一种检测水体重金属铅的微生物学方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测重金属铅的微生物学方法，具体涉及利用基因工程技术改造 的大肠埃希氏菌的构建方法及其检测水体环境中铅方法的建立。
【背景技术】
[0002] 随着工农业的发展，很多含有铅离子的污染物排放入江河湖泊中，污染土壤、水源 甚至是日常食用的粮食蔬菜。环境中的铅主要来源于各种油漆、涂料、蓄电池、冶炼、五金、 机械、电镀、化妆品、染发剂、釉彩碗碟、餐具、燃煤、膨化食品、自来水管等。研宄发现过量的 重金属铅对于所有的生命体都是有毒的，人体吸收过量的铅后，可蓄积于人体重要器官肝、 肾、脑等。它是通过皮肤、消化道、呼吸道进入体内与多种器官亲和，主要毒性效应是贫血 症、神经机能失调和肾损伤，易受害的人群有儿童、老人、免疫低下人群。铅对水生生物的安 全浓度为0. 16mg/L，用含铅0. 1~4. 4mg/L的水灌溉水稻和小麦时，作物中铅含量明显增 加。人体内正常的铅含量应该在〇. lmg/L，如果含量超标，容易引起贫血，损害神经系统。而 幼儿大脑受铅的损害要比成人敏感得多，一旦血铅含量超标，应该采取积极的排铅毒措施。 儿童可服用排铅口服液或借助其他产品进行排铅。
[0003] 目前监测和检测重金属污染物主要有两种方法：（1)物理化学分析法，如电感耦 合等离子体原子发射光谱（ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱（ICP-MS)等，其优点是具备 高检测灵敏度和高特异性，但也存在一些不足，如仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期长，最 重要的一点是，传统的物理化学方法主要是对环境重金属总量进行测定，不能检测重金属 的生物可利用度；（2)微生物法，其优势是成本低廉、操作简易，可以直接反映污染物对生 物有机体的毒性及影响。除此，该方法常用的模式生物（如大肠埃希菌）繁殖及生存能力 强，易储存和稳定性高，以其为生物学感应元件的微生物细胞传感器可以极大简化传感器 的制作过程，提高传感器的检测效率。
[0004] 但是，目前关于铅在大肠埃希菌的具体耐受机制仍未见报道。然而根据Rensing C 等在文献 Pb (II)-translocating P-type ATPases. J Biol Chem. 1998Dec 4 ;273 (49): 32614-7,已发现大肠埃希菌中负责编码将铅离子泵出的P-Type ATPase基因 zntA及其 调节蛋白基因 zntR ;但是zntA基因的启动子对铅并非完全特异，它还能被锌、镉等离子非 特异性启动，故其启动子不能作为铅检测的特异性元件。据Hobman几 ，Julian DJ等在 Cysteine coordination of Pb (II) is involved in the PbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter，PpbrA，from Cupriavidus metallidurans CH34. BMC Microbiol. 2012Jun 18 ;12 :109 和 Wei Wei 等在文献 Simple Whole-Cell Biodetection and Bioremediation of Heavy Metals Based on an Engineered Lead-Specific Operon. Environ Sci Technol.2014Mar 18 ;48(6) :3363-71 报道，贪铜菌属中 PbrR 的启动子能被 铅离子特异性启动表达下游基因，其对铅离子的特异性已得到证实。
[0005] 2008 年，Aparna Chaudhari 等在文献 GFP expressing bacterial biosensor to measure lead contamination in aquatic environment. Research Communications. 2008Mar 25 ;(94) :800-805 中以大肠埃希菌 DH5a 为宿主菌， Cupriavidus metallidurans CH34中PbrR及其启动子PbrO/P为感应元件，RFP作为报告 基因检测地表水中的铅。据该文献报道，在LB培养基中，37°C经过12h的培养，可检测的铅 离子浓度范围是50-400 μ M ;铅离子浓度为250 μ M，红色荧光蛋白表达达到峰值，若铅浓度 的再升高，红色荧光蛋白荧光强度反而呈降低趋势。
[0006] 构建检测铅离子的以质粒为载体、细菌为宿主的微生物法，存在以下问题：⑴铅 是一种常见的剧毒性环境污染重金属，大部分细菌存在一套对有害重金属泵出机制，对铅 的沉淀物或者活性形式都有抗性，故其敏感性不高。Aparna中检测的铅离子浓度范围是 50-400 μ Μ，远高于《地表水环境质量标准》GB3838-2002中II类水源对铅的限值0.0 lmg/ L (0. 05 μ Μ)、III类水源限值0. 05mg/L (0. 25 μ Μ)。（2)研宄是基于质粒作为荧光表达载体， 质粒传代过程可能出现拷贝数不一、丢失和高本底等缺陷致使检测结果不稳定。Aparna中 检测铅离子需在LB培养基中，37°C经过12h的培养，周期过长，时效性差，不利于现场检测。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是通过基因敲除和基因敲入技术构建了一株大肠埃希菌生物 检测菌株，进而建立特异、稳定检测水体中重金属铅的方法。本发明的大肠埃希氏菌 (Escherichia coli)WMC_008p，已于2014年9月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心，其简称为CGMCC (地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研宄所，邮编100101)保藏，分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli)，保藏编号 为 CGMCC No. 9748。
