专利名称：一种快速检测重金属铅离子的免疫学方法与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明特别涉及一种快速检测重金属铅离子的免疫学方法与试剂盒，可用于环境 农产品中重金属铅离子残留快速检测。
背景技术：
近年来，由于工业废水、矿厂开发废弃物等的大量释放，造成了我国土壤和水体中 重金属污染物残留迅速增长，并直接影响到了农产品和水产品的质量安全。重金属元素可 在动物植物体内富集并通过食物链最终转移至人体。因误食含有重金属污染物残留的农产 品和水产品而造成人类中毒事件时有发生。这也表明，目前我们迫切需要对环境农产品和 水产品的质量进行长期有效的监测，以保证其食用安全性。传统上，环境农产品中重金属残留的检测技术主要依靠大型仪器，如原子吸收分 光光度法、电感耦合等离子体-原子发射光谱法、电感耦合等离子体质谱分析、原子荧光 光谱分析等，这些重金属检测方法虽然能精确测量样品中重金属含量，但检测相对费时、费 力、且费用昂贵，此外，这些方法需大量的样品预处理，并在大型分析设备上进行，需要专业 人员操作，难以应用于现场检测。由于上述的不足之处，检测的样品数一般会少于最佳检测 数量，导致在随后进行的重金属污染程度和风险的评估工作存在较大的不确定性，受污农 产品的监管也难以及时有效开展。重金属免疫检测技术，是采用人工制备的抗重金属抗体与抗原之间的免疫反应为 基础，通过酶联免疫系统信号放大作用，快速准确的表达所检样品中重金属含量。重金属免 疫检测技术在国外研究较早。自Reardan首次通过重金属_螯合剂复合物制备出单克隆抗 体以来，越来越多的抗重金属抗体被制备出来，并成功建立了相应的免疫监测系统。目前， 这一技术多采用间接竞争酶联免疫方法(IC-ELISA)。IC-ELISA用于检测重金属铅，虽然可 达到较高的检测水平，但是其成本过高(需要过量昂贵的螯合剂)，而很难真正应用于产品 生产当中。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种快速检测重金属铅 离子的的免疫学方法。本发明的另一目的在于提供实现所述免疫学方法的试剂盒。该发明的目的通过下述技术方案实现一种快速检测重金属铅离子的的免疫学方 法，包含以下步骤采用间接酶联免疫技术，即通过人工合成抗原包被无铅抗原结合样品中 的铅离子，形成含铅抗原；含铅抗原与抗铅单克隆抗体反应形成抗原-铅-抗体结构链；接 着再与酶标记的二抗反应，形成抗原-铅-抗体-二抗的结构链；然后通过显色反应，由显 色程度判断所检样品中的铅离子含量；所述的人工合成抗原指的是CHX-A”-DTPA-OVA，该人工合成抗原是由OVA(卵白蛋 白)偶联重金属螯合剂CHX-A”-DTPA，经室温振荡反应M小时候，采用超滤法纯化而得；
3
所述的抗铅单克隆抗体由保藏于中国典型培养物保藏中心(地址为中国湖北省 武汉市武汉大学内)、保藏日期为2010年8月25日、保藏编号为CCTCCC201084、名称为杂 交瘤细胞株6H8/4F7的单克隆细胞株制备得到；所述快速检测重金属铅离子的的免疫学方法，更具体包含以下步骤将人工合成抗原CHX-A”-DTPA-OVA包被于酶标板微孔内，加入量为100 400ng/ well ；接着封闭，再加入待检样品，于37°C反应至少5min，PBST溶液洗涤，再加入抗铅单克 隆抗体，每孔加入100 500ng，于37°C孵育至少30min ；再用PBST溶液洗涤，加入酶标记的 羊抗鼠IgG，加入量为每孔10 12. 5ng/Well，于37°C孵育至少30min后用PBST溶液洗涤， 再加入底物进行显色反应，根据显色的深浅对样品中铅离子含量进行定性和半定量分析；所述的封闭优选为使用质量百分比3%牛血清白蛋白(BSA)溶液进行封闭，于 37 °C 孵育 Ih ；所述PBST溶液的组成优选为由0. 