专利名称：一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法
技术领域：
本发明涉及多药耐药相关microRNA的筛选，具体地说，是一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法。
背景技术：
对化疗药物产生耐药性是当今肿瘤治疗的一大难题。肿瘤的多药耐药(mult1-drug resistance, MDR)是指肿瘤细胞长期接触某一化疗药物,不仅对此种化疗药物产生耐药性,而且对其他结构和功能不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性的现象。自从化疗药物开始应用于肿瘤的治疗后，就一直伴随着多药耐药的发生，因此怎样逆转肿瘤多药耐药一直以来都被认为是与临床结合最为密切的研究方向。近年来，随着分子生物学和遗传学的发展，复杂的肿瘤耐药机制研究已由单纯的病理生理学转向分子病理学范畴，耐药基因的表达增加已经被肯 定与肿瘤的耐药性有明显的关系。研究表明ABCBl (MDRl)基因编码的P糖蛋白(P-glucoprotein, P-gp)在多药耐药中起着主要作用，主要作用机理是能量依赖性地将化疗药物转运出肿瘤细胞，减少药物在细胞内的蓄积，导致MDR。P-gp是一种分子量为170kd的跨膜糖蛋白，由1280个氨基酸残基组成，具有12个跨膜区和2个细胞内ATP连结点。当肿瘤细胞长期接触抗癌药物时，ABCBl基因被诱导扩增，P-gp被大量表达，当肿瘤药物再次与P-gp结合时，其ATP结合点上连接的ATP水解后释放的能量能将抗癌药物转移到细胞外，使细胞内蓄积药物减少，减少作用靶点部位的药物浓度，导致化学治疗的效果下降乃至消失。人ABCBl基因位于7号染色体的7q21.1，含有28个外显子，其cDNA全长4.5kb，含有一个开放阅读框架(ORF)，基因启动子包含:CAAT盒的同感序列、GC盒样序列、Y-box (反向CCAAT元件)、HSE (热休克元件)、P53元件、AP-1元件、TCF元件、类固醇异种生物受体元件、C/EBP元件和起始元件。此外,还含有增强子等元件与hmdrl基因的组织特异性表达有关，但无TATA盒。ABCBl表达的调控主要在转录和转录后水平，与大多数细胞和病毒无TATA盒启动子的基因调控相似，与ABCBl转录起始序列GC盒、Y盒、CCAAT盒、HSE和AP-1等结合的转录。非编码小RNA (microRNA，miRNA)是近年来新发现的一类非编码小分子RNA，长度为22-28个核苷酸，广泛存在于真核生物细胞内，是最大的基因家族之一，约占整个基因组的1%-4%。目前，人类基因组中确认的miRNA约500个，至少有200多种与癌症的发生有关，不少miRNA可能扮演着癌基因和抑癌基因的角色。由于miRNA作用靶点是基因的3’ UTR区域，因此基因的3’ UTR的改变程度能够直接指示该基因受到miRNA的调控程度。有研究发现，不同miRNA对多药耐药基因3’ UTR区域的影响也不同，而多药耐药基因3’ UTR区域mRNA的变化又直接影响该基因的改变程度，最终该耐药基因的变化直接影响耐药性。因此通过修复microRNAs的表达，改变耐药基因的表达，已成为通过基因调控逆转耐药的重要方向之一。然而，由于microRNAs的发现始于本世纪初,而microRNAs与MDR的研究更是尚处于起步阶段，一些问题仍限制其应用和发展。例如:如何准确预测调控靶基因的microRNAs，如何提高microRNAs检测的灵敏度和特异性等，这对于基因调控逆转耐药的药物研发具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种质粒载体。本发明的再一的目的是，提供一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法。本发明的另一的目的是，提供上述microRNA的用途。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
一种质粒载体，所述的质粒载体是在pmirGLO Dual-Luciferase-promoter质粒载体的第6832-7349bp区段内插入了人ABCBl基因的Y UTR序列。优选的，所述的人ABCBl基因的3' UTR序列插入在pmirGLODual-Luciferase-promoter质粒载体的sacl和xhol限制性酶切位点之间。所述的人ABCBl基因的3' UTR序列包含下述核苷酸序列:
a)如SEQID N0.3所示的核苷酸序列；和/或
b)与SEQID N0.3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。为实现上述第二个目的 ，本发明采取的技术方案是:
一种利用双荧光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法，它至少设置以下实验组:
a)将待测试microRNA和如上任一所述的质粒载体共转染多药耐药宿主细胞；
