专利名称：Dna片段及其在制备雄性不育辣椒中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种DNA片段及其在制备雄性不育辣椒中的应用。
背景技术：
辣椒(Capsicumannuum L.)为爺科(Solanaceae)辣椒属(Capsicum)草本植物，是一种重要的世界性蔬菜作物，具有明显的杂种优势。从遗传角度可将雄性不育划分为两大类，一类是细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS),育性由细胞质和细胞核基因共同控制；另一类是细胞核雄性不育(nuclear male sterility, NMS),育性仅由细胞核基因控制，不受细胞质影响。对辣椒雄性不育形态学研究来看，雄性不育植株的花药出现干瘪现象，花药中的花粉粒数量急剧减小。对辣椒小孢子败育机理进行的细胞学研究认为，辣椒雄性不育均直接或间接与绒毡层的发育相关。VIGS是指携带植物功能基因cDNA的病毒，在侵染植物体后可诱导植物发生基因沉默而出现表型变异，从而可以通过植物表型或生理指标上的变化反映该基因的功能。烟草脆裂病毒(TRV)可有效的把沉默信号传递到植物的生长点，为研究植物发育器官中的基因功能提供了可靠的途径。TRV可以有力地蔓延整个植物组织，包括分生组织，而且侵染的全部症状与其它病毒相比更加温和。TRV是一种双链病毒，由RNAl和RNA2两条单链RNA组成，RNAl编码RNA依赖的RNA聚合酶，RNA2编码外壳蛋白，目的基因通常被插入到RNA2结构中。PI基因属于MADS-box基因家族中的AP3/PI亚家族成员，为ABC花发育模型理论中的B功能基因。在花发育的ABC模型理论中，B类基因控制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育，属于MADS-box基因家族，编码转录因子，其功能丧失会使花瓣转变为萼片，雄蕊转变为心皮。拟南芥等植物中控制花瓣和雄蕊发育的B类基因是APETALA3 (AP3)和PISTILLATA(PI)。
发明内容
本发明的目的是提供一种DNA片段及其在制备雄性不育辣椒中的应用。本发明提供的一种DNA片段，如序列表的序列2自5’末端第729至924位核苷酸所示。该DNA片段是从辣椒品种“伏地尖”中发现的。含有所述DNA片段的重组载体或重组菌均属于本发明的保护范围。所述重组载体为将所述DNA片段插入表达载体的多克隆位点得到的重组质粒。所述表达载体具体可为质粒PTRV2。所述重组载体具体可为在质粒pTRV2的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入所述DNA片段得到的重组质粒。所述DNA片段编码的RNA片段也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种试剂盒，由重组质粒pTRV2-pPPI和质粒pTRVl组成。所述重组质粒pTRV2-pPPI可为将所述DNA片段插入质粒pTRV2的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组质粒pTRV2-pPPI具体可为在质粒pTRV2的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入所述DNA片段得到的重组质粒。所述试剂盒的功能为如下(a)或(b):(a)制备雄性不育辣椒；(b)抑制PPI基因表达；所述PPI基因为编码PPI蛋白的DNA分子；所述PPI蛋白为如下(c)或(d): (c)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的由序列I衍生的蛋白质。所述PPI基因具体可为如下I)至4)中任一所述的DNA分子:I)编码区如序列表中序列2自5’端第81至728位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物雄性育性相关蛋白的DNA分子。所述严格条件为在0.1 X SSPE (或0.1XSSC)、0.1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下(e)或(f):(e)制备雄性不育辣椒；(f)抑制所述PPI基因表达。本发明还保护一种培育雄性不育辣椒的方法，是在目的辣椒中导入所述重组质粒pTRV2-pPPI和质粒pTRVl，得到雄性不育辣椒。所述目的辣椒具体可为辣椒品种“伏地尖”。所述雄性不育具体体现为 花药发育变小和/或花药干瘪。本发明还保护一种抑制辣椒的所述PPI基因表达的方法，是在辣椒中导入所述重组质粒pTRV2-pPPI和质粒pTRVl，从而抑制辣椒中的所述PPI基因表达。所述辣椒具体可为辣椒品种“伏地尖”。本发明发现了一种特异DNA片段，本发明还保护将所述DNA片段插入质粒pTRV2的多克隆位点得到的重组质粒。本发明发现将重组质粒和质粒pTRVl导入辣椒后可以高效抑制辣椒中PPI基因的表达，进而得到花药干瘪的雄性不育辣椒。应用本发明提供的方法制备雄性不育辣椒，大大缩短了育种年限，节省了育种经费。本发明提供的DNA片段及其应用方法为辣椒雄性不育植株的获得提供了新方法，为辣椒育种的研究提供了新思路，同时为其它园艺作物育性研究提供了重要的技术和理论支持。本发明为辣椒新品种的选育及实现农民种植辣椒经济效益的提高提供了有力的途径，具有重大应用前景。