01M、pH值为7. 4的PBS缓冲液与Tween-20按 体积比1000 0.5混合得到;所述抗铅单克隆抗体由保藏日期为2010年8月25日、保藏编号为CCTCCC201084、 名称6H8/4F7的单克隆细胞株制备得到；所述酶标记的羊抗鼠IgG优选为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG ；实现所述免疫学方法的试剂盒包含包被好人工抗原并封闭的ELISA酶标板、抗铅 单克隆抗体、酶标记的羊抗鼠IgG和底物，其中，人工抗原指的是CHX-A”-DTPA-OVA ；抗铅单 克隆抗体由保藏日期为2010年8月25日、保藏编号为CCTCC C201084、名称6H8/4F7的单 克隆细胞株制备得到；所述包被好人工抗原并封闭的ELISA酶标板优选通过以下步骤制备得到将人工 合成抗原CHX-A”-DTPA-0VA包被于酶标板微孔内，人工合成抗原CHX-A”-DTPA-OVA的加入 量为lOOng/well ；接着用质量百分比为3%的BSA封闭，于37°C孵育lh，于吸水纸上拍干， 用PBST溶液洗涤3次得到；所述PBST溶液的组成优选为由0. 01M、pH值为7. 4的PBS缓冲 液与Tween-20按体积比1000 0. 5混合得到；所述酶标记的羊抗鼠IgG优选为HRP标记的羊抗鼠IgG ；使用浓度优选为IOOng/ ml ο所述的底物优选为TMB (3，3' ,5,5'-四甲基联苯胺)显色底物，使用浓度优选为 100 150μ g/ml。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果(1)本发明首次将间接酶联免疫检测技术(I-ELISA)用于小分子检测中，不仅保 留了免疫检测技术的灵敏度和准确性，而且也达到了降低制造成本的目的，真正完成了将 ELISA技术应用于环境重金属铅残留的现场快速检测当中。(2)本发明首次成功制备出重金属铅酶联免疫检测试剂盒，并在实验水平下完成 了水样品检测检验，达到了现有铅离子检测水平。
图1是本发明可行性的检测结果图。图2是杂交瘤细胞株培养上清特异性实验结果。
图3是重金属铅离子免疫检测系统标准曲线。图4是重金属铅离子免疫检测试剂盒样品反应时间测定结果。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。实施例1用本发明所述的免疫学方法检测重金属铅离子(1)单克隆抗体溶液的制备①人工抗原的合成选择与小鼠亲缘关系较远的钥孔戚血蓝蛋白(KLH)作为免疫载体，选择卵白蛋白 (OVA)作为检测载体。1)母液配备A液称取12mg CHX_A”-DTPA(二乙基三胺五乙酸)溶于Iml纯水中，加热至60°C，
溶解；B液称取17mg Pb (NO3) 2溶于200 μ 1体积百分比2 %的稀硝酸中；C 液称取 IOmg OVA 溶于 ^nl HEPES (IOmM, ρΗ9· 0)中，置于 4°C ；D 液量取 850 μ 1 KLH (5. 8mg · ml—1)，置于 4°C保存备用。2)免疫抗原制备取30 μ 1步骤1) B液逐滴加入350 μ 1步骤1) A液中，室温振荡反应4h，得到半抗 原。将半抗原加入到D液中，并加入5 μ 1三乙胺，室温振荡反应过夜，得到免疫抗原。3)检测抗原的制备将步骤1)C液分装两支离心管，每支装1ml，标记为Cl和C2 ；每支管中均加入 350 μ 1步骤1) A液。再取30 μ 1 B液加入到Cl离心管中。将步骤2)和3)中获得的三组溶液均用HEPES缓冲液(10mM，pH9. 