2是异亮氨酸且与X3邻近的C末端有X4，所述X4是极性不带电的氨基酸例如苏氨酸。在另一个实施方案中，X3是天冬氨酸。如果是这种情况，那么X2优选是甘氨酸。同样优选地，与Xl邻近的N末端有X0，所述XO是芳族氨基酸例如苯丙氨酸。最优选地，X2是异亮氨酸且与Xl邻近的N末端有X0，所述XO是芳族氨基酸例如
苯丙氨酸。在第二个方面，本发明涉及包含下述的组合物-耐热的DNA聚合酶-至少一类二价阳离子，优选地Mg2+-脱氧核苷酸-缓冲液-如上文公开的具有不超过30个氨基酸的长度包含二价阳离子结合位点的合成肽。根据本发明的此种组合物用于执行以聚合酶链反应(PCR)形式的核酸扩增反应。作为耐热的聚合酶，可以使用各种各样的酶。优选地，所述耐热的DNA聚合酶选自敏捷气热菌(Aeropyrum pernix),闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus),硫还原球菌属物种(Desulfurococcus sp.) Tok.,嗜热喊甲烧杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)，甲烧球菌属物种(Methanococcus sp.)(例如詹氏甲烧球菌(jannaschii),沃氏甲烧球菌(voltae)),炽热甲烧嗜热菌(Methanothermus fervidus.),火球菌属(Pyrococcus)物种(激烈火球菌(furiosus)、种类GB-D、沃氏火球菌(woesii)、abysi1、horikoshi1、KOD> Deep Vent、Proofstart), Pyrodictium abyssii,隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum),硫化叶菌属物种(Sulfolobus sp.)(例如嗜酸热硫化叶菌(acidocaldarius)、硫横矿硫化叶菌(solfataricus)),热球菌属(Thermococcus)物种(zilligi1、barossi1、fumicolans、gorgonarius、JDF-3、kodakaraensis KODI>litoralis、种类 9 分度North-7、种类 JDF-3、gorgonarius、TY),嗜酸热原体(Thermoplasmaacidophilum),非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus),栖热袍菌属物种(Thermotogasp.)(例如海栖热袍菌(maritima)、那不勒斯栖热袍菌(neapolitana)),嗜热碱甲烧杆菌，栖热菌属(Thermus)物种(例如,水生栖热菌(aquaticus)、布氏栖热菌(brockianus)、丝状栖热菌(filiformis)、黄栖热菌(fIavus)、乳栖热菌(Iacteus)、红色栖热菌(rubens)、红栖热菌(ruber)、嗜热栖热菌(thermophilus)、Z05或Dynazyme)。还在本发明的范围内的是其突变体、变体或衍生物、嵌合或“融合-聚合酶”，例如Phusion(Finnzymes或 New England biolab s,目录号 F-530S)或 iProof (Biorad,目录号 172-5300), PfxUltima (Invitrogen,目录号 12355012)或 HerculaseII Fusion (Stratagene,目录号600675)。此外，根据本发明的组合物可以包含上述一种或多种聚合物的掺合物。在一个实施方案中，耐热的DNA聚合酶是DNA依赖性聚合酶。在另一个实施方案中，耐热的DNA聚合酶具有另外的逆转录酶活性且可以用于RT-PCR。关于此种酶的一个例子是嗜热栖热菌(Thermusthermophilus) (Roche Diagnostics 目录号:11480014001)。还在本发明的范围内的是上文汇集的一种或多种聚合酶与逆转录病毒逆转录酶的掺合物，所述逆转录酶例如来自MMLV、AMV、AMLV、HIV、EIAV、RSV的聚合酶和这些逆转录酶的突变体。