图1为质粒pTRV2的结构示意图。图2为重组质粒pTRV2_pPPI的结构示意图。图3为辣椒植株花的照片。图4为辣椒花粉粒的I个视野的部分截图。图5为PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例中，酶切所用的各种限制性内切酶和酶联反应所用的T4连接酶均购自MBIfermentas公司，反转录用的M-MLV反转录酶购自TAKARA公司，RNA提取试剂盒购自美国Promega 公司。烟草脆裂病毒介导的基因沉默需要双价病毒载体，即质粒pTRVl和质粒pTRV2，质粒pTRVl携带烟草脆裂病毒RNAl的编码基因，质粒pTRV2携带烟草脆裂病毒RNA2的编码基因，使用时将目的片段插入RNA2的编码基因中。辣椒品种“伏地尖”(即文献中的伏地尖辣椒):公众可从中国农业大学获得；参考文献:王仁祥、沈美娟，伏地尖辣椒的种性研究，湖南农业大学学报1993年03期，270-275。根癌农杆菌GV3101:公众可从中国农业大学获得；参考文献:Delay ofpostharvest ripening and senescence of tomato fruit throughvirus—inducedLeACS2gene silencing, Postharvest Biology and Technology42 (2006)8 - 15。质粒pTRVl (又称载体pTRVl):公众可从中国农业大学获得；参考文献:YuleLiu,Michael Schiff and S.P.Dinesh-Kumar, Virus-1nduced gene silencing intomato, The Plant Journal (2002)31(6)，777-786。质粒pTRV2 (又称载体pTRV2，结构示意图见图1):公众可从中国农业大学获得；参考文献:Yule Liu, Michael Schiff and S.P.Dinesh-Kumar, Virus-1nduced genesilencing in tomato, The Plant Journal(2002)31(6)，777-786。实施例1、用于干扰辣椒PPI基因表达的特异DNA片段的发现辣椒的PPI基因属于MADS-bo`x基因家族中控制花器官发育的B类基因，主要控制花器官发育中花瓣和雄蕊的发育，是花器官正常发育过程中的重要基因。1、2012年春天在中国农业大学上庄实验站大棚内常规种植“伏地尖”在开花期取花瓣已开始变白的花蕾，剥取花药立即用液氮冷冻并在-70°C保存，取花药，按照美国Promega 公司 SV Total RNA Isolation System kit 操作说明书提取总 RNA,用 M-MLV 反转录酶进行反转录，获得cDNA。2、根据SSH技术构建的辣椒育性恢复基因诱导表达的消减cDNA，从中筛选得到的一个EST片段，与拟南芥AP3基因有很高的同源性，进一步利用RACE技术获得了该基因全长，命名为PPI基因。辣椒的PPI基因如序列表的序列2所不，其开放阅读框为序列表的序列2自5’末端第81至728位核苷酸，编码序列表的序列I所示的蛋白质。3、根据辣椒的PPI基因序列，筛选获得了一个可以干扰辣椒PPI基因表达的特异DNA片段，如序列表的序列2自5’末端第729至924位核苷酸所示。实施例2、干扰载体的构建1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。2、以步骤I合成的双链DNA分子为模板，用V-PPIs和V-PPIas组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。V-PPIs ( h游引物):5’ -GGAATTC CTGCATTATTAATTAAIT-3’(下划线标注 EcoR I识别序列)；
V-PPIas (下游引物):5’ -CGGGATCC AGTCAGTACTCCATCTA-3’ (下滑线标注 BamH I识别序列)。PCR扩增的反应条件:94°C预变性5分钟；94°C 30秒、45°C 30秒、72°C 40秒，27个循环；72°C延伸5分钟。3、用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。4、用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切质粒pTRV2，回收载体骨架(约9650bp)。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pTRV2_pPPI (结构示意图见图2)。根据测序结果对重组质粒pTRV2-pPPI进行结构描述如下:在质粒pTRV2的EcoR I和BamH I酶切位点之间插入了序列表的序列2自5’末端第729至924位核苷酸所示的DNA分子。实施例3、应用重组质粒pTRV2_pPPI制备雄性不育植株一、重组农杆菌的制备1、将实施例2构建的重组质粒pTRV2_pPPI转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，得到重组农杆菌甲。2、将质粒pTRVl转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，得到重组农杆菌乙。
