专利名称：微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌和最小杀菌浓度的方法
技术领域：
本发明属于一种测定微量抗菌物质最小抑菌浓度和最小杀菌浓度，特别是适用于阳离子抗菌肽测定的方法。
背景技术：
抗菌肽是动物体内一大类具有抗菌活性和免疫功能的生物活性物质。抗菌肽具有广谱抗菌活性和丰富的作用机制。不仅和传统抗菌活性物质一样，具有胞内作用机制，包括:与核酸物质结合，阻断DNA复制、RNA合成；影响蛋白质合成；抑制隔膜、细胞壁合成，阻碍细胞分裂；抑制胞内酶的活性。抗菌肽尤其是阳离子抗菌肽有膜作用机制，目前认为存在:“桶板”模型、“毯式”模型，“环形孔”模型和“凝聚”模型等理论。由于抗菌肽的来源天然和作用机制特殊，不易产生耐药性，对人和动物的副作用小，所以备受关注，是抗生素的理想替代品。研究其菌株耐药性、杀菌效果及其杀菌机制则尤为重要，而最小抑菌浓度和最小杀菌浓度是评价抗菌物质抗菌效果和进一步实验的基础指标。由于阳离子抗菌肽携带有正电荷，一般检测方法使用的抗生素敏感测定培养基中的阳离子浓度以及所用器皿的吸附作用对检测会造成较大影响。加之一般抗菌肽的待测样品量微少，不能满足一般检测方法的需求量。所以找到一种能够适用于阳离子抗菌肽的，检测干扰小、微量样品即可操作，并且在实验过程中根据需要可以相应调节的方法，显得尤为迫切。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种干扰小、微量、方便、快捷的测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法。为了解决上述 技术问题，本发明提供一种测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，包括以下步骤:
O试剂配制
MHBCMueller Hinton Broth)培养基:21 g MHB培养基粉末溶于I L蒸馏水中，121°C灭菌20 min，室温冷却，4 °C保存备用。②MHB琼脂培养基:21 g MHB培养基粉末、15 g琼脂粉溶于I L蒸馏水中，121 V灭菌20 min，倒入无菌培养皿中，以刚好覆盖培养皿底部为宜，室温冷却凝固，4°C保存备用。③药剂储存液:准确称取2 mg待测药剂，用无菌水溶解至4 mg/ml,4 °C保存备用。2)细菌悬液制备
①选取-80 °C保存的测试菌种的甘油菌，室温解冻后混悬，用接种环划线MHB琼脂培养基，37 °C培养12 hr，待长出单菌落后，4 °C保存备用。②用接种环挑取步骤2)①中的单菌落，接种于5 ml MHB培养基试管，37 °C>250rpm培养12 hr，待菌液浑浊后，4 °C保存备用。③混悬步骤2)②中的菌液，移取50 μ I接种于5 ml MHB培养基试管，37 °C >250rpm培养约2 hr ο④测定步骤2)③中菌液的0D600值，0D600值约为0.5时可使用。0.6〈0D600〈1.0
时，可用MHB培养基稀释至适宜范围。⑤将步骤2)④中的菌液与MHB培养基以30 μ 1:30 ml混合制成细菌悬液，制备好的细菌悬液应在30 min内使用完毕。3)细菌悬液计数
①步骤2)⑤中的细菌悬液与MHB培养基以10 μ 1:90 μ I混合稀释，连续4次，分别得到10、10~2、10~3和 10~4倍稀释细菌悬液。②取I块MHB琼脂培养基(提前2 hr在37 °C培养箱中缓解)，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区。从步骤3)①中的10、10~2、10~3和10~4等4个浓度稀释梯度细菌悬液中移10 μ I滴加在MHB琼脂培养基标记好的对应扇区，每个梯度3个重复。③待步骤3)②中的细菌悬液被培养基吸收，37 °C培养12 hr，选取3个重复菌落总数为3(Γ200的扇区计数，计算CFU=3个重复菌落总数/30 X稀释倍数X 1000，CFU值在0.5 lX10~6/ml 为宜。4)药剂稀释