0)稀释 至:3ml，室温振荡反应过夜，得到检测抗原，其中离心管Cl中得到的是含铅检测抗原 OVA-CHX-A”-DTPA-Pb，离心管C2中得到的是无铅检测抗原CHX-A”-DTPA-0VA。②抗原纯化及鉴定步骤①中的免疫抗原和检测抗原的合成反应完成后需要进行小分子杂物及中间 产物分离，才能达到抗原的纯化目的。纯化后通过蛋白浓度的测定以及铅离子浓度的检测， 鉴定人工抗原是否合成成功。将获得的三组抗原分别装入超滤管(IOKD)中，加HEPES缓冲液(10mM，ρΗ9· 0)至 Hml，进行超滤，3000rpm、20min、4°C，洗五次。每次超滤后浓缩液和穿透液各取样待测。浓 缩液稀释至IOml取20 μ 1，再用HEPES缓冲液(10mM,pH9. 0)稀释至Iml ；穿透液加HEPES 缓冲液(IOmM, ρΗ9· 0)至 10ml，取 1ml。③小鼠免疫采用常规免疫方法操作将步骤②中纯化所得抗原用弗氏佐剂乳化，形成油包水 状物之后，选择5只5周龄，雌性，Balb/C小鼠进行腹腔免疫。所用的小鼠购自广东省实验 动物中心。首次免疫采用弗氏完全佐剂，之后均使用弗氏不完全佐剂进行乳化。
④抗血清检测收集步骤③进行免疫的小鼠血清后，采用间接ELISA检测小鼠抗血清，方法如下包被人工检测抗原OVA-CHX-A ”-DTPA-Pb 和 CHX-A”-DTPA-0VA，分别用 Na2CO3-NaHCO3 包被液(1M, ρΗ9· 6)稀释至 400ng · welF1,加样体积为 100 μ 1 · weir1 加 入包被板孔，保鲜膜封闭好，置于37°C温育Ih ；用干净吸水纸拍干，IM PBS洗涤3次， 200 μ 1 · Weir1jSOrpm,振荡 3min(下同)；质量百分比 3% BSA, 100 μ 1 · Weir1J0C 温 育Ih ；干净吸水纸拍干封闭液，不加洗涤直接加入血清样品，100μ 1 · ^11^371:温育 Ih ；0. 05 % 的 PBST (0. 01M, pH 7. 4 的 PBS 缓冲液 IOOOml+ 的 tween-200. 5ml)洗涤三次； 加入lOng/well酶标二抗(羊抗鼠IgG-HRP)后37°C温育Ih ；0. 05 %的PBST洗涤五次； 拍干孔内液体后，每孔加入100微升TMB底物，配方如下0. IM的柠檬酸8. 85ml+0. 2M的 Na2HPO4Il. 15ml 混合后，再加入 250 μ 1 TMB (6mg/ml)和 100 μ 1 H2O2 (30% )，37°C温育2min ； 然后加入IM H2SO4, 50 μ 1 · well、终止显色反应；酶标仪检测0D450。由以上抗血清检测结果中比较5只小鼠血清结合两组检测抗原的差异率，从中选 择差异最高的小鼠，即抗体含量高的小鼠，进行下一步实验。⑤动物细胞实验常规方法进行动物细胞采集选择一只8周龄未预处理的雌性Balb/C小鼠，采集 其腹腔巨噬细胞，作为细胞融合时的饲养细胞，提前3天采集并预种到96孔板内；融合前将 小鼠骨髓瘤细胞SP2/0离心，用无血清培养基清洗(800rpm，5min离心，弃上清。)后计数 待用；手术取下小鼠脾脏，两支Iml注射器反复吹打脾脏分离细胞，直至脾脏变白；收集到 的脾细胞用无血清培养基清洗(800rpm，5min离心，弃上清。)后计数待用。细胞融合方法 及单克隆杂交瘤细胞株筛选策略参考牛涛.重金属1 2+单克隆抗体的制备及时+的DTC 鳌合ELISA检测方法研究.暨南大学硕士学位论文.2005. 6。小鼠购自广东省实验动物中 心；小鼠骨髓瘤细胞SP2/0购自中国科学院上海细胞生物学研究所。将分泌此抗体的单克隆杂交瘤细胞株保藏于中国生物保藏中心，保藏日期为2010 年8月25日、保藏编号为CCTCC C201084、名称为6H8/4F7。此细胞株是由小鼠脾细胞与骨 髓瘤细胞融合后，筛选并克隆化获得的特异性分泌抗铅单克隆抗体的杂交瘤细胞株。