专利名称：一种含有abcb1基因3′utr序列和报告基因的质粒载体及其构建方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及调控靶基因的microRNA的筛选，具体地说，是一种含有ABCBl基因3' UTR序列和报告基因的质粒载体及其构建方法和用途。
背景技术：
对化疗药物产生耐药性是当今肿瘤治疗的一大难题。肿瘤的多药耐药(mult1-drug resistance, MDR)是指肿瘤细胞长期接触某一化疗药物,不仅对此种化疗药物产生耐药性,而且对其他结构和功能不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性的现象。自从化疗药物开始应用于肿瘤的治疗后，就一直伴随着多药耐药的发生，因此怎样逆转肿瘤多药耐药一直以来都被认为是与临床结合最为密切的研究方向。近年来，随着分子生物学和遗传学的发展，复杂的肿瘤耐药机制研究已由单纯的病理生理学转向分子病理学范畴，耐药基因的表达增加已经被肯定 与肿瘤的耐药性有明显的关系。研究表明ABCBl (MDRl)基因编码的P糖蛋白(P-glucoprotein, P-gp)在多药耐药中起着主要作用，主要作用机理是能量依赖性地将化疗药物转运出肿瘤细胞，减少药物在细胞内的蓄积，导致MDR。P-gp是一种分子量为170kd的跨膜糖蛋白，由1280个氨基酸残基组成，具有12个跨膜区和2个细胞内ATP连结点。当肿瘤细胞长期接触抗癌药物时，ABCBl基因被诱导扩增，P-gp被大量表达，当肿瘤药物再次与P-gp结合时，其ATP结合点上连接的ATP水解后释放的能量能将抗癌药物转移到细胞外，使细胞内蓄积药物减少，减少作用靶点部位的药物浓度，导致化学治疗的效果下降乃至消失。人ABCBl基因位于7号染色体的7q21.1，含有28个外显子，其cDNA全长4.5kb，含有一个开放阅读框架(ORF)，基因启动子包含:CAAT盒的同感序列、GC盒样序列、Y-box (反向CCAAT元件)、HSE (热休克元件)、P53元件、AP-1元件、TCF元件、类固醇异种生物受体元件、C/ΕΒΡ元件和起始元件。此外,还含有增强子等元件与hmdrl基因的组织特异性表达有关，但无TATA盒。ABCBl表达的调控主要在转录和转录后水平，与大多数细胞和病毒无TATA盒启动子的基因调控相似，与ABCBl转录起始序列GC盒、Y盒、CCAAT盒、HSE和AP-1等结合的转录。非编码小RNA (microRNA，miRNA)是近年来新发现的一类非编码小分子RNA，长度为22-28个核苷酸，广泛存在于真核生物细胞内，是最大的基因家族之一，约占整个基因组的1%-4%。目前，人类基因组中确认的miRNA约500个，至少有200多种与癌症的发生有关，不少miRNA可能扮演着癌基因和抑癌基因的角色。由于miRNA作用靶点是基因的3’ UTR区域，因此基因的3’ UTR的改变程度能够直接指示该基因受到miRNA的调控程度。有研究发现，不同miRNA对多药耐药基因3’ UTR区域的影响也不同，而多药耐药基因3’ UTR区域mRNA的变化又直接影响该基因的改变程度，最终该耐药基因的变化直接影响耐药性。因此通过修复microRNAs的表达，改变耐药基因的表达，已成为通过基因调控逆转耐药的重要方向之一。然而，由于microRNAs的发现始于本世纪初,而microRNAs与MDR的研究更是尚处于起步阶段，一些问题仍限制其应用和发展。例如:如何准确预测调控靶基因的microRNAs，如何提高microRNAs检测的灵敏度和特异性等，这对于基因调控逆转耐药的药物研发具有十分重要的意义。发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种质粒载体。
本发明的再一的目的是，提供一种含有上述质粒载体的宿主细胞。
本发明的另一的目的是，提供一种上述质粒载体的构建方法。
本发明的第四个目的是，提供一种上述质粒载体的用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是: 一种质粒载体，所述的质粒载体是在pmirGLO Dual-Luciferase-promoter质粒载体的第6832-7349bp区段内插入了人ABCBl基因的Y UTR序列。
优选的，所述的人ABCBl基因的3' UTR序列插入在pmirGLODual-Luciferase-promoter质粒载体的sacl和xhol限制性酶切位点之间。