[0008] 本发明E. coli WMC-008p CGMCC No. 9748生物菌株的构建及应用方法如下：
[0009] L构建Δ zntA Δ zntR双基因突变菌株
[0010] PCR扩增含zntA和zntR上下游各50bp同源臂带FRT位点的氯霉素抗性基因；将 扩增的氯霉素抗性基因转入含Red重组酶的菌株中；选择氯霉素抗性转化体；FLP重组酶消 除氯霉素抗性基因；双敲为在单敲除菌基础上重复上述操作。
[0011] 2· E. coli WMC-008P CGMCC No. 9748 的构建
[0012] 2. 1 融合基因 PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed_express2 的构建
[0013] PCR分别扩增人工合成的pbrR基因及其启动子PpbrA片段和pbrA基因 启动子和报告基因 DsRed-expresd片段，再通过交叉PCR技术将两片段连接，形成 PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed_express2 融合报告基因。
[0014] 2. 2pK0V法将融合基因敲入AzntA AzntR双基因突变菌株基因组
[0015] 将 pKOV-PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed_express2 转化入 E. coli Δ zntA Δ zntR，pKOV 通过温度及鹿糖的选择，发生两次同源重组，最后将PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed_express2 报告基因置换到zntA编码基因位置，筛选获得能够特异、敏感和快速检测铅的大肠埃希菌 生物检测菌株E. coli WMC-008p。
[0016] 3.建立本发明检测水体中重金属铅的微生物学方法
[0017] 3.1培养基的配制：
[0018] lg/L胰蛋白胨、0· 5g/L酵母膏、lg/LNaCl，先加50ml MilliQ H20,振荡至完全融解 后加 MilliQ H2O定容至80ml，高压蒸汽灭菌，再加入10ml 400mM无菌MOPS缓冲液，混勾。
[0019] 3. 2标准曲线的制定：
[0020] 把铅单元素标准品用无菌MilliQ级的纯水稀释成适当的浓度梯度。
[0021] 3. 2. 1从步骤2. 2获得的甘油保存菌E. coli WMC-008p菌株中取5-10 μ 1接入步 骤3. 2. 1配制的新鲜5ml步骤3. 1配制的LB培养基，37°C，250rpm过夜培养；
[0022] 3. 2. 2取5-10 μ 1步骤3. 2. 1的E. coli WMC-008p过夜菌加入到LB培养基中， 37°C，250rpm，恒温震荡培养至OD6J直在0· 5-0. 6,取90-900 μ 1菌液分装至96孔透明底黑 色微孔板或15Χ 150_规格的检测管内，同时在每个检测孔或检测管内加入铅离子使终浓 度分别为 〇· 05、0· 25、0· 50、1· 00、5· 00、7· 50、10· 00、12· 50、15· 00 以111〇1/1，37。〇、250卬111振 荡孵育3-5h ;
[0023] 3. 2. 3将步骤3. 2. 2菌液4, OOOrpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于 Iml 含 500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20 μ g/ml 氯霉素 、pH 8. ODB 缓冲液中，制成菌悬液；
[0024] 3. 2. 4将步骤3. 2. 3重悬菌液稀释20倍，使E. coli WMC-008p全细胞悬浮液的 0D600 < 0. 2,混匀，分别测量其稀释液荧光值，激发波长为550nm，发射波长为570nm，并测 其OD6J直；
[0025] 3. 2. 5数据处理：
[0026] 相对焚光值（Relative fluorescence unit，RFU) :RFUM = FM/0D6(i(iM，FM为与铅单 元素标准品孵育E. coli WMC-008p菌悬液的荧光值，0D_M为与铅单元素标准品孵育E. coli WMC-008p菌悬液的吸光度；RFUW = FW/0D_W，FW为与MilliQ级纯水孵育E.coliWMC-008p 菌悬液的背景荧光值，OD6tltlW为与MilliQ级纯水孵育E. coli WMC-008p菌悬液的吸光度；
[0027] 绝对焚光值（Absolutee fluorescence unit，AFU) :AFU = RFUM-RFUW，RFUM 为与 铅单元素标准品孵育E. coli WMC-008p菌悬液的相对荧光值，RFUW为与MilliQ级纯水孵 育E. coli WMC-008p菌悬液的相对背景荧光值。
[0028] 3. 3样品检测：
[0029] 用移液枪吸取E. coli WMC-008p CGMCC No. 9748过夜菌种子液加入到含有 终浓度为40mM MOPS缓冲成分的LB培养基中，使起始菌液OD6cJ直为0. 5-0. 6,分装至 15 X 150_规格的无菌试管或康宁公司的96孔透明底黑色微孔板中，并在开始接菌时即加 入1/1000-1/100体积不同浓度的Pb 2+溶液或待检测环境水体样品，另加等体积无菌Mi 11 iQ H2O作为阴性对照，每种浓度或样品各做3个平行管或3个平行孔，37°C、250rpm振荡孵育 3h，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于Iml DB中，然后将重悬