b)将待测试microRNA转染多药耐药宿主细胞，作为对照，
检测并比较a)组相对于b)组的双荧光素酶活性变化，确定待测试miCToRNA是否为多药耐药相关microRNA。上述方法还可以包括以下实验组:c)多药耐药宿主细胞组作为空白对照，和/或d)待测试microRNA和如上任一所述的质粒载体的突变型质粒共转染多药耐药宿主细胞。所述的多药耐药宿主细胞是人肠癌多药耐药细胞株HCT116/L-0HP。为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
microRNA在制备调控人ABCBl基因3 ' UTR序列表达的药物中的用途，所述的microRNA选自:a)如SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或b)如SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。microRNA在制备抑制人P糖蛋白表达的药物中的用途,所述的microRNA选自:a)如SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或b)如SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。microRNA在制备逆转多药耐药的药物中的用途,所述的microRNA选自:a)如SEQID N0.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或10如SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本发明优点在于:
1、本发明提供了一种利用双突光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法，该方法是利用构建的含有人ABCBl基因3’UTR序列和双荧光报告基因的质粒载体，将该载体连同待测试microRNA共转染多药耐药细胞株，观察双荧光报告基因的表达情况，从而确定待测试microRNA对人ABCBl基因3’UTR序列的作用，用于筛选调控人ABCBl基因3’UTR表达的microRNA。使用该方法预测调控人ABCBl基因3’ UTR表达的microRNA具有快速、高效、简单易行的优点，为提 高microRNA检测的灵敏度和特异性，以及研发和检测通过基因调控逆转多药耐药的药物开辟了新的途径；
2、本发明提供了能够调控人ABCBl基因3'UTR序列表达的两种microRNA，可用于制备逆转多药耐药的药物。
图1是PMD18T载体图谱。图2为ABCBl基因3’UTR序列的克隆其PCR产物的电泳图谱，其中Maker为DL2000,1 和 2 均为 ABCBl 基因的 3’ UTR 片段(379bp)。图3是pmirGLO Dual-Luciferase-promoter双突光报告基因载体图谱。图4 为 pmirGL0-ABCBl-3’ UTR-promoter 重组质粒的 seal 和 xhol 双酶切产物电泳图谱，其中 Maker 为 DL10000，1、2、3 均为 pmirGLO-ABCBl-3’ UTR-promoter 双酶切产物。图5 为 pmirGL0-ABCBl-3’ UTR-promoter 重组质粒 3’ UTR 片段测序结果与 NCBI 公布的ABCBl基因的3’ UTR序列进行Blast分析的序列比对图。图6是在细胞中检测microRNA minics对于ABCBl基因3’ UTR影响获得的双荧光素酶活性柱状图。每组中数字含义为:1.转染microRNA mimics的对照组,2.hsa_miR-200amimics/ 质粒组,3.hsa-miR-497 mimics/ 质粒组,4.hsa_miR-200c mimics/ 质粒组。图7是筛选出的对于ABCBl基因有抑制作用的microRNA minics的westernblot杂交图谱。图中，I为空白对照组，2为转染microRNA mimics的对照组，3为hsa-miR-497mimics 组,4 为 hsa_miR-200c mimics 组。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例1构建含ABCBl基因3’ UTR序列和报告基因的重组T载体 一、材料
1.质粒
PMD18T载体质粒购自美国Promega公司，其载体图谱如图1所示。2.主要试剂
限制性内切酶seal和xhol，以及DNA Ligation Kit (DNA连接试剂盒)购自TaKaRa公司。DL2000 maker购自上海MajorBio公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自KenReal公司。质粒提取试剂盒和DNA片段回收试剂盒购自Tiangen公司。二、方法与结果1.血样采集和基因组DNA抽提