优选的，所 述的质粒载体是通过以下方法构建的:a)克隆或人工合成两端带sacl和xhol限制性酶切位点的人ABCBl基因的3'UTR序列； b)使用sacl和xhol限制性内切酶双酶切pmirGLODual-Luciferase-promoter质粒载体，回收大片段； c)使用连接酶连接步骤a)所述的人ABCBl基因的3'UTR序列和步骤b)所述的大片段，连接产物转化感受态细胞后，筛选阳性克隆，提取质粒。
所述的人ABCBl基因的3' UTR序列包含下述核苷酸序列: a)如SEQID N0.3所示的核苷酸序列；和/或 b)与SEQID N0.3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是: 一种宿主细胞，所述的宿主细胞包含有如上任一所述的质粒载体。
优选的，所述的宿主细胞是人肠癌多药耐药细胞株HCT116/L-0HP。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是: 一种如上所述的质粒载体的构建方法，所述的方法包括下列步骤:a)克隆或人工合成两端带sacl和xhol限制性酶切位点的人ABCBl基因的3'UTR序列； b)使用sacl和xhol限制性内切酶双酶切pmirGLODual-Luciferase-promoter质粒载体，回收大片段； c)使用连接酶连接步骤a)所述的人ABCBl基因的3'UTR序列和步骤b)所述的大片段，连接产物转化感受态细胞后，筛选阳性克隆，提取质粒。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是: 如上任一所述的质粒载体在筛选调控人ABCBl基因3 ^ UTR序列的microRNA中的用途； 如上任一所述的质粒载体在筛选抑制人P糖蛋白表达的microRNA中的用途；如上任一所述的质粒载体在筛选多药耐药相关microRNA中的用途。
本发明的优点在于:本发明成功构建了含有人ABCBl基因3’UTR序列和双荧光报告基因的质粒载体，将人ABCBl基因3’UTR序列插入到luc2基因的下游区段，使得人ABCBl基因3’UTR序列能直接影响luc2基因的表达。因此将该载体连同待测试microRNA共转染多药耐药细胞株，观察双荧光素酶报告基因的表达情况，可以确定待测试microRNA对人ABCBl基因3’ UTR序列的作用，进而用于筛选调控人ABCBl基因3’ UTR表达的microRNA。因此，本发明为准确预测调控人ABCBl基因3’UTR表达的microRNA提供了一种快速、高效、简单易行的方法，进而为提高miCToRNA检测的灵敏度和特异性，以及研发和检测通过基因调控逆转多药耐药的药物开辟了新的途径。
图1是PMD18T载体图谱。
图2为ABCBl基因3’UTR序列的克隆其PCR产物的电泳图谱，其中Maker为DL2000,1 和 2 均为 ABCBl 基因的 3’ UTR 片段(379bp)。
图3是pmirGLO Dual-Luciferase-promoter双突光报告基因载体图谱。
图4 为 pmirGL0-ABCBl-3’ UTR-promoter 重组质粒的 seal 和 xhol 双酶切产物电泳图谱，其中 Maker 为 DL10000，1、2、3 均为 pmirGLO-ABCBl-3’ UTR-promoter 双酶切产物。
图5 为 pmirGL0-ABCBl-3’ UTR-promoter 重组质粒 3’ UTR 片段测序结果与 NCBI 公布的ABCBl基因的3’ UTR序列进行Blast分析的序列比对图。
图6是在细胞中检测microRNA minics对于ABCBl基因3’ UTR影响获得的双荧光素酶活性柱状图。每组中数字含义为:1.转染microRNA mimics的对照组,2.hsa_miR-200amimics/ 质粒组,3.hsa-miR-497 mimics/ 质粒组,4.hsa_miR-200c mimics/ 质粒组。
图7是筛选出的对于ABCBl基因有抑制作用的microRNA minics的westernblot杂交图谱。图中，I为空白对照组，2为转染microRNA mimics的对照组，3为hsa-miR-497mimics 组,4 为 hsa_miR-200c mimics 组。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。
实施例1构建含ABCBl基因3’ UTR序列和报告基因的重组T载体 一、材料 1.质粒 PMD18T载体质粒购自美国Promega公司，其载体图谱如图1所示。
2.主要试剂 限制性内切酶seal和xhol，以及DNA Ligation Kit (DNA连接试剂盒)购自TaKaRa公司。DL2000 maker购自上海MajorBio公司。双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自KenReal公司。质粒提取试剂盒和DNA片段回收试剂盒购自Tiangen公司。