具有不超过30个氨基酸的长度包含二价阳离子结合位点的合成肽以这样的浓度存在，一旦组合物用于扩增靶核酸，所述浓度就允许“热启动效果”。通常，包含Mg2+结合位点的肽可以以0.1-1OmM的终浓度存在。优选地，包含Mg2+结合位点的肽以0.5_5mM存在。高度优选的是l_3mM的浓度。DNA聚合酶、脱氧核苷酸和其他缓冲液组分的浓度以标准量存在，其浓度是本领域众所周知的。Mg2+浓度可以为0.lmM-3mM，并且优选适应且在实验上进行最优化。然而，因为浓度最适值通常依赖于使用的实际引物序列，所以无法在理论上进行预测。除了上文公开的组合物，如果这些组合物进一步包含至少一种核酸化合物，那么这也在本发明的范围内。例如，此种组合物可以包含用于执行核酸扩增反应的至少一对扩增引物。根据本发明的组合物还可以是PCR反应混合物，所述PCR反应混合物另外包含至少部分纯化的核酸样品，由其将扩增怀疑存在于所述样品中的靶核酸序列。此外，此种组合物可以包含用于实时检测分别的扩增产物的荧光化合物，以及分别地2、3、4或5-6种不同标记的杂交探针，所述杂交探针不限于但选自如将在下文公开的检测方法中有用的FRET杂交探针、TaqMan探针、分子信标(Molecular Beacons)和单标记的探针。可替代地，此种组合物可以包含dsDNA结合荧光实体例如SybrGreen，其仅当与双链DNA结合时发出荧光。在第三个方面，本发明涉及至少包含下述的试剂盒⑴耐热的DNA聚合酶
(ii)如上文公开的合成Mg2+结合肽，和优选地，此种试剂盒包含至少⑴耐热的DNA聚合酶(ii)如上文公开的合成Mg2+结合肽，和(iii)MgC12贮存液以调整最终的Mg2+浓度最优选地，此种试剂盒包含至少⑴耐热的DNA聚合酶(ii)如上文公开的合成Mg2+结合肽，(iii)MgC12贮存液以调整最终的Mg2+浓度(iv)脱氧核苷-三-磷酸的混合物，和(V)缓冲液此外，根据本发明的此种试剂盒可以是包含至少一对扩增引物的参数特异性试剂盒。此种试剂盒还可以包含多对扩增引物和优选地2、3、4或5对扩增引物。此外，此种试 剂盒可以包含用于实时检测分别的扩增产物的荧光化合物，以及分别地2、3、4或5-6种不同标记的杂交探针，所述杂交探针不限于但选自如将在下文公开的检测方法中有用的FRET杂交探针、TaqMan探针、分子信标和单标记探针。可替代地，此种试剂盒可以包含dsDNA结合荧光实体，其仅当与双链DNA结合时发出荧光。例如，此种试剂盒可以包含SybrGreen。在一个示例性实施方案中，此种试剂盒特别适合于执行单步RT-PCR，并且包含TaqDNA聚合酶和逆转录酶例如AMV逆转录酶的掺合物。在进一步的示例性具体实施方案中，此种试剂盒特别适合于执行单步实时RT-PCR，并且包含核酸检测实体例如SybrGreen或荧光标记的核酸检测探针。不同组分可以各自单独贮藏于不同容器中。可替代地，不同组分可以全部一起贮藏于I个贮藏容器中。同样可替代地，仅组分(i)-(v)亚类的任意选择的组合可以一起贮藏。在优选实施方案中，组分如酶(i)或酶加包含1§队的反应缓冲液、(1见1^(1、^、“、0和肽一起忙藏。在第四个方面，本发明涉及用于扩增特定靶核酸的方法，其包括下述步骤-提供怀疑包含所述靶核酸的样品-加入如上文公开的组合物，和-执行聚合酶链反应用于执行和最优化核酸扩增反应的方法是本领域众所周知的。特别地，本领域使用的最常见方法是如US4，683，195、US4，683，202和US4，965，188中详细公开的聚合酶链反应。特别地，根据本发明的方法包括下述步骤a)提供待扩增的怀疑包含靶核酸的样品b)提供具有不超过30个氨基酸的长度包含二价阳离子结合位点的合成肽c)提供DNA聚合酶、dNTPs、缓冲液和Mg2+盐d)提供设计为特异性扩增预定靶核酸的扩增引物对。提及的所有组分的添加可以以任意顺序来进行。然而，为了达到热启动效果，即为了阻止在热循环扩增规程自身前在较低温度下的错误引发和随后的引物延伸，重要的是所述合成肽在DNA聚合酶、dNTPs和扩增引物组合前加入反应混合物中。