3、将质粒pTRV2转化根癌农杆菌GV3101感受态细胞，得到重组农杆菌丙。二、转基因植株的获得1、将辣椒品种“伏地尖”的种子进行高温处理(先40°C恒温烘箱中放置2天，然后75°C恒温烘箱中放置I天；目的是预防种子携带病毒)，然后催芽(先用55°C蒸馏水浸种15分钟，然后用25-30°C蒸馏水浸泡24小时，然后将种子放入带有湿润滤纸的培养皿中，25-30°C培养，直至种子裂嘴)。2、将完成步骤I的种子播种于128孔穴盘中(基质为等质量混合的草炭和蛭石)，播种后覆蛭石于表面，浇水，正常培养至两片真叶期(培养条件:白天温度为24°C，夜间温度为16°C，每天光照时间16h)。3、菌悬液甲的制备①将重组农杆菌甲接种至IOml LB培养基(含50 u g/mL卡那霉素和25 u g/mL利福平)，28°C、200rpm振荡培养过夜。②取20ml步骤①得到的菌液，接种至100ml LB培养基(含10mM2_吗啉乙磺酸、20mM乙酰丁香酮、50 ii g/mL卡那霉素和25 y g/mL利福平)，28°C、200rpm振荡培养过夜。③取步骤②得到的菌液，离心收集菌体，然后用侵染液(含10mM2_吗啉乙磺酸、200mM乙酰丁香酮、IOmM MgCl 2的蒸馏水；用稀盐酸调节pH值到5.6)重悬菌体，得到OD600nm=L 0-2.0的菌悬液甲。4、菌悬液乙的制备用重组农杆菌乙代替重组农杆菌甲，其它同步骤3，得到OD6tltol=L 0-2.0的菌悬液乙。5、将菌悬液甲和菌悬液乙等体积混合,室温暗培养4-6小时。6、用注射器吸取步骤5得到的混合液，对步骤I得到的辣椒幼苗进行如下注射:在叶片背面叶脉之间注射约I平方厘米的注射水溃斑，两片子叶均注射。三、转空载体植株的获得用重组农杆菌丙代替重组农杆菌甲，其它同步骤二。四、花粉育性鉴定将20株完成步骤二的注射的植株(转基因植株)、5株完成步骤三的注射的植株(转空载体植株)和5株辣椒品种“伏地尖”分别进行如下鉴定，1、将辣椒植株转移到培养室，22°C培养50天(16小时光照/8小时黑暗)，转空载体植株的所有植株的花均形态正常。辣椒品种“伏地尖”的所有植株的花均形态正常。转空载体植株的所有植株的花均形态正常。20株转基因植株中，7株花呈现明显的雄性不育表型，其它13株形态正常，即干扰效率为35%。花的照片见图3 (A为辣椒品种“伏地尖”的花，B为转基因植株的雄性不育表型的花)。2、花粉采集取充分成熟将要开花的花蕾，剥除花被片等，取出花药。3、镜检将花药置于载玻片上，加I滴蒸馏水，用镊子将花药充分捣碎，使花粉粒释放，再加2滴碘-碘化钾溶液(将3g碘化钾和Ig碘溶于IOOml蒸馏水)，盖上盖玻片，于放大倍数40X显微镜下观察。每个植株取10视野取平均值，统计形态正常的花粉的数量，以数量表示花粉的育性。辣椒品种“伏地尖 ”中，第一株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为19个(十个视野的平均值)，第二 株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为15个(十个视野的平均值)，第三株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为17个(十个视野的平均值)，第四株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为16个(十个视野的平均值)，第五株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为20个(十个视野的平均值)。转空载体植株中，第一株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为15个(十个视野的平均值)，第二株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为17个(十个视野的平均值)，第三株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为18个(十个视野的平均值)，第四株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为13个(十个视野的平均值)，第五株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为17个(十个视野的平均值)。显示雄性不育表型的7株转基因植株中，第一株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为0个(十个视野的平均值)，第二株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为0个(十个视野的平均值)，第三株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为0个(十个视野的平均值)，第四株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为0个(十个视野的平均值)，第五株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为0个(十个视野的平均值)，第六株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为0个(十个视野的平均值)。第七株植株每个视野中正常发育的花粉粒为平均值为0个(十个视野的平均值)。显示雄性不育表型的转基因植株可以观察到视野中有絮状物，即发育不正常的花粉壁碎屑。—株辣椒品种“伏地尖”的I个视野的部分截图见图4A，一株转空载体植株的I个视野的部分截图见图4B，一株显示雄性不育表型的转基因植株的I个视野的部分截图见图4C。