二、方法与结果 1.血样采集和基因组DNA抽提 米集健康志愿者外周血5mL,置于EDTA抗凝的玻璃试管,I&存于-40°C冰箱备用。按照标准苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，置于4°C冰箱备用。
2.ABCBl 基因的 PCR 扩增 引物设计:根据人ABCBl基因的3’UTR序列(NCBI的gene ID: 5243)设计两端引物:引物I和引物2。
引物I为上游5’端引物，其中包含27个ABCBl基因的3’UTR序列互补碱基，一个seal识别位点，6个保护碱基；引物2为下游3’端引物，其中包含28个ABCBI基因的3’ UTR序列互补碱基，一个xhol识别位点，6个保护碱基。具体引物序列如下:
权利要求
1.一种质粒载体，其特征在于，所述的质粒载体是在pmirGLODual-Luciferase-promoter质粒载体的第6832_7349bp区段内插入了人ABCBl基因的3' UTR序列。
2.根据权利要求1所述的质粒载体，其特征在于，所述的人ABCBl基因的3'UTR序列插入在pmirGLO Dual-Luciferase-promoter质粒载体的sacl和xhol限制性酶切位点之间。
3.根据权利要求2所述的质粒载体，其特征在于，所述的质粒载体是通过以下方法构建的: a)克隆或人工合成两端带sacl和xhol限制性酶切位点的人ABCBl基因的3'UTR序列； b)使用sacl和xhol限制性内切酶双酶切pmirGLODual-Luciferase-promoter质粒载体，回收大片段； c)使用连接酶连接步骤a)所述的人ABCBl基因的3'UTR序列和步骤b)所述的大片段，连接产物转化感受态细胞后，筛选阳性克隆，提取质粒。
4.根据权利要求1-3任一所述的质粒载体，其特征在于，所述的人ABCBl基因的3' UTR序列包含下述核苷酸序列: a)如SEQID N0.3所示的核苷酸序列；和/或 b)与SEQID N0.3所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
5.—种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞包含有如权利要求4所述的质粒载体。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是人肠癌多药耐药细胞株 HCT116/L-0HP。
7.—种权利要求4所述的质粒载体的构建方法，其特征在于，所述的方法包括下列步骤: a)克隆或人工合成两端带sacl和xhol限制性酶切位点的人ABCBl基因的3'UTR序列； b)使用sacl和xhol限制性内切酶双酶切pmirGLODual-Luciferase-promoter质粒载体，回收大片段； c)使用连接酶连接步骤a)所述的人ABCBl基因的3'UTR序列和步骤b)所述的大片段，连接产物转化感受态细胞后，筛选阳性克隆，提取质粒。
8.权利要求1-3任一所述的质粒载体在筛选调控人ABCBl基因3'UTR序列表达的microRNA中的用途。
9.权利要求1-3任一所述的质粒载体在筛选抑制人P糖蛋白表达的microRNA中的用途。
10.权利要求1-3任一所述的质粒载体在筛选多药耐药相关microRNA中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种质粒载体，所述的质粒载体是在pmirGLODual-Luciferase-promoter质粒载体的第6832-7349bp区段内插入了人ABCB1基因的3′UTR序列。本发明还涉及含有上述载体的宿主细胞、上述载体的构建方法及其在筛选多药耐药相关microRNA中的用途。本发明为准确预测调控人ABCB1基因表达的microRNA提供了一种快速、高效、简单易行的方法，进而为提高microRNA检测的灵敏度和特异性，以及研发和检测通过基因调控逆转多药耐药的药物开辟了新的途径。
文档编号C12Q1/68GK103173481SQ201310065889
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月1日 优先权日2013年3月1日
发明者朱惠蓉, 李琦, 隋华, 殷佩浩, 王炎, 潘树芳, 靳宝辉, 孙建, 王一斐, 范忠泽 申请人:上海中医药大学附属普陀医院, 上海中医药大学附属曙光医院