专利名称：用于重金属铅的快速检测的核酸荧光探针及其检测方法
技术领域：
本发明涉及的是一种食品安全技术领域的方法，具体是一种采用荧光能量共振现象监测重金属离子作为辅助因子使核酸分子发生水解反应后的结构变化而用于定性定量检测金属离子的方法，适用于有害重金属快速检测研究。
背景技术：
重金属铅污染具有隐蔽性、表聚性与不可逆性等特点，不仅影响农作物的生长发育、产量、品质等，而且通过食物链对人体健康造成严重的危害，尤其是最近一段时间，我国相继发生了几起与重金属铅污染相关的公共卫生事件，让人们对环境铅污染更加关注。铅的传统的检测技术要么费时费力，要么价格昂贵，都难以满足环境与食品安全监控的需求，因此，建立方便、快速的重金属检测技术十分必要。核酸分析方法用于病原检测的已经比较多，但是将其用于环境污染物检 测方面的研究还不多见。本研究中所用的核酸一8-17脱氧核酶(DNAzyme8-17)是一种反式寡核苷酸,一个单链的DNA片段、非蛋白质、非生物体组成成分，具有分子量小，稳定性高，易人工合成，与其靶RNA配对的精确性高，但是需要特定的金属离子作为辅助因子才能发生水解。经研究发现在铅离子是使DNAzymeS-17发生水解的辅助因子，而其他的金属离子则使DNAzymeS-17的双链结构产生折叠，用荧光基团DNAzyme8-17，根据荧光基团的荧光变化来反应核酸的结构变化情况，用来检测铅离子。经过对现有技术的检索发现，戢太云徐鲁荣周培在《核酸荧光探针检测铅离子的研究》(核酸荧光探针检测铅离子的研究，2010年I期)中公开了一种方法，将8-17DNAzyme增加2个〃G-C〃碱基对进行增强热稳定性的结构修饰，并标记上I个荧光基团〃FAM〃和2个荧光猝灭基团"Dabcyl"，设计成双猝灭Pb2+荧光探针.研究了该探针对Cd2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+、Mn2+、Pb2+6种二价金属离子的响应，结果表明探针对Pb2+具有很强的特异性，在探针浓度为2.5X l(T7mol/L时，Pb2+浓度在8.5X 1(T8 7.5X l(T6mol/L范围内和探针的荧光强度呈线性关系，检出限为8.5X10_8mol/L.该探针可用于Pb2+的定性和定量检测。但该探针的稳定性无法达到现有检出要求。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提出一种用于重金属铅的快速检测的核酸荧光探针及其检测方法，将核酸分析法结合发光方法，用于重金属铅的检测。其检测过程简单快速，为是否需要进行后续的精准检测提供依据，为加强我国环境和食品安全控制和监督提供技术支撑。本发明是通过以下技术方案实现的:本发明涉及一种用于重金属铅的快速检测的核酸荧光探针，即DNAzymeS-17荧光探针，其DNA序列由以下:A) 5’ -FAM-GCACTCACTATrAGGAAGA (-Dabcyl) GATG-3’，以及B) 3' -Dabcyl—CGTGAGTGATA (AAGCTGGCCGAGCC) TCTTCTCTAC-5’ 所组成。
本发明涉及上述探针的制取方法，通过用DNA/RNA合成仪分别合成设计好荧光标记位置的DNAzyme8-17底物链和酶链，将酶:底物:水=1:1:78的体积比配成的混合液置于PCR仪中95°C退火15min，非变性凝胶电泳分离纯化，切下双链条带，氯化钠溶解后过ZipTipC18微量层析柱回收双链产物，得到双链荧光探针。本发明涉及一种基于上述探针的重金属铅快速定性检测方法，通过对比探针中加入其它五种金属离子Zn2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+在260nm处的荧光强度，得到所述探针对于铅离子的特异性结果，并通过荧光强度变化实现Pb2+的定性检测。本发明涉及一种基于上述探针的重金属铅快速定量检测方法，通过对探针中加入已知浓度的Pb2+，并且在260nm处扫描荧光强度，从而构建出Pb2+浓度与荧光强度之间的线性关系曲线；随后将待测样品在260nm处扫描出的荧光强度值带入线性关系曲线，从而得到Pb2+的浓度并实现定量检测。本发明原理在于:基于DNAzymeS-17在Pb2+的辅助作用下，会从其水解位点处发生水解反应，导致DNAzyme8-17的双链结构发生改变，而其他的金属离子却不能作为辅助因子促使DNAzyme8-17发生水解反应。