尽管包含二价阳离子结合位点的所述合成肽如何导致更特异性的扩增反应的机制仍未详细了解，但假定在较低温度下肽与Mg2+形成复合物是合理的，所述Mg2+自身已知是引物延伸反应中DNA聚合酶的辅因子。定量复合物形成导致游离Mg2+浓度中的减少，其结果是由于缺乏其辅因子的可用性，DNA聚合酶活性被灭活。温度循环规程开始后，合成肽和二价阳离子之间的不耐热的复合物分解，并且Mg2+再次可用作辅因子用于聚合酶催化的引物延伸反应。优选地，在核酸扩增期间添加的合成肽包含至少一次氨基酸序列基序X1X2X3，其中Xl是带负电荷的氨基酸，优选地天冬氨酸X2是甘氨酸或脂族氨基酸X3是带负电荷的氨基酸。在一个实施方案中，X3是谷氨酸。如果是这种情况，那么X2优选是异亮氨酸。同样优选地，与X3邻近的C末端有X4，所述X4是极性不带电的氨基酸例如苏氨酸。最优选地，X2是异亮氨酸且与X3邻近的C末端有X4，所述X4是极性不带电的氨基酸例如苏氨酸。在另一个实 施方案中，X3是天冬氨酸。如果是这种情况，那么X2优选是甘氨酸。同样优选地，与Xl邻近的N末端有X0，所述XO是芳族氨基酸例如苯丙氨酸。最优选地，X2是异亮氨酸且与Xl邻近的N末端有X0，所述XO是芳族氨基酸例如
苯丙氨酸。在具体实施方案中，所述聚合酶链反应进行实时监控。存在用于此种监控的不同检测形式。a) TaqMan 形式:单链杂交探针用2种组分进行标记。当第一种组分用合适波长的光激发时，根据荧光共振能量转移的原理，吸收的能量转移至第二种组分，所谓的猝灭剂。在PCR反应的退火步骤期间，杂交探针与靶DNA结合，并且在随后的延长期过程中通过Taq聚合酶的5' -3'外切核酸酶活性降解。因此激发的荧光组分和猝灭剂彼此在空间上分开，并且从而可以测量第一种组分的荧光发射。TaqMan探针测定在US5，210, 015、US5, 538，848和US5, 487，972中详细公开。TaqMan杂交探针和试剂混合物在US5，804, 375中公开。b)释放形式:此外，限制于等位基因特异性检测的2种其他形式近期已得到公开，其基于下述原理:由于关于其与靶核酸结合的匹配或错配情形，标记的3'末端核苷酸的释放的特异性检测。US6，391，551公开了这样的方法，其特征在于在靶序列和探针之间的完美匹配已发生的情况下，杂交探针的3'末端核苷酸由解聚酶释放。类似地，EP0930370建议使用由报道分子和猝灭剂部分标记的引物，其特征在于在引物和扩增靶之间未发生完美匹配的情况下，3' -5'校正活性去除I个部分。
c)分子信标:这些杂交探针也用第一种组分和猝灭剂进行标记，标记优选位于探针的2个末端上。作为探针二级结构的结果，2种组分在溶液中空间上邻近。与靶核酸杂交后，2种组分彼此分开，从而使得用合适波长的光激发后，可以测量第一种组分的荧光发射(US5, 118，801)。d) FRET 杂交探针:FRET杂交探针测试形式对于所有种类的同质杂交测定尤其有用(Matthews，J.A.和 Kricka, L.J., Analytical Biochemistryl69 (1988) 1-25)。它的特征在于 2 种单链杂交探针，所述2种单链杂交探针同时使用且与扩增的靶核酸相同链的邻近位点互补。2种探针用不同的荧光组分进行标记。当用合适波长的光激发时，根据荧光共振能量转移的原理，第一种组分将吸收的能量转移给第二种组分，从而使得当2种杂交探针与待检测的靶分子的邻近位置结合时，可以测量第二种组分的荧光发射。可替代地，为了监控FRET受体组分荧光中的增加，还可能监控FRET供体组分的荧光减少作为杂交事件的定量测量。特别地，FRET杂交探针形式可以在实时PCR中使用，以检测扩增的靶DNA。在本领域已知的实时PCR的所有检测形式中，FRET杂交探针形式已证明是高度灵敏、精确和可靠的(W097/46707 ；W097/46712 ；W097/46714)。作为使用2种FRET杂交探针的替代方案，还可能使用突光标记的探针和仅一种标记的寡核苷酸探针(Bernard,P.S.,等人,AnalyticalBiochemistry255 (1998) 101-107)。