3h，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于Iml DB中。为了使背景 散射和内滤效应最小化，需要E. coli WMC-008p全细胞悬浮液的0D_< 0. 2,故将重悬菌液 稀释20倍，混匀，测量其稀释液荧光值，激发波长为550nm，发射波长为570nm，并测其0D_ 值。最后将测得的未知环境水体样品荧光强度值代入步骤5. 2所得方程，计算得到未知环 境水体样品中铅的浓度。
[0140] 实施例6.本发明检测水体中重金属铅浓度的应用实例及方法学评估
[0141] 6. 1菌株E. coli WMC-008p检测工业废水标本中铅
[0142] 从温州医科大学茶山校区附近某制鞋厂排污口处采集一个水样，经0. 22 μπι的无 菌过滤器过滤。用移液枪吸取Ε. coli WMC-008p过夜菌种子液加入到上述90mL新鲜LB液体 培养基中，使起始菌液OD6J直约为0. 02，37°C，250rpm诱导至OD = 0. 5-0. 6，最优OD = 0. 5， 分装0. 9ml/管，加入等体积不同浓度的Pb2+溶液至各管菌液，使其终浓度在10 _9-10_5M/L 之间取四个值，然后再分别加入100 μ L过滤后的水样至每管菌液，每种浓度各做3个平行 管。将以上菌液于37°C，250rpm振荡培养3-5h，最优培养时间为5后，4, OOOrpm，水平离心 lOmin，弃上清，收获的菌体重悬于Iml Desalting buffer中，然后取50 μ L重悬菌液20倍 稀释于0.95ml Desalting buffer中，混勾，分别测量其稀释液焚光值与OD6cJl。实验结 果为三次独立实验的平均值土SD值，η = 3。
[0143] 实验结果：E. coli WMC-008p对湖水中铅离子的回收率均在91%-109%之间。 用该方法测定的结果与采用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS)测定的结果相接近。说明 Ε. coli WMC-008p具备客观检测实际水体中铅的含量的应用前景。
[0144] 6. 2强酸强碱标本对菌株Ε. coli WMC-008p检测结果的影响
[0145] 用移液枪吸取Ε. coli WMC-008p过夜菌种子液加入到上述90ml新鲜LB液体培养 基中，使起始菌液OD6J直约为0. 02, 37°C，250rpm诱导至OD = 0. 5-0. 6时，分装0. 9ml/管， 分别加入100 μ 1六种不同pH值0. 5、I. 5、6. 0、12. 9的样品，然后再分别加入等体积Pb2+溶 液至各管菌液使其终浓度均一致，另加等体积无菌MilliQ H2O作为空白对照。每种pH值 样品各做3个平行管。将以上菌液于37°C，250rpm振荡培养3-5h后，4, OOOrpm水平离心 10min，弃上清，收获的菌体重悬于Iml Desalting buffer中，然后取50 μ 1重悬菌液20倍 稀释于0. 95mlDesalting buffer中，混匀，分别测量其稀释液荧光值与OD6cJ直。实验结果 为三次独立实验的平均值土SD值，η = 3。
[0146] 实验结果：E.coli WMC-008p对强酸强碱模拟标本中铅离子的回收率均在 87%-116%之间。用该方法测定的结果与采用原子吸收光谱法（AAS)测定的结果相接近。 说明E. coli WMC-008p具备客观检测水体中铅的含量而不受水体中强酸强碱的影响。
[0147]
【主权项】
1. 一株大肠埃希氏菌WMC-008p的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌（Escherichia coli)WMC-010CGMCC No. 9748应用于水体重金属铅的检测。2. 根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-OOSp的应用，其特征在于所述的大肠 埃希氏菌WMC-008p工程菌株的构建方法如下： 2. 1权利要求1所述的大肠埃希菌工程菌株，其特征在于，利用Red重组酶系统中条件 复制质粒pKD46和pCP20,敲除野生型大肠埃希菌E. coli MC4100基因组中zntA和zntR两 个基因，构建A zntA A zntR双基因突变菌株。 2. 2-种铅离子诱导的红色荧光蛋白报告元件，其特征在于，是一个由转录调节蛋白 PbrR基因及其启动子PpbrA和该启动子与红色焚光蛋白DsRed_express2的融合片段相连 接构建的表达元件，定位于大肠埃希菌的基因组。包括以下步骤： 2. 2. 1利用交叉PCR技术实现将人工合成pbrR基因及其启动子PpbrA片段和红色 焚光基因DsRed-express2与PbrA基因启动子PpbrA相融合的融合报告基因PpbrA :: DsRed_express2 片段相连接，形成最终片段 PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed_express2 ; 2. 2. 2将步骤2. 2. 1所得片段克隆到pMDTM19-T载体上，构建PpbrA-pbrR-PpbrA :; DsRed-express2_T 重组载体； 2. 2. 3 测序分析正确的重组载体 PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed-express2_T 经 sal I 和Not I双酶切后的目的条带连接到pKOV载体上，构建打靶载体PpbrA-pbrR-PpbrA :: DsRed-express2-pK0V ； 2. 2. 4将步骤2. 2. 3所得打靶载体转入A zntA A zntR双基因敲除菌株，打靶载体pKOV 使PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed_express2成功替换A zntA A zntR双基因敲除菌株基因组 上zntA基因位置。