米集健康志愿者外周血5mL,置于EDTA抗凝的玻璃试管,贮存于-40°C冰箱备用。按照标准苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，置于4°C冰箱备用。2.ABCBl 基因的 PCR 扩增
引物设计:根据人ABCBl基因的3’UTR序列(NCBI的gene ID: 5243)设计两端引物:引物I和引物2。引物1为上游5’端引物，其中包含27个ABCBl基因的3’UTR序列互补碱基，一个seal识别位点，6个保护碱基；引物2为下游3’端引物，其中包含28个ABCBI基因的3’ UTR序列互补碱基，一个xhol识别位点，6个保护碱基。具体引物序列如下:
权利要求
1.一种质粒载体，其特征在于，所述的质粒载体是在pmirGLODual-Luciferase-promoter质粒载体的第6832_7349bp区段内插入了人ABCBl基因的3' UTR序列。
2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述的人ABCBl基因的3'UTR序列插入在pmirGLO Dual-Luciferase-promoter质粒载体的sacl和xhol限制性酶切位点之间。
3.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述的人ABCBl基因的3'UTR序列包含下述核苷酸序列: a)如SEQID N0.3所示的核苷酸序列；和/或 b)与SEQID N0.3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
4.一种利用双突光素酶报告基因筛选多药耐药相关microRNA的方法,其特征在于,它至少设置以下实验组: a)将待测试microRNA和权利要求1_3任一所述的质粒载体共转染多药耐药宿主细胞； b)将待测试microRNA转染多药耐药宿主细胞，作为对照， 检测并比较a)组相对于b)组的双荧光素酶活性变化，确定待测试miCToRNA是否为多药耐药相关microRNA。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，它还包括以下实验组:c)多药耐药宿主细胞组作为空白对照，和/或d)待测试microRNA和权利要求1_3任一所述的质粒载体的突变型质粒共转染多药耐药宿主细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的多药耐药宿主细胞是人肠癌多药耐药细胞株HCT116/L-0HP。
7.microRNA在制备调控人ABCBl基因3 ^ UTR序列表达的药物中的用途，其特征在于，所述的microRNA选自: a)如SEQID N0.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或 b)如SEQID N0.8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
8.microRNA在制备抑制人P糖蛋白表达的药物中的用途，其特征在于，所述的microRNA 选自: a)如SEQID N0.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或 b)如SEQID N0.8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
9.microRNA在制备逆转多药耐药的药物中的用途,其特征在于，所述的microRNA选自: a)如SEQID N0.5所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或 b)如SEQID N0.8所示的核苷酸序列，或与SEQ ID N0.8所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及一种质粒载体，所述的质粒载体包含人ABCB1基因的3′UTR序列和双荧光素酶基因。本发明还涉及一种筛选多药耐药相关microRNA的方法，它是将待测试microRNA和如上所述的质粒载体共转染多药耐药宿主细胞，以转染microRNA的多药耐药宿主细胞为对照，观测双荧光素酶活性的变化，确定待测试microRNA是否为多药耐药相关microRNA。本发明还涉及一种microRNA在制备逆转多药耐药的药物中的用途。使用本发明的方法筛选多药耐药相关microRNA具有快速、高效、简单易行的优点，为提高microRNA检测的灵敏度和特异性，以及研发和检测通过基因调控逆转多药耐药的药物开辟了新的途径。
文档编号C12N15/63GK103173480SQ201310065888
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者隋华, 李琦, 朱惠蓉, 周利红, 刘宣, 季青, 靳宝辉, 潘树芳, 叶乃菁, 宋大迁, 范忠泽 申请人:上海中医药大学附属曙光医院, 上海中医药大学附属普陀医院