在这点上，可以任意选择，无论引物是用FRET供体还是用FRET受体化合物进行标记。e)单标记探针(SLP)形式:这种检测形式由用单一荧光染料在5'或3'末端上标记的单寡核苷酸组成(W002/14555) o 2种不同设计可以用于寡聚体(oligo)标记:G_粹灭(G-Quenching)探针和硝基H引哚去粹灭(Nitroindole-D`equenching)探针。在G-粹灭实施方案中，突光染料与寡聚体5'-或3'-末端上的C附着。当探针与靶杂交时，在2个G' s位于与C相对的靶链上和互补寡核苷酸探针旁边的位置I中的情况下，荧光显著减少。在硝基吲哚去猝灭实施方案中，荧光染料与寡核苷酸的5'-或3'-末端上的硝基吲哚附着。硝基吲哚以某种方式减少游离探针的荧光信号。当探针与靶DNA杂交时，由于去猝灭作用，荧光增加。f) SybrGreen 形式:如果在扩增产物使用双链核酸结合部分进行检测的情况下，实时PCR在根据本发明的添加剂的存在下进行，那么这也在本发明的范围内。例如，分别的扩增产物还可以根据本发明通过荧光DNA结合染料进行检测，在用合适波长的光激发后，所述荧光DNA结合染料在与双链核酸相互作用后发出相应的荧光信号。染料SybrGreenI和SybrGold(MolecularProbes)已证明特别适合于这种应用。可替代地可以使用嵌入染料。然而，对于这种形式，为了区别不同的扩增产物，必须执行分别的解链曲线分析(US6，174，670)。本发明的进一步的方面涉及这样的方法，其特征在于如上文公开的具有不超过30个氨基酸的长度包含二价阳离子结合位点的合成肽用于实时PCR和随后的解链曲线分析。由于用SybrGreen形式的实时扩增子检测无法区别特异性产物和扩增人为产物例如引物/ 二聚体的事实，所以通常执行随后的解链曲线分析。PCR反应完成后，样品的温度组成型增加，并且在SybrGreen与样品中存在的双链DNA结合时检测荧光。双链DNA解离后，信号立即减少。这种减少用合适的荧光对温度-时间图进行监控，从而使得在观察到最大限度的突光减少时可以测定一次导数(first derivative)值。因为引物/ 二聚体双链DNAs通常短，所以与双链特异性扩增产物的解离相比较，解离成单链DNA在较低温度下发生。如果在此种解链曲线分析期间，具有二价阳离子结合位点的合成肽存在于样品内，那么当测定各自的荧光对温度-时间图的一次导数时，在许多情况下获得更加陡峭的曲线。除了 PCR和实时PCR外，FRET杂交探针用于解链曲线分析。在此种测定中，靶核酸首先在一般的PCR反应中用合适的扩增引物进行扩增。杂交探针可以在扩增反应期间已存在或随后添加。在PCR反应完成后，样品的温度组成型增加，并且在杂交探针与靶DNA结合时检测荧光。在解链温度时，杂交探针从其靶释放，并且荧光信号立即下降至背景水平。这种减少用合适的荧光对温度-时间图进行监控，从而使得在观察到最大限度的荧光减少时可以测定一次导数值。如果在此种解链曲线分析期间，具有不超过30个氨基酸的长度包含二价阳离子结合位点的合成肽存在于样品内，那么当测定各自的荧光对温度-时间图的一次导数时，获得更加陡峭的曲线。如果分子信标或单标记的探针用作检测实体用于解链曲线分析，那么可以观察到类似效果。提供下述实施例、序列表和图以帮助理解本发明，本发明的真实范围在附加权利要求中阐述。应当理解可以在不背离本发明的精神的情况下在阐述的程序中进行修饰。实施例实施例1:合成具有序列H-DIETDIET-NH2的肽，HPLC纯化，冻干且溶解于30mM Tris-HCl，pH8.5中。PCR反应在50iil体积中进行，包含50叩、25叩、101^、51^或1叩人基因组0嫩，2.5单位 Taq聚合酶(Roche Applied Science 目录号 11146165001) ,0.4mM 正向引物(aga cagtac age cag cct ca) (SEQ ID No:1)，0.4mM反向引物(gacttc aaa ttt ctg ctc ctc) (SEQID NO:2) ,0.2mM dATP、dCTP、dGTP 和 dCTP，Taq PCR 反应缓冲液(Roche Applied Science目录号11146165001)，具有或不具有H-DIETDIET-NH2-肽。