3、分子鉴定用Promega 公司 SV Total RNA Isolation System kit 操作说明书提取步骤 2 的转基因植株的干瘪花药或步骤2得到的转空载体植株的正常花药的RNA，反转录为cDNA。以cDNA为模板，进行PCR鉴定(内参基因为辣椒Actin基因)。鉴定PPI基因的引物对由PPI s和PPI as组成，鉴定Actin基因的引物对由Acts和Act as组成。PPI s:5’ -TACTACGATGAGTGATATACTAGAT-3’ ；PPI as:5’ -AGTCAGTACTCCATCTATGTATTAG-3’。Act s:5’ -ATGGCATCATACTTTCTACAAT-3，；Act as:5， -CATCAGGTTATCAGTTAGGTCA-3，。PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图5。图5中:M =Marker ；1:转基因植株的干瘪花药；CK:转空载体植株的正常花药。结果表明:在转基因植株的干瘪花药和转空载体植株的正常花药中，看家基因Actin的表达量是一致的；与转空载体植株的正常花药相比，转基因植株的干瘪花药中PPI基因的表达量显著降低。结果表明，重组质粒pTRV2-pPPI确实抑制了辣椒植株中PPI基因的表达，并通过抑制PPI基 因的表达得到了雄性不育植株。
权利要求
1.一种DNA片段，如序列表的序列2自5’末端第729至924位核苷酸所示。
2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体或重组菌。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为将权利要求1所述DNA片段插入表达载体的多克隆位点得到的重组质粒。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于:所述表达载体为质粒PTRV2。
5.权利要求1所述DNA片段编码的RNA片段。
6.一种试剂盒，由权利要求4所述重组载体和质粒pTRVl组成。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒的功能为如下(a)或(b):(a)制备雄性不育辣椒；(b)抑制PPI基因表达； 所述PPI基因为编码PPI蛋白的DNA分子；所述PPI蛋白为如下(c)或(d): (c)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； Cd)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的由序列I衍生的蛋白质。
8.权利要求6所述试剂盒的应用，为如下(e)或(f):(e)制备雄性不育辣椒；(f)抑制PPI基因表达； 所述PPI基因为编码PPI蛋白的DNA分子；所述PPI蛋白为如下(c)或(d): (c)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； Cd)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的由序列I衍生的蛋白质。
9.一种培育雄性不育辣椒的方法，是在目的辣椒中导入权利要求4所述重组载体和质粒pTRVl，得到雄性不育辣椒。
10.一种抑制辣椒中的PPI基因表达的方法，是在辣椒中导入权利要求4所述重组载体和质粒pTRVl，从而抑制辣椒中的PPI基因表达； 所述PPI基因为编码PPI蛋白的DNA分子；所述PPI蛋白为如下(c)或(d): (c)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； Cd)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物雄性育性相关的由序列I衍生的蛋白质。
全文摘要
本发明公开了一种DNA片段及其在制备雄性不育辣椒中的应用。本发明提供的一种DNA片段，如序列表的序列2自5’末端第729至924位核苷酸所示。本发明还保护将所述DNA片段插入质粒pTRV2的多克隆位点得到的重组质粒。本发明发现将重组质粒和质粒pTRV1导入辣椒后可以高效抑制辣椒中PPI基因的表达，进而得到花药干瘪的雄性不育辣椒。应用本发明提供的方法制备雄性不育辣椒，大大缩短了育种年限，节省了育种经费。本发明为辣椒雄性不育植株的获得提供了新方法，为辣椒育种的研究提供了新思路，同时为其它园艺作物育性研究提供了重要的技术和理论支持，具有重大应用前景。
文档编号C12N15/113GK103160508SQ201310066090
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者沈火林, 马宁, 刘辰 申请人:中国农业大学