专利名称：细胞粘附分子5单克隆抗体、制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种单克隆抗体及其制备方法，具体地说是细胞抗粘附分子5(ICAM5)单克隆抗体及其制备方法。
背景技术：
细胞粘附分子5 (Intercellularadhesionmolecule5, ICAM5)是人 ICAM5 基因编码蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员中的ICAM家族成员。所有ICAM蛋白是I型跨膜糖蛋白，拥有2-9个免疫球蛋白C2区样结构域，可结合白细胞整合相关抗原(LFA-1)。ICAMl在大脑中的非神经细胞表面表达，而ICAM5只在神经细胞表面表达，具有神经元之间同种粘附和神经元与淋巴细胞之间异种粘附两种粘附活性。ICAM5可表达于神经细胞胞体和突起表面，通过与LFA-1结合发挥粘附依赖性功能。ICAM5可通过相邻神经元单体之间的相互作用，诱导神经突起形成；同时，可通过粘附依赖性作用激活淋巴细胞，参与中枢神经免疫反应。因此，ICAM5对于中枢神经发育，突触传递及免疫等具有重要作用；ICAM5也因此成为开展中枢神经发育、功能及免疫机制研究的重要靶位。然而，目前市场上销售的商品化的ICAM5抗体均为多克隆抗体，活性较低且试验结果很不稳定，直接影响到实验研究的深入开展。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种能与细胞粘附分子5 (ICAM5)特异性结合的单克隆抗体。本发明的第二目的在于提供生产上述单克隆抗体的杂交瘤细胞系。本发明的第三目的在于提供利用上述细胞株制备抗体的制备方法。本发明的再一目的 在于提供制备所述单克隆抗体的抗原多肽。为了达成上述的发明目的，本发明采用如下具体技术方案:一种杂交瘤细胞株，其于2012年2月17日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编:100101，保藏编号为CGMCCN0.5798。细胞粘附分子5单克隆抗体，所述单克隆抗体由所述的保藏编号为CGMCCN0.5798的杂交瘤细胞株产生的。所述单克隆抗体重链可变区序列如序列表SEQIDN0.2所示，轻链可变区序列SEQIDN0.3 所示。一种用于制备细胞粘附分子5单克隆抗体的抗原多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDN0.1 所示。所述的单克隆抗体在制备检测细胞粘附因子5试剂盒中的应用。所述试剂盒组成如下:ICM5单克隆抗体I支，包装100μ 1，抗体来源:小鼠亚型IgGl，大小:约140KD ；免疫荧光染色常用试剂I份；和/或
蛋白印迹试验常用试剂I份。利用所述细胞株制备所述的单克隆抗体的方法，所述方法步骤如下:(I)扩增保藏编号为CGMCCN0.5798的杂交瘤细胞株；(2)腹腔注射动物，回收腹水；(3)从腹水中分离得到抗细胞粘附因子5单克隆抗体。本发明的有益效果如下:1.本发明提供ICAM5单克隆抗体，可用于针对ICAM5抗原的免疫荧光和蛋白印迹(Westernblotting)检测以及科学研究等用途,经试验验证在人及小鼠神经细胞表面有很高的表达并且表达稳定。2.抗体特异性强，并且效价高，ELISA检测效价可达1:400000，因此试验中ICAM5抗体使用浓度较低，抗体用量少。2.1CAM5抗原位于神经细胞胞体及神经纤维表面，因此免疫荧光染色可清晰展示神经细胞胞体及神经纤维结构。
图1为小鼠融合前血清ELISA检测结果曲线图(横坐标为表I所示的9个不同的效价梯度，纵坐标为0D450值)；图2为免疫荧光显示3株ICAM5单克隆抗体均可在小鼠神经细胞表面表达(三株ICAM5抗体免疫荧光(C y3标记二抗)在小鼠神经细胞胞体和突起显著表达，DAPI染细胞核为蓝色(100X油镜下))；图3为Westernblotting显示3株ICAM5单克隆抗体均可在人脑组织蛋白表达，分子量为140KD，β -actin为阳性对照。
具体实施例方式实施例1ICAM5单克隆抗体制备1.多肽抗原合成从人ICAM5蛋白序列中细胞粘附分子I第二免疫球蛋白样区域(Ig2-1CAM-l-like, ICAMl-⑶54)间断选择6段氨基酸序列进行多肽合成(第30-220位氨基酸)。多肽合成由艾比玛特生物医药(上海)有限公司完成，6段多肽序列如下:RCARRT\LQARARGLIRT\FQRGLRWLARQL\VRASLTLTLLRTSLR\RNGTQRLQPRVAFV\ERRRSFAGEPPR,分子量 34KD，纯度 >90%。合成的多肽序列如SEQ ID N0.1所示:RCARRTLQARARGLIRTFQRGLRWLARQLVRASLTLTLLRTSLRRNGTQRLQPRVAFVERRRSFAGEPPR2.动物免疫将合成的多肽抗原免疫鼠龄为8 12周的雌性BALB/C健康小鼠3只。采取小鼠快速免疫方式。初次免疫:抗原50ug/只，加福氏完全佐剂(抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状)皮下多点注射，体积1.5ml。
第二次免疫:初次免疫后间隔3周行第二次免疫，剂量途径同上，加福氏不完全佐剂。第三次免疫:第二次免疫后间隔3周行第三次免疫，剂量同上，不加佐剂，腹腔注射，7天后采血测其效价，检测免疫效果(见表I和图1)。1小鼠融合前血清ELISA检测数据表
权利要求
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No. 5798。
2.细胞粘附分子5单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求I所述的保藏编号为CGMCC No. 5798的杂交瘤细胞株产生的。
3.如权利要求2所述的细胞粘附分子5单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体重链可变区序列如序列表SEQ ID No. 2所示，轻链可变区序列SEQ ID No. 3所示。
4.一种用于制备细胞粘附分子5单克隆抗体的抗原多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
5.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测细胞粘附因子5试剂盒中的应用。
6.利用权利要求I所述细胞株制备权利要求2所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，所述方法步骤如下 ⑴扩增保藏编号为CGMCC No. 5798的杂交瘤细胞株； ⑵腹腔注射动物，回收腹水； ⑶从腹水中分离得到抗细胞粘附因子5单克隆抗体。
全文摘要
本发明公开了细胞粘附分子5(ICAM5)单克隆抗体、制备方法及应用，其杂交瘤细胞株保藏编号为CGMCC No.5798。本发明提供ICAM5单克隆抗体，可用于针对ICAM5抗原的免疫荧光和蛋白印迹(Western blotting)等科学研究，经试验验证在人及小鼠神经细胞表面有很高的表达并且表达稳定。抗体特异性强，并且效价高，ELISA检测效价可达1400000，因此试验中ICAM5抗体使用浓度较低，抗体用量少。ICAM5抗原位于神经细胞胞体及神经纤维表面，因此免疫荧光染色可清晰展示神经细胞胞体及神经纤维结构。
文档编号C12R1/91GK103255108SQ20131006546
公开日2013年8月21日 申请日期2013年3月1日 优先权日2012年3月1日
发明者陈德喜, 张玉林, 李宁, 石英, 宋凤丽, 丁谓, 乔录新, 侯庆生, 徐树莹 申请人:首都医科大学附属北京佑安医院