取I块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，第I列每孔加入32 μ I步骤I)③中的药剂储存液和168 μ I无菌水，终浓度为640 μ g/ml。第2 10列每孔加入100 μ I无菌水。从第I列起移取100 μ I加入次列，如此逐级等比稀释至第10列，第10列移去100μ I。得到640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25共10个浓度梯度，每孔100 μ 1，现用现配。5)最小抑菌浓度(MIC)的测定
①取I块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，每行作为I个测试，第f 10列每孔加入90 μ I细菌悬液，第11列加入100 μ I细菌悬液作为有菌对照，第12列加入100μ I MHB培养基作为无菌对照。②从步骤4)中的药剂稀释板移取10 μ I稀释药剂加入步骤5)①中96孔板对应的孔中，终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5,0.25和0.125 μ g/ml以及有菌和无菌对照，终体积100 μ I。每种药剂对每种细菌进行3次重复测试。③步骤5)②中的96孔板用保鲜膜包好，放入湿盒(置于容器中覆盖湿润纱布即可)，37 °C培养12 hr。肉眼无可见细菌沉淀的孔所对应的最小浓度数值即为最小抑菌浓度(MIC)。6)最小杀菌浓度(MBC)的测定
①MHB琼脂培养基提前2 hr在37 °C培养箱中缓解，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区。②从步骤5)③中最小抑菌浓度对应的孔起，向高浓度选取4个浓度梯度，每个浓度梯度取 ο μ I滴加在步骤6)①中MHB琼脂平板对应扇区，做好标记，每个梯度3个重复。待细菌悬液被培养基吸收，37 °C培养12 hr。肉眼无菌落生长的扇区所对应的最小浓度数值即为最小杀菌浓度(MBC)。
作为本发明的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法的改进:1)使用非阳离子调节的培养基，或者说是低阳离子培养基。作为本发明的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法的改进:4)和5)使用未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板。本发明中，待测药剂是各类具有抗菌活性的物质，特别是阳离子抗菌肽。本发明方法的检测结果表明:测试方法能够满足微量抗菌活性物质的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定的需求，结果重复性好。本发明具有如下有益效果:
I可以微量测定，满足抗菌活性物质样品少时的测定需求，2 mg即可测定，且节约试 剂。2可以测定阳离子抗菌肽，排除了反应体系中阳离子的干扰，以及96孔板对阳离子抗菌肽的吸附作用。3本方法操作简便，所用设备简单常见，所用试剂经济实惠，方法简单易行。
图1是细菌悬液计数滴板培养后培养皿照片。图2是药剂稀释及与细菌悬液混合铺96孔板的结果示意图。
具体实施例方式以下结合附图和具体实施方式
对本发明做进一步的说明。实施例1
2012年9月18日，测定抗菌肽PR-39和抗生素金霉素、新霉素及硫酸粘菌素对大肠杆菌CMCC 44103和ATCC 25922的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度。)试剂配制
①MHB培养基:21 g MHB培养基粉末(BD Difco，货号275730 )溶于I L蒸馏水中，121°C灭菌20 min，室温冷却，4 °C保存备用。②MHB琼脂培养基:21 g MHB培养基粉末、15 g琼脂粉溶于I L蒸馏水中，121 V灭菌20 min，倒入无菌培养皿中，以刚好覆盖培养皿底部为宜，室温冷却凝固，4°C保存备用。③药剂储存液:准确称取2 mg待测药剂，用无菌水溶解至4 mg/ml,4 °C保存备用。)细菌悬液制备