PCR如下执行:于94°C 2分钟，于94°C 10秒、于60°C 30秒和于72°C 30秒的35个循环，和于72°C经过7分钟的最终延伸步骤。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。如图1中可见，2.0mM所公开的肽的添加导致引物/二聚体扩增产物产生的显著减少。实施例2:具有序列H-FD⑶FD⑶-NH2的肽的分析。PCR反应在50 U I体积中进行，包含25ng或 IOng 人基因组 DNA, 2.5 单位 Taq 聚合酶(RocheApplied Science 目录号 11146165001),0.4mM 正向引物(aga cag tacagc cag cct ca) (SEQ ID No:1) ,0.4mM 反向引物(agt atgccc ccgcac agg a) (SEQ ID NO:3),0.2mM dATP、dCTP、dGTP 和 dCTP, Taq PCR 反应缓冲液(Roche Applied Science 目录号 11146165001)，具有或不具有 H-FD⑶FD⑶-NH2-肽。PCR循环条件如下:于94°C 2分钟，于94°C 10秒、于60°C 30秒和于72°C 30秒的35个循环，和于72°C经过7分钟的最终延伸步骤。PCR产 物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。
如图2中可见，3mM H-FD⑶FD⑶-NH2的添加导致减少的引物/ 二聚体产物形成。平行地观察到特异性产物形成的增加。实施例3:具有序列H-DIETDIET-NH2的肽在实时RT-PCR中进行分析。PCR反应在20 yl体积中进行，包含来自 Roche Applied Science (目录号:3261883)的 LightCycler h_G6PDH持家(Houseke印ing)基因试剂盒中可获得的102、103、104、IO5和IO6拷贝的RNA标准，2.4单位Transcriptor和1.6单位FastStart聚合酶，来自LightCycler RNA扩增试剂盒(Amplification Kit) SYBR Green (Roche Applied Science 目录号 12015137001)的反应缓冲液，0.5mM 正向引物(ggg tgc ate ggg tga cct g) (SEQ ID NO:4) ,0.5mM 反向引物(age cac tgt gag gcg gga) (SEQID NO:5)，具有或不具有 ImM H-DIETDIET-NH2-肽。PCR在LightCycler2.0中如下执行:于55°C 10分钟，于95°C 10分钟，于95°C 10秒、于55°C 10秒和于72°C 13秒的45个循环。这个实施例的结果显示于图3中。它举例说明了镁结合肽减少了 RT-PCR中的引物-二聚体形成。扩增曲线(图3a)显示在不存在肽的情况下，形成非特异性产物。由102、103和104拷贝的靶扩增的PCR产物在类似cp值下检测到。扩增曲线可以衍生自形成的几种产物。在图3b中描述的解链曲线分析中，用103和102拷贝的靶RNA可检测到2种解链概况。使用靶的这些稀释，解链曲线显示2种产物。图3c显示在ImM镁结合肽的存在下的扩增曲线。靶稀释的扩增产物在渐增的交叉点时检测到，扩增曲线良好分离。与不含镁结合肽的实验相比较，在图3d的解链曲线分析中同样观察到特异性的增加。从106到103的靶稀释排他地检测到具有特异性产物的Tm的一条解链曲线。在具有102拷贝的靶的样品中，主要产物是特异性产物，观察到极少的引物-二聚体。实施例4:合成具有序列H-DIETDIETDIET-NH2 (SEQ ID NO:8)的肽，HPLC纯化，冻干且溶解于 30mM Tris-HCl，pH8.5 中。PCR 反应在 50 y I 体积中进行，包含 50ng、25ng、10ng、5ng 或Ing 人基因组 DNA, 2.5 单位 Taq 聚合酶(Roche Applied Science 目录号 11146165001),