⑥腹水型抗体的制备挑选5只健康的Balb/C小鼠(购自广东省实验动物中心)，腹腔注射不完全佐 剂0. 5ml。注射佐剂后三天，取对数生长期的杂交瘤细胞(即名称为6H8/4F7的单克隆细胞 株)，用无菌PBS洗1次，腹腔注射，每只小鼠每次注射约2 X IO6个细胞，0. 5ml PBS缓冲液 (0.01M, pH 7.4)。7天后腹水产生较充分(提起小鼠尾巴，可见小鼠腹部呈现方形)，收获 腹水。腹水收获工作要在无菌工作台上进行无菌操作。首先拉颈处死小鼠，浸泡在体积百 分比75%酒精中lOmin，然后转入塑料槽。提起小鼠腹壁，使与腹腔内腹水有一空间，在腹 壁剪开一小口，使塑料转移滴管刚好插入，腹水溢出。吸取腹水转入离心管。离心1500rpm， lOmin，用吸管小心去掉最上层脂肪层，收取中层腹水，存于4°C冰箱。留少量进行下一步实 验，其余分装冻存至-80°C。⑦单克隆抗体的纯化采用亲和层析试剂Protein-Α纯化腹水型单克隆抗体。将腹水IOOOOrpm离心20min后，去掉上层脂肪层，留腹水层，通过0. 45 μ 1微孔滤膜后备用。本实验采用的纯化试剂是以体积百分比为20%的乙醇溶液预胀的I^otein-A， 装柱前，用PBS缓冲液(0. 01M，pH 7. 0)洗去乙醇，并重悬Protein-A0小心装柱，吹去凝胶 中的气泡。装柱完毕，用2倍柱床体积的PBS平衡柱子。把处理好的腹水用PBS缓冲液稀 释后小心加入柱内，以每毫升ftOtein-A结合5mg蛋白计算。室温震荡反应证。保存流出 液，把流出液再上一次柱，使未结合的目的蛋白充分结合。用5 10倍柱体积的PBS缓冲 液洗柱子(洗去残余在柱子里的杂蛋白)，取2μ1洗出液用考马斯亮蓝液监控，至到流出液 不变蓝。用5倍柱床体积的甘氨酸(1Μ，ρΗ3. 0)洗脱柱子，流出液用含200 μ IlM Tris-HCl PH 9.0的1.5ml管接受，每管总体积到Iml左右。测定洗脱液浓度，在紫外^Onm测定OD 值，乘系数1. 43为蛋白IgG浓度，并用SDS-PAGE胶检测洗脱液蛋白的纯度，未降解IgG，分 子量为150KD左右，而降解的IgG的分子量为重链50KD和轻链25KD。洗脱下来的蛋白，进行脱盐后浓缩。本实验脱盐采用G-25脱盐柱分离盐离子。用 PBS缓冲液平衡柱子后，加入2. 5ml抗体溶液。待溶液流出时，除去前2. 5ml后开始接收 3.5ml。反复使用PBS清洗和平衡柱子。脱盐后的抗体溶液体积较大，需进一步浓缩。本实 验采用IOKD的超滤管浓缩抗体，3000rpm，10min。纯化后的抗体无杂蛋白干扰，通过采用 BCA试剂盒检测蛋白浓度来确定纯化后抗体浓度，并配合SDS-PAGE电泳图验证其纯度和浓 度。(2)制备包被好人工抗原并封闭的ELISA酶标板将Img双功能螯合剂 CHX-A"-DTPA(Macrocyclies)与5mg载体蛋白OVA偶联，加入3. 2 μ 1三乙胺，室温振荡反 应24h后超滤5次，获得人工检测抗原CHX-A”-DTPA-OVA溶液(参考文献M. Khosraviani, R. C. Blake II，A. R. Pavlov, S. C. Lorbach, H. Yu, J. B. Delehanty, Μ. W. Brechbiel, and D.A.Blake. Binding properties of a monoclonalantibody directed toward lead-chelate complexes. Bioconj. Chem.，2000，11 :267-277)。用 BCA 试剂盒(购自上海 博彩生物有限公司)检测蛋白浓度后，用Na2CO3-NaHCO3包被液(1M，pH9. 