技术效果与现有技术相比，本发明通过改进的核酸荧光探针，不仅不受检测的环境温度必须控制在4°C以内的约束，在室温下就可以进行；并且通过双淬灭设计实现对更低浓度的铅离子的检出。操作简单、快速。
图1为本发明改进探针的结构示意图。图2为本发明不同Pb2+浓度下荧光强度变化趋势示意图。图3为实施例探针的特异性示意图。图4为Pb2+浓度与荧光强度间的线性关系示意图。
具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1本实施例包括以下步骤:1)用DNA/RNA合成仪分别合成设计好荧光标记位置的DNAzyme8-17底物链和酶链，
将酶:底物冰=1:1:78的体积比配成的混合液置于PCR仪中95°C退火15min，非变性凝胶电泳分离纯化，切下双链条带，氯化钠溶解后过ZipTipC18微量层析柱回收双链产物，得到DNA序列如图1所示的双链荧光探针；然后将紫外分光光度计260nm处OD=L 000浓度的，双链探针ImL分别在5°C、10°C、15°C、20°C、25°C、30V六个温度下避光放置3小时。2)在室温下将5.0X 10_7mol/L的探针溶液10 u L、超纯无菌水490 u L均匀混合，扫描探针的背景荧光强度；随后分别取40ii L浓度为5.0X10_6mol/L的镉、锌、镁、铜、锰、铅6种二价金属盐的溶液滴加到5.0X 10_7mol/L的探针溶液10 u L、超纯无菌水450 u L均匀混合的探针溶液中，扫描荧光强度；根据探针中加入不同的金属离子以后的荧光强度变化，确定探针对Pb2+的特异性，从而实现Pb2+的快速定性检测。3)将荧光探针的初始浓度设计为2.5X10_7mol/L、l.25X 10_7mol/L两个浓度梯度，Pb2+的初始浓度设计为 1.0Xl(T5mol/L、7.5X 10_6mol/L、5.0X 10_6mol/L、2.5Xl(T6mol/LU.25X l(T6mol/L、l.0X l(T6mol/L、5.0X l(T7mol/L、2.5 X l(T7mol/L、1.25 X l(T7mol/L、
1.0X 10_7mol/L10个浓度梯度，室温下向10 ii L探针与450 u L超纯水混合液中分别滴加40 u L各浓度的Pb2+溶液，检测各浓度样品对应的荧光强度，并以Pb2+的ii M浓度为横坐标x，260nm处扫描出的荧光强度为纵坐标y，得到如图4所示的线性关系曲线为:I y M以下的曲线为y=118.llx+57.268 ;luM以上的曲线为y=96.68x+82.37 ;由此实现探针对Pb2+定量检测。4)在自来水中添加Pb (NO3) 2标准溶液，配制成浓度为1.5 X l(T7mol/L、
7.5X 10_7mol/L、l.5X10_6mol/L的样品溶液。为了避免自来水中杂质对测定结果的干扰，配制的样品溶液先用0.45 ii m和0.22 ii m的微孔滤膜过滤除去杂质。然后用0.25 ii M探针检测，根据标准曲线计算出对应浓度，通过计算出的Pb2+浓度平均值除以添加浓度，得出添加回收率，从而验证此方法的准确性。同时用火焰原子吸收光谱测定添加回收率，通过与常规检测方法的对比，说明此方法用来检测Pb2+浓度的可行性。荧光核酸探针检测自来水中铅的添加回收率以及FAAS检测自来水中铅的添加回收率如下所示:探针检测结果FAAS检测结果的比较
权利要求
1.一种用于重金属铅的快速检测的核酸荧光探针，其特征在于，其DNA序列由以下:A)5’-FAM-GCACTCACTATrAGGAAGA (-Dabcyl) GATG-3'，以及B)3’ -Dabcyl—CGTGAGTGATA (AAGCTGGCCGAGCC) TCTTCTCTAC-5’ 所组成。