①选取-80 °C保存的甘油菌，室温解冻后混悬，用接种环划线MHB琼脂培养基，37 V培养12 hr，待长出单菌落后，4 °C保存备用。②用接种环挑取步骤2)①中的单菌落，接种于5 ml MHB培养基试管，37 °C>250rpm培养12 hr，待菌液浑浊后，4 °C保存备用。③混悬步骤2)②中的菌液，移取50 μ I接种于5 ml MHB培养基试管，37 °C >250rpm培养约2 hr ο④测定步骤2)③中菌液的0D600值，大肠杆菌CMCC 44103的0D600值为0.456，大肠杆菌A细胞培养C 25922的0D600值为0.476。⑤将步骤2)④中的菌液与MHB培养基以30 μ 1:30 ml混合制成细菌悬液，制备好的细菌悬液应在30 min内使用完毕。)细菌悬液计数
①步骤2)⑤中的细菌悬液与MHB培养基以10 μ 1:90 μ I混合稀释，连续4次，分别得到10、10~2、10~3和10~4倍稀释细菌悬液。②取I块MHB琼脂培养基(提前2 hr在37 °C培养箱中缓解)，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区。从步骤3)①中的10、10~2、10~3和10~4等4个浓度稀释梯度细菌悬液中移10 μ I滴加在MHB琼脂培养基标记好的对应扇区，每个梯度3个重复。方法如图1所示。③待步骤3)②中的细菌悬液被培养基吸收，37 °C培养12 hr，选取3个重复菌落总数为3(Γ200的扇区计数，计算CFU=3个重复菌落总数/30 X稀释倍数X 1000，CFU值在
0.5 I X 10~6/ml为宜。结果如下表I所示:
表 I _____
权利要求
1.一种微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，其特征在于，包括以下步骤: `1)试剂配制:配制MuellerHinton Broth培养基； `2)细菌悬液制备:培养细菌至对数生长期，制备细菌悬液； `3)细菌悬液计数:倍比稀释所述的步骤2)中的细菌悬液后滴板计数； `4)阳离子抗菌肽稀释:倍比稀释阳离子抗菌肽至不同测试浓度梯度； `5)测定最小抑菌浓度:将所述的步骤4)中的不同测试浓度梯度的阳离子抗菌肽与步骤2)中制备的细菌悬液混合后培养，观察是否有肉眼可见的细菌沉淀，无肉眼可见细菌沉淀的孔对应的最小浓度即为最小抑菌浓度； `6)测定最小杀菌浓度:将所述的步骤5)中有抑菌效果的测试滴板后培养，观察是否有菌落生长无菌落 生长扇区对应的最小浓度即为最小杀菌浓度。
2.根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤I)中的试剂配制过程如下: `1.1)MHB培养基:21 g MHB培养基粉末溶于I L蒸馏水中，121 °C灭菌20 min，室温冷却，4 1:保存备用； `1.2)MHB琼脂培养基:21 g MHB培养基粉末、15 g琼脂粉溶于I L蒸馏水中，121 V灭菌20 min，倒入无菌培养皿中，以刚好覆盖培养皿底部为宜，室温冷却凝固，4°C保存备用； `1.3)药剂储存液:准确称取2mg待测药剂，用无菌水溶解至4 mg/ml, 4 °C保存备用。
3.根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤2)中细菌悬液制备过程如下: `2.1)选取-80 °C保存的测试菌种的甘油菌，室温解冻后混悬，用接种环划线MHB琼脂培养基，37 °C培养12 hr，待长出单菌落后，4 1:保存备用； `2.2)用接种环挑取步骤2.1)中的单菌落，接种于5 ml MHB培养基试管，37 °C>250rpm培养12 hr，待菌液浑浊后，4 1:保存备用； `2.3)混悬步骤2.2)中的菌液，移取50 μ I接种于5 ml MHB培养基试管，37 °C >250rpm培养约2 hr ； `2.4)测定步骤2.3)中菌液的0D600值，0D600值约为0.5时可使用，0.6<0D600<1.0时，可用MHB培养基稀释至适宜范围； `2.5)将步骤2.4)中的菌液与MHB培养基以30 μ 1:30 ml混合制成细菌悬液，制备好的细菌悬液应在30 min内使用完毕。