0.4mM 正向引物(cac ccc gtg ctg ctg acc ga) (SEQ IDNO:6) ,0.4mM 反向引物(agg gaggcg gcc acc aga ag) (SEQ ID NO:7),0.2mM dATP、dCTP、dGTP 和 dCTP, Taq PCR 反应缓冲液(RocheApplied Science 目录号 11146165001)，具有或不具有 H-DIETDIETDIET-NH2 肽，其量如图4中所指出的。PCR如下执行:于94°C 2分钟，于94°C 10秒、于65 V 30秒和于720C 15秒的35个循环，和于72°C经过7分钟的最终延伸步骤。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。图4显示具有序列DIETDIETDIET的镁结合肽的效果。当肽存在于PCR反应混合物中时，引物二聚体产物形成([=0)被抑制，而对特异性产物形成(一)没有影响。实施例5:合成具有序列H-DIET-NH2的肽，HPLC纯化，冻干且溶解于30mM Tris-HCl，pH8.5中。PCR反应在50iil体积中进行，包含50叩、25叩、101^、51^或1叩人基因组0嫩，2.5单位 Taq 聚合酶(RocheApplied Science 目录号 11146165001), 0.4mM 正向引物(aga cagtacagc cag cct ca) (SEQ ID NO:1) , 0.4mM反向引物(gac ttc aaa ttt ctgctc ctc) (SEQID NO:2) ,0.2mM dATP、dCTP、dGTP 和 dCTP，Taq PCR 反应缓冲液(Roche Applied Science目录号11146165001)，具有或不具有H-DIET-NH2-肽。PCR如下执行:于94°C 2分钟，于940C 10秒、于60°C 30秒和于72°C 30秒的35个循环，和于72°C经过7分钟的最终延伸步骤。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。在至少3mM H-DIET-NH2的存在下，观察到引物/ 二聚体形成中的减少 。
权利要求
1.具有不超过30个氨基酸的长度包含二价阳离子结合位点的合成肽，其选自 H-DIET-NH2H-DIETDIET-NH2H-DIETDIETDIET-NH2和 H-FD⑶FD⑶-NH2。
2.组合物，其包含 -耐热的DNA聚合酶 -至少一类二价阳离子，优选地Mg2+ -脱氧核苷酸 -缓冲液 -具有不超过30的长度的合成肽。
3.根据权利要求2的组合物，其进一步包含至少一种核酸化合物。
4.试剂盒，其包含 -根据氨基酸包含二价阳离子结合siH的肽 -耐热的DNA聚合酶。
5.用于扩增特定靶核酸的方法，其包括下述步骤 -提供怀疑包含所述靶核酸的样品 -加入根据权利要求2-3的组合物 -执行核酸扩增反应。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于所述核酸扩增反应是实时监控的聚合酶链反应。
7.根据权利要求5-6的方法，其特征在于对由所述扩增产生的扩增产物实施解链曲线分析。
全文摘要
本发明涉及经由镁螯合的PCR热启动。具体地，本发明涉及具有不超过30个氨基酸的长度包含二价阳离子结合位点的合成肽。根据本发明的此种肽是用于核酸扩增的组合物的部分且提供所谓的热启动效果。
文档编号C12Q1/68GK103172700SQ20131006709
公开日2013年6月26日 申请日期2007年2月23日 优先权日2006年2月27日
发明者W.安肯鲍尔, D.海因德尔, F.劳 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司