0080]
[0081]
[0082] PCR 反应条件如下：95°C 3min ;95°C 40sec，53°C 40sec，72°C 2min，35 个循环； 72°C 10min，4°C30min。产物以1.0%的Agarose凝胶电泳鉴定，如图8。PCR产物用纯化试 剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
[0083] 2· 4N 端同源臂与 PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed_express2 基因融合
[0084] PCR反应体系如下：
[0085]
[0086] 注：该表格中"N端同源臂PCR反应产物"和"PpbrA-pbrR-PpbrA :: DsRed-expresd"，基因 PCR反应产物"浓度相近，若浓度差别很大则按照mol比1 : 1。
[0087] PCR 反应条件如下：95°C 3min ;95°C 40sec，65°C 40sec，72°C 2min，8 个循环； 72°C 10min，4°C 30min。反应结束后再按照下表继续加入原PCR反应管，混匀。
[0088]
[0089] PCR 反应条件如下：95°C 3min ;95°C 40sec，55°C 40sec，72°C 3min，35 个循环； 72〇C 10min,4°C 30min〇
[0090] 2. 5C 端同源臂与 "N 端-PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed_express2" 基因融合参照步 骤 2. 4。
[0091] 实施例3.基因敲入片段的测序
[0092] 3. 1基因敲入片段加 A反应与纯化：PCR反应体系如下
[0093]
[0094] PCR反应条件如下：72°C、lh，4°C、30min。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加 适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
[0095] 3. 2目的片段与pMD19-T simple载体连接
[0096] 按TaKaRa公司的pMD19_T simpLe Vector试剂盒说明书进行T载体与目的基因 的连接，连接反应体系如下：
[0097]
[0098] 16?，连接过夜。
[0099] 3. 3 转化
[0100] 通过冷CaCl2法将连接产物转化入大肠埃希菌DH5 α感受态细胞中。
[0101] 3. 4 测序
[0102] 挑选一个经外侧引物PjP P 6PCR鉴定和质粒酶切鉴定正确的单克隆菌株送华大基 因有限公司测序，测序结果与NCBI上提供的标准参考序列比对。
[0103] 实施例4.目的片段与PKOV载体连接并实现敲入，如图3
[0104] 4. lpMD19T-zntA No_Ni-PpbrA-pbrR-PpbrA ： :DsRed-express2_zntA ci_c。质 粒的双酶切及酶切产物的回收：a).质粒的提取采用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 3.0 试剂盒小提质粒。b).pMD19T_zntA N()_Ni-PpbrA-pbrR-PpbrA:: DsRed-express2_zntA α_。。质粒的双酶切反应体系如下：
[0105]
[0106] 37°C，酶切 3h。酶切产物 zntA N()_Ni-PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed-express2_zntA α<。融合基因的切胶回收：酶切反应后产物行1%低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下 切割目的DNA片段，以TaKaRa公司胶回收试剂盒进行回收，最后以NaNoDrop2000核酸/蛋 白分析仪对回收产物定量。
[0107] 4. 2pKOV质粒的双酶切及酶切产物回收
[0108] 体系及酶切条件同 pMD19T_zntAN()_Ni-PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed-express2_zntA α_。。质粒，回收纯化载体片段。
[0109] 4. 3 打革巴载体 pKOV-zntA N()_Ni-pbrR-PpbrA-PpbrA : :DsRed-express2_zntA ci_c。的 构建及保存。
[0110] 4. 3. 1目的片断与载体的连接反应
[0111] 连接反应体系如下：
[0112]
[0113] 16°C，连接过夜（PpbrA-pbrR-PpbrA : ;DsRed_express2 片断与 pKOV 载体的摩尔 比为10 : 1)。
[0114] 4. 3. 2将连接好的产物转入E. coli AzntA AzntR感受态细胞中。
[0115] 4. 4阳性克隆的鉴定：
[0116] 4. 4. IPCR 鉴定
[0117] 用接种针挑取上述LB CM+平板上生长的单菌落少许分区划线接种于一个新的无 菌LBCM+平板上，30°C恒温培养箱中倒置培养10h。然后，用接种针分别挑取该LB CM+平板 上生长的单菌落少许，混于含50 μ 1无菌水的EP管中，沸水煮lOmin，12, OOOrpm离心3min 后，取上清按照下表加入PCR反应管中作为PCR鉴定模板，混匀。
[0118]