6)稀释至1 μ g/ πι1，100μ 1/well加入酶标板微孔中，37°C孵育1小时后拍干水分，PBS缓冲液洗三次。后加 入质量百分比为3%的BSA进行封闭，200μ l/well，37°C孵育lh。密封后转冻存于_20°C保 存备用。(3)间接免疫学检测在步骤(2)得到的ELISA酶标板中加入不同浓度的铅标准 溶液(不同浓度的铅离子标准溶液的配制过程如下母液为lmg/ml的标准品(购自国家钢 铁材料测试中心钢铁研究总院)，分别稀释为以下不同浓度(ng/ml) :0、1、2、5、10、20、50、 100、500、1000)，于 37 °C 孵育 30min，用 0. 05 % 的 PBST (0. 01M、pH 值为 7. 4 的 PBS 缓冲液 1000ml+Tween-200. 5ml混合)洗涤并在吸水纸上拍干，再加入与抗原等质量体积浓度剂量 的抗铅单克隆抗体溶液，37°C反应Ih后洗涤并在吸水纸上拍干，加入lOOng/ml的HR-羊抗 鼠IgG，37°C孵育30 45min后用0. 05%的PBST洗5 7遍；加入TMB显色底物(IOmlTMB 缓冲液加入150 μ g TMB, 100 μ 1 30% H2O2)。待室温显色反应进行^iin后加入50 μ 1 IM 的吐304进行终止。酶标仪读出450nm处的吸光度值，检验该检测系统的可行性。检测结果 如图1所示，此结果说明曲线线性关系良好，该系统可用于重金属铅离子检测。实施例2检测本发明所述免疫学方法的特异性将实施例1中的铅离子标准溶液换成不同浓度的Pb，Cd，Hg，Cr，Ca, Cu，Fe, Mn等重金属标准溶液(购自国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院)，采用相同方法操作，并读出 最终的OD45tl值，检验系统检测铅的特异性。检测结果如图2所示，此结果表明，该抗体是特 异性针对铅离子的，与其他重金属离子不存在交叉反应。实施例3绘制铅离子ELISA检测系统标准曲线在浓度为lOOng/well的抗原CHX-A” -DTPA-OVA包被板上加入不同浓度的铅离 子标准溶液(yg/L) : ο-\ιο-3,ιο-2,ιο-\ιο0αο\ιο2αο30在铅离子溶液和抗原37°C反应 后，加入确定浓度的抗铅单克隆抗体lOOng/well ；待反完成后加入酶标二抗IgG-HRP ；最后 加TMB底物显色(具体操作同实施例1)。送至酶标仪读取450nm处的吸光度值(0D450)。 以铅标准溶液浓度取对数作为横坐标，0D450值作为纵坐标，选择检测结果中线性段，绘制 检测铅标准曲线(如图3所示)。由结果中可得出，该系统有效检测铅离子范围为0.1 lOOng/ml。实施例4检验本发明所述检测方法精确度向待测纯水水样品中添加IO2UO1UOqUO-1P g · L—1四个水平的铅离子标准溶液， 然后采用间接酶联免疫检测方法进行检测。各样品中铅离子含量由同一酶标板制得的标准 曲线上求得，测得的数值与添加量的比值，获得样品添加回收率(表1)。样品添加回收率计算公式回收率(％ ) = C1ZC0X 100%公式中，C1 :ELISA检测OD值照标准曲线得出的样品浓度对数值；C0 纯水样品中铅离子理论浓度对数值。表 权利要求
1.一种快速检测重金属铅离子的的免疫学方法，其特征在于包含以下步骤采用间接 酶联免疫技术，即通过人工合成抗原包被无铅抗原结合样品中的铅离子，形成含铅抗原；含 铅抗原与抗铅单克隆抗体反应形成抗原-铅-抗体结构链；接着再与酶标记的二抗反应，形 成抗原-铅-抗体-二抗的结构链；然后通过显色反应，由显色程度判断所检样品中的铅离子含量；所述抗铅单克隆抗体由保藏日期为2010年8月25日、保藏编号为CCTCCC201084、名称 为6H8/4F7的单克隆细胞株产生。