4.根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤3)中细菌悬液计数过程如下: `3.1)所述的2.5)中的细菌悬液与MHB培养基以10 μ 1:90 μ I混合稀释，连续4次，分别得到10、10~2、10~3和10~4倍稀释细菌悬液； `3.2)取I块MHB琼脂培养基，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区，从步骤3.1)中的10、10~2、10~3和10~4等4个浓度稀释梯度细菌悬液中移10 μ I滴加在MHB琼脂培养基标记好的对应扇区，每个梯度3个重复； `3.3)待步骤3.2)中的细菌悬液被培养基吸收，37 °C培养12 hr，选取3个重复菌落总数为3(Γ200的扇区计数，计算CFU=3个重复菌落总数/30 X稀释倍数X 1000，CFU值在·0.5 lX10~6/ml 为宜。
5.根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤4)中药剂稀释过程如下: 取I块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，第I列每孔加入32 μ I步骤1.3)中的药剂储存液和168 μ 1无菌水，终浓度为640 μ g/ml ;第2 10列每孔加入100 μ I无菌水-J人第I列起移取100 μ 1加入次列，如此逐级等比稀释至第10列，第10列移去100μ I ;得至IJ 640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 共 10 个浓度梯度，每孔 100 μ 1，现用现配。
6.根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤5)中最小抑菌浓度的测定过程如下: 5.1)取I块未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板，每行作为I个测试，第f 10列每孔加入90 μ I细菌悬液，第11列加入100 μ I细菌悬液作为有菌对照，第12列加入100μ I MHB培养基作为无菌对照； 5.2)从步骤4)中的药剂稀释板移取10 μ I稀释药剂加入步骤5.1)中96孔板对应的孔中，终浓度为64、32、16、8、4、2、1、0.5,0.25和0.125 μ g/ml以及有菌和无菌对照，终体积100 μ I ;每种药剂对每种细菌进行3次重复测试； 5.3)步骤5.2)中的96孔板用保鲜膜包好，放入湿盒(置于容器中覆盖湿润纱布即可)，37 °C培养12 hr，肉眼无可见细菌沉淀的孔所对应的最小浓度数值即为最小抑菌浓度(MIC)。
7.根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤6)中最小杀菌浓度的测定过程如下: 6.1) MHB琼脂培养基提前2 hr在37 1:培养箱中缓解，记号笔在底部外侧画十字分为4个相等扇区； 6.2)从步骤5.3)中最小抑菌浓度对应的孔起，向高浓度选取4个浓度梯度，每个浓度梯度取10 μ I滴加在步骤6.1)中MHB琼脂平板对应扇区，做好标记，每个梯度3个重复；待细菌悬液被培养基吸收，37 °C培养12 hr ;肉眼无菌落生长的扇区所对应的最小浓度数值即为最小杀菌浓度。
8.根据权利要求1所述的微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度方法，其特征在于，所述的步骤4)和步骤4) 5)使用未经细胞培养处理的聚丙烯材质的96孔板。
全文摘要
本发明公开了一种微量测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的方法，包括以下步骤1)试剂配制配制MHB培养基；2)细菌悬液制备复苏细菌至对数生长期，制备浓度一定的细菌悬液；3)细菌悬液计数倍比稀释步骤2)中的细菌悬液后滴板计数；4)药剂稀释倍比稀释药剂至不同测试浓度梯度；5)测定最小抑菌浓度将步骤4)中稀释好的药剂与步骤2)中制备的细菌悬液混合后培养，观察是否有肉眼可见的细菌沉淀；6)测定最小杀菌浓度将步骤5)中有抑菌效果的测试滴板后培养，观察是否有菌落生长。采用该方法测定阳离子抗菌肽最小抑菌浓度和最小杀菌浓度具有干扰小、微量、方便、快捷的特点。
文档编号C12Q1/18GK103173517SQ20131006581
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者汪以真, 李治学, 韩菲菲, 黄霞, 刘丹 申请人:浙江大学