[0119] PCR 反应条件如下：94°C、lmin ;88°C、4min ;94°C 10sec，66°C 5min，25 个循环； 72°C10min，4°C保存。取5μ1产物以1.0%的Agarose凝胶电泳鉴定。电泳显示PCR片断 长度在2. Okb左右的单克隆被挑选出来，进行下面的质粒提取和双酶切鉴定。
[0120] 4. 4. 2质粒双酶切鉴定
[0121] 上述克隆质粒的中量提取如步骤4. 1。
[0122] 体系及酶切条件同 pMD19T_zntA N()_Ni-PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed-express2_zntA a_c。质粒。酶切反应后产物行I %低熔点琼脂糖凝胶电泳鉴定。酶切片断在2. Okb左右证 实打靶载体构建成功。菌种置-80°C保存，备用。
[0123] 4. 5pK0V_PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed_express2 整合到大肠埃希菌的基因组中
[0124] 取于 30°C孵育的 pKOV_zntAN()_Ni-PpbrA-pbrR-PpbrA : :DsRed-express2_zntACi_c。/ Δ zntA Δ zntR过夜菌液10 μ 1接种于42°C预热的含5ml CM/LB培养基的试管中，于42°C， 250rpm的恒温培养箱中振荡培养2h，然后分别取42°C孵育2h后的菌液20 μ 1分区划线接 种于3-4个42°C预热的LB CM+的平板上。待菌液完全吸收后，倒置于42°C恒温培养箱中 培养过夜。
[0125] 用接种针挑取经42°C孵育的LB CM平板上生长的单菌落少许分区划线接种于一 个新的42°C预热的LB CM平板上，42°C恒温培养箱中倒置培养10h。然后，用接种针分别 挑取该LB CM平板上生长的单菌落少许，混于含50 μ 1无菌水的EP管中，沸水煮lOmin， 12, OOOrpm离心3min后，取上清15 μ 1加入200 μ L PCR反应管中作为PCR鉴定模板。PCR 反应体同何表13。
[0126] PCR 反应条件如下：94°C、lmin ;88°C、4min ;94°C、10sec，66°C、5min，25 个循环； 72°C、10min，4°C保存。取5 μ 1产物以1. 0%的Agarose凝胶电泳鉴定，PCR产物为两条带， 其亮度相当，约500bp和2000bp左右的长度，证明已经发生了第一步同源重组，片断及质粒 已经整合到基因组上。
[0127] 4. 6pK0V质粒与基因组分离并丢失
[0128] 选取一株第一步同源重组成功的菌株于42°C孵育过夜培养的菌液50 μ 1接种于 30°C预热的5ml含5%蔗糖的LB培养液的试管中，于30°C，250rpm的恒温培养箱中振荡培 养2h，然后分别取30°C孵育a后的菌液进行十倍系列稀释，选取10 2、103、IO4三个稀释梯 度的菌液各0.1 ml分别涂布于30°C预热的含5%蔗糖的LB平板上。待菌液完全吸收后，倒 置培养皿，30 °C过夜。
[0129] 4. 6. 1氯霉素（CM)平板的负筛选
[0130] 用接种针挑取30°C、5%蔗糖LB平板上生长的单菌落，分区划线接种于一个LB CM 平板和5%蔗糖LB平板上，30°C恒温培养箱中倒置培养过夜。
[0131] 4.6. 2基因敲入阳性菌株的PCR鉴定
[0132] 挑取在5 %蔗糖LB平板上生长，对应于CM/LB平板上不生长的单菌落做菌落PCR 鉴定，PCR反应体系同表13,取5 μ 1产物以1. 0%的Agarose凝胶电泳鉴定，PCR产物约为 2000bp的菌落初步证实为已经发生基因敲入的阳性菌落。分纯菌落，PCR进一步鉴定证实 基因敲入成功。并置于-80 °C保存，备用。
[0133] 实施例5.生物检测菌株检测水体中重金属铅方法学的建立
[0134] 5.1培养基的配制：
[0135] lg/L胰蛋白胨、0. 5g/L酵母膏、lg/L NaCl，先加50ml MilliQ H2O,振荡至完全 融解后加 MilliQ H2O定容至80ml，高压蒸汽灭菌121 °C，30min，再加入IOml 400mM无菌 MOPSpH 7. 2缓冲液，混匀。
[0136] 5. 2标准曲线的制定：
[0137] 用移液枪吸取E. coli WMC-008p过夜菌种子液加入到50ml含终浓度为40mmol/ L的MOPS新鲜按步骤5. 1所配的LB液体培养基中，使起始菌液0D_值约为0. 5-0. 6,分装 Iml/管，加入等体积不同浓度的Pb2+溶液至各管菌液，使其终浓度分别为0. 05、0. 25、0. 50、 L 00、5· 00、7· 50、KX 00、12. 50、15. 00 μmol/L，另加等体积无攻 MilliQH2O 作为阴性对照。 每种浓度各做3个平行管。将以上菌液于37°C，250rpm振荡培养3h后，4, OOOrpm，水平离 心10min，弃上清，收获的菌体重悬于Iml DB中，稀释20倍后分别测量其稀释液荧光值与 〇D_值，实验结果为三次平行实验的平均值土SD值，得到的方程为y = 46. 279X-97. 972 (R =0· 97) 〇
[0138] 5. 3样品检测：
[0139] 用移液枪吸取E. coli WMC-008p过夜菌种子液加入到含有终浓度为40mM MOPS 缓冲成分的LB培养基中，使起始菌液0D_值为0. 5-0. 6,分装至15 X 150mm规格的无菌试 管Iml/管或康宁公司的96孔透明底黑色微孔板中，并在开始接菌时即加入1/1000-1/100 体积不同浓度的Pb 2+溶液或待检测环境水体样品，pH值范围为1. 5-12. 9,另加等体积无菌 MilliQ H2O作为阴性对照，每种浓度或样品各做3个平行管或3个平行孔，37°C、250rpm振 荡孵育