3. 根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-OOSp的应用，其特征在于所述大肠埃 希氏菌WMC-008p检测水体中重金属铅的微生物方法，包含以下步骤： 3. 1培养基的配制： lg/L胰蛋白胨、0. 5g/L酵母膏、lg/LNaCl，先加50ml MilliQ H2O,振荡至完全融解后加 MilliQ H2O定容至80ml，高压蒸汽灭菌，再加入10ml400mM无菌MOPS缓冲液，混勾。 3. 2标准曲线的制定： 把铅单元素标准品用无菌MilliQ级的纯水稀释成适当的浓度梯度。 3. 2. 1从步骤2. 2. 4获得的甘油保存菌E. coli WMC-008p菌株中取5-10 y 1接入步骤 3. 1配制的新鲜5ml LB培养基，37°C，250rpm过夜培养； 3. 2. 2取5-10 y 1步骤3. 2. 1的E. coli WMC-008p过夜菌加入到LB培养基中，37°C， 250rpm，恒温震荡培养至OD6J直在0. 5-0. 6,取90-900 y 1菌液分装至96孔透明底黑色微 孔板或15X 150mm规格的检测管内，同时在每个检测孔或检测管内加入铅离子使终浓度分 别为 0? 05、0. 25、0. 50、1. 00、5. 00、7. 50、10. 00、12. 50、15. 00 11111〇1/1，37。〇、250卬111振荡孵 育 3-5h ; 3. 2. 3将步骤3. 2. 2菌液4, OOOrpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于Iml含 500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20μg/ml 氯霉素、pH 8. ODB 缓冲液中，制成菌悬液； 3. 2. 4将步骤3. 2. 3重悬菌液稀释20倍，使E. coli WMC-008p全细胞悬浮液的 0D600 < 0. 2,混匀，分别测量其稀释液荧光值，激发波长为550nm，发射波长为570nm，并测 其OD6J直； 3. 2. 5 数据处理：相对焚光值（Relative fluorescence unit，RFU) :RFUM = FM/0D_M， FM为与铅单元素标准品孵育E. coli WMC-008p菌悬液的荧光值，0D_M为与铅单元素标准 品孵育E. coli WMC-008p菌悬液的吸光度；RFUW = FW/0D_W，FW为与MilliQ级纯水孵育 E. coli WMC-008p菌悬液的背景荧光值，OD6tltlW为与MiIliQ级纯水孵育E. coli WMC-008p菌 悬液的吸光度；绝对焚光值（Absolutee fluorescence unit，AFU) :AFU = RFUM_RFUW，RFUM 为与铅单元素标准品孵育E. coli WMC-008p菌悬液的相对荧光值，RFUW为与MilliQ级纯 水孵育E. coli WMC-008p菌悬液的相对背景荧光值。 3. 3样品检测：用移液枪吸取E. coli WMC-008p CGMCC No. 9748过夜菌种子液加入到 含有终浓度为40mM MOPS缓冲成分的LB培养基中，使起始菌液0D_值为0. 5-0. 6,分装至 15 X 150_规格的无菌试管或康宁公司的96孔透明底黑色微孔板中，并在开始接菌时即加 入1/1000-1/100体积不同浓度的Pb 2+溶液或待检测环境水体样品，另加等体积无菌Mi 11 iQ H2O作为阴性对照，每种浓度或样品各做3个平行管或3个平行孔，37°C、250rpm振荡孵育 3h，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于Iml DB中，然后将重悬菌液稀释 20倍，混匀，分别测量其稀释液在激发波长为550nm，发射波长为570nm条件下的荧光值与 〇D_值。然后将测得的未知环境水体样品荧光强度值代入上述步骤3. 2所得方程，计算得 到未知环境水体样品中铅的浓度。4. 权利要求1所述一株大肠埃希氏菌WMC-OOSp的应用，其特征在于大肠埃希氏菌 WMC-008p检测菌株在检测环境水体中重金属铅的应用：在含有40mM MOPS缓冲成分的LB培 养基中，E. coli WMC-008p菌株对水体样品的pH值具有较强的抗干扰能力，并能应用于环 境水体样品中铅离子的检测。相对于原子吸收光谱法，E. coli WMC-008p菌株对pH值范围 为1. 5-12. 9的水体样品中pb2+的加标回收率为91% -109%，对温州医科大学附近工业废 水样品中Pb2+的加标回收率为87 % -116%。
【专利摘要】本发明提供一种检测重金属铅的大肠杆菌工程菌株的构建方法及其检测水体中铅方法的建立。本发明所述基因工程菌株为PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2/E.coliΔzntRΔzntA，命名为E.coli WMC-008p CGMCC No.9748，其中zntA和zntR基因发生缺失突变失活，来源于耐金属贪铜菌CH34株的pbr操纵子敲入表达红色荧光蛋白DsRed-express2。本发明所述工程菌株相比含报告质粒的大肠杆菌报告菌株具备操作简便、荧光本底值低、信号稳定等优势。本发明所述工程菌株能够反映水体中铅的生物有效性，将为客观评价水体中铅的生物毒性效应提供依据。CGMCC No.974820140929
【IPC分类】C12R1/19, C12Q1/68, C12Q1/02, C12N1/21, C12N15/70
【公开号】CN104946682
【申请号】CN201410842214
【发明人】吕建新, 严锡娟, 叶薇, 李江辉
【申请人】温州医科大学
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2014年12月24日