2.根据权利要求1所述的免疫学方法，其特征在于所述的人工合成抗原指的是 CHX-A“ -DTPA-0VA,该人工合成抗原是由OVA偶联重金属螯合剂CHX-A” -DTPA，经室温振荡 反应M小时候，采用超滤法纯化而得。
3.根据权利要求2所述的免疫学方法，其特征在于所述免疫学方法，更具体包含以 下步骤将人工合成抗原CHX-A”-DTPA-OVA包被于酶标板微孔内，加入量为100 400ng/ well ；接着封闭，再加入待检样品，于37°C反应至少5min，PBST溶液洗涤，再加入抗铅单克 隆抗体，每孔加入100 500ng，于37°C孵育至少30min ；再用PBST溶液洗涤，加入酶标记的 羊抗鼠IgG，加入量为每孔10 12. 5ng/Well，于37°C孵育至少30min后用PBST溶液洗涤， 再加入底物进行显色反应，根据显色的深浅对样品中铅离子含量进行定性和半定量分析。
4.根据权利要求3所述的免疫学方法，其特征在于所述的封闭是使用质量百分比3% 的牛血清白蛋白溶液进行封闭，37°C孵育lh。
5.根据权利要求3所述的免疫学方法，其特征在于所述PBST溶液的组成为由0.01M、 PH值为7. 4的PBS缓冲液与Tween-20按体积比1000 0. 5混合得到。
6.根据权利要求3所述的免疫学方法，其特征在于所述酶标记的羊抗鼠IgG6为辣根 过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。
7.实现权利要求1 6任一项所述免疫学方法的试剂盒，包含包被好人工抗原并封闭 的ELISA酶标板、抗铅单克隆抗体、酶标记的羊抗鼠IgG和底物，其特征在于所述人工抗原 指的是CHX-A”-DTPA-0VA ；所述抗铅单克隆抗体由保藏日期为2010年8月25日、保藏编号 为CCTCC C201084、名称6H8/4F7的单克隆细胞株产生。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述包被好人工抗原并封闭的ELISA 酶标板通过以下步骤制备得到将人工合成抗原CHX-A”-DTPA-OVA包酶标板微孔内，加入 量为lOOng/well ；接着用质量百分比为3%的BSA封闭，于37°C孵育lh，于吸水纸上拍干， 用PBST溶液洗涤得到。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记的羊抗鼠IgG9为HR标记 的羊抗鼠IgG，浓度为lOOng/ml。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述的底物为3，3',5,5'-四甲基 联苯胺，浓度为100 150μ g/ml。
全文摘要
本发明公开了一种快速检测重金属铅离子的免疫学方法与试剂盒。该免疫学方法为间接酶联免疫技术，即通过人工合成抗原包被无铅抗原结合样品中的铅离子，形成含铅抗原；含铅抗原与抗铅单克隆抗体反应形成抗原-铅-抗体结构链；接着再与酶标记的二抗反应，形成抗原-铅-抗体-二抗的结构链；通过显色反应，由显色程度判断所检样品中的铅离子含量。实现该免疫学方法的试剂盒包含包被好人工抗原并封闭的ELISA酶标板和抗铅单克隆抗体，人工抗原指的是CHX-A”-DTPA-OVA；抗铅单克隆抗体由保藏日期为2010年8月25日、保藏编号为CCTCC C201084、名称6H8/4F7的单克隆细胞株产生。本发明首次将间接酶联免疫检测技术用于小分子检测中，检测效果好。
文档编号G01N33/577GK102128920SQ20101053982
公开日2011年7月20日 申请日期2010年11月11日 优先权日2010年11月11日
发明者包财, 江天久, 王晔, 秦超 申请人:暨南大学, 百奥泰生物科技(广州)有限公司