2.一种制备权利要求1所述探针的方法，其特征在于，用DNA/RNA合成仪分别合成设计好荧光标记位置的DNAzyme8-17底物链和酶链，将酶:底物:水=1:1:78的体积比配成的混合液置于PCR仪中95°C退火15min，非变性凝胶电泳分离纯化，切下双链条带，氯化钠溶解后过ZipTipC18微量层析柱回收双链产物，得到双链荧光探针。
3.一种基于权利要求1所述探针的重金属铅快速定性检测方法，通过对比探针中加入其它五种金属离子Zn2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+在260nm处的荧光强度，得到所述探针对于铅离子的特异性结果，并通过荧光强度变化实现Pb2+的定性检测。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的定性检测是指:在室温下将5.0X 10_7mol/L的探针溶液10 u L、超纯无菌水490 u L均匀混合，扫描探针的背景荧光强度；随后分别取40 y L浓度为5.0X 10_6mol/L的镉、锌、镁、铜、锰、铅6种二价金属盐的溶液滴加到5.0X 10_7mol/L的探针溶液10 u L、超纯无菌水450 u L均匀混合的探针溶液中，扫描荧光强度；根据探针中加入不同的金属离子以后的荧光强度变化，确定探针对Pb2+的特异性，从而实现Pb2+的快速定性检测。
5.一种基于权利要求1所述探针的重金属铅快速定量检测方法，通过对探针中加入已知浓度的Pb2+，并且在260nm处扫描荧光强度，从而构建出Pb2+浓度与荧光强度之间检测体系及其线性关系曲线；随后将待测样品在260nm处扫描出的荧光强度值带入线性关系曲线，从而得到Pb2+的浓度并实现定量检测。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的探针对不同浓度的特异性的含有不同浓度的Pb2+离子的检测体系是指:将荧光探针的初始浓度设计为2.5X10_7mOl/L、1.25X10_7mol/L 两个浓度梯度，Pb2+ 的初始浓度设计为 1.0X l(T5mol/L、7.5Xl(T6mol/L、5.0X l(T6mol/L、2.5 X l(T6mol/L、1.25 X l(T6mol/L、1.0 X l(T6mol/L、5.0 X l(T7mol/L、2.5Xl(T7mol/L、l.25X 10_7mol/L、1.0X 10_7mol/L10 个浓度梯度，室温下向 IOy L 探针与450 u L超纯水混合液中分别滴加40 ii L各浓度的Pb2+溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的线性关系曲线是指:以Pb2+的PM浓度为横坐标x，260nm处扫描出的荧光强度为纵坐标y，得到IyM以下的曲线为y =118.llx+57.268 ；luM 以上的曲线为 y=96.68x+82.37。
全文摘要
一种食品安全技术领域的用于重金属铅的快速检测的核酸荧光探针及其检测方法，通过对比探针中加入其它五种金属离子Zn2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+在260nm处的荧光强度，得到所述探针对于铅离子的特异性结果，并通过荧光强度变化实现Pb2+的定性检测；通过对探针中加入已知浓度的Pb2+，并且在260nm处扫描荧光强度，从而构建出Pb2+浓度与荧光强度之间检测体系及其线性关系曲线；随后将待测样品在260nm处扫描出的荧光强度值带入线性关系曲线，从而得到Pb2+的浓度并实现定量检测。本发明检测过程简单快速，为是否需要进行后续的精准检测提供依据，为加强我国环境和食品安全控制和监督提供技术支撑。
文档编号C12N15/11GK103160504SQ20131006618
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者周培, 邢海波, 戢太云, 詹学佳 申请人:上海交通大学