用于表达qc的重组载体及其制备方法、引物、基因工程菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于表达QC的重组载体及其制备 方法、引物、基因工程菌。
【背景技术】
[0002] 谷氨酰胺酰基环化酶（Glutaminylcyclase，QC，EC2. 3. 2. 5)是一种可以催化多 肽、蛋白等N端谷氨酰胺残基分子内环化反应生成焦谷氨酸（pGlu)的酶，具有改变蛋白等 N端化学结构、调节活性、增强稳定性等重要生物学功能。
[0003] 1963年，QC首次在热带植物番木瓜（Carica papaya)乳胶中发现，后研宄证实， QC在植物、动物、微生物中均有分布。但在植物中，QC的生理功能并不十分明确，可能在植 物防御病原微生物过程中有一定的作用。植物、动物中的QC酶动力学行为均符合米氏方程 (Mechaelis-Menten)，且对底物N端部位L-谷氨酰胺具有严格的特异性。哺乳动物QC具 有高度保守性，与番木瓜QC之间没有任何序列同源性，而与细菌氨肽酶具有显著的序列同 源性，故动物和植物QC具有不同的进化起源。
[0004] 随着人类社会年龄结构老龄化的不断发展，老年痴呆发病率迅速升高。阿尔茨海 默病（Alzheimer' s disease，AD)是一种常见的神经退行性疾病，是老年痴呆的主要形式， 流行病学调查显示，AD患者超过老年痴呆患者总数的65%以上。日前，AD发病率日趋升高， 已成为仅次于心脑血管疾病和肿瘤的第三大世界性健康问题。
[0005] AD主要临床症状包括进行性记忆和认知功能障碍等，目前尚无特效治疗药物。AD 发病机制复杂，经过一百多年的研宄，人们提出了一些不同的假设，如AD相关蛋白质的缠 结及聚集、氧化应激、生物金属离子稳态失衡、线粒体功能衰竭等，然而，确切机理并不明 了。AD病理学特征主要是脑部神经元外部的β -淀粉样蛋白沉淀和神经元内部的过度磷酸 化Tau蛋白缠结等。β-淀粉样蛋白（Αβ)是老年斑的主要成分，根据Αβ级联学说，Αβ 的过量产生和聚集、沉淀被认为与AD发病及进展有直接关系。Αβ是β-淀粉样前体蛋白 (APP)经β -分泌酶和γ -分泌酶水解所得片段产物，如A β 42/Α β 40。体外研宄等显示， Αβ过量表达和聚集、沉淀可以直接导致线粒体紊乱、氧化应激、神经突触传递中断、轴突运 输中断、膜完整性受损破裂等多种AD相关病理变化。
[0006] 近年，多项体内和临床研宄共同证实，区别于正常老年人脑部的老年斑沉淀，AD患 者脑部老年斑沉淀的主要成分并非A β蛋白，而是多种变异的A β蛋白，特别是N端3-位 谷氨酰胺残基分子内环合的PGlu-A β，包括pGlu-A β 42/pGlu-A β 40，含量超过50 %。 pGlu-Αβ具有更强的稳定性、更快的聚集沉淀速度、更强的神经毒性，且其产生与AD临床 症状的广生直接相关。这为AD相关研宄提供了新的线索。相关研宄的进一步株入表明， pGlu-Αβ是QC作用的产物。QC特异性高表达是AD发病早期的特异性病变，是AD发病、发 展的关键促进因素，选择性抑制QC活性可显著抑制pGlu-A β的产生和老年斑沉淀的形成， 并明显改善认知、记忆功能损伤等AD症状。因此，QC为AD病理及病因性创新抗AD药物研 宄开启了新的研宄方向。
[0007] QC酶蛋白是相关研宄的必须原材料，其品质对QC作用机制和抑制剂研宄具有重 要影响。QC的获得可通过天然物中活性QC的分离制备和采用基因工程技术制备重组QC两 种方法实现。提取分离方法受天然物中QC含量较低、提取成本高、批次稳定性差、酶活性损 失严重等不足，在推广应用方面有较大的限制。相比之下，基因工程技术制备重组QC是较 容易实现的一种活性QC制备方法。目前，已有报道称可通过E. coli表达制备重组QC，但 方法上存在一定缺陷，制备表达量低、酶活性差、步骤繁多等。可见，一种新的，可高效、快捷 制备高活性重组人QC的方法的建立，对QC相关机理研宄、QC抑制剂类抗AD新药研宄及QC 表达异常相关疾病临床诊断等都具有极为重要的科学意义和应用价值。
【发明内容】
[0008] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于表达QC的重组载体 及其制备方法、引物、基因工程菌，提供一种可以高效、快捷制备高活性人谷氨酰胺酰基环 化酶的制备途径。
[0009] 本发明的技术方案如下：
[0010] 一种用于表达QC的重组载体的制备方法，其中，包括以下步骤：
[0011] 采用PCR技术，以上游引物SEQ ID NO. 1和下游引物SEQ ID NO. 2为引物对，扩增 得到QC33_361基因片段；其中，上游引物为5' -ACCTGGATCCGCTTCTGCTTGGCCGG-3' ；下游引物 为 5' -TATCCTCGAGTTACAGGTGCAGGTATTC-3' ；
[0012] 将QC33_361基因片段连接到表达载体上，获得用于表达QC 33_361的重组载体。
[0013] 所述的用于表达QC的重组载体的制备方法，其中，将QC33_361基因片段连接到表达 载体的过程包括以下步骤：
[0014] 对载体pET28a和pET32a，分别进行EcoRI、XhoI双酶切；将两端同样存在EcoRI、 XhoI位点的线性化载体进行连接，获得改造后的pET32a载体；
[0015] 对QC33_361基因片段和改造后的pET32a载体进行BamHI和XhoI双酶切，将两端同 样存在BamHI、XhoI位点的QC 33_361基因片段和线性化载体进行连接。
[0016] 一种用于表达QC的重组载体，其中，所述用于表达QC的重组载体中包含QC33_ 361基 因片段，其核苷酸序列SEQ ID NO. 4所示。
[0017] 所述的用于表达QC的重组载体，其中，采用如上所述的制备方法制备得到。
[0018] 一种基因工程菌，其中，含有如上所述的用于表达QC的重组载体。
[0019] 所述的基因工程菌，其中，所述基因工程菌的菌种为大肠杆菌DH5a或者大肠杆 菌 BL21(DE3)。
[0020] 一种引物，其中，所述引物用于扩增得到QC33_361基因片段，其中，上游引物为5'-AC CTGGATCCGCTTCTGCTTGGCCGG-3' ；下游引物为 5' -TATCCTCGAGTTACAGGTGCAGGTATTC-3'。
[0021] 有益效果：本发明提供一种用于表达人谷氨酰胺酰基环化酶的重组载体，可用于 高效、快捷制备高活性重组人qc 33_361酶。将该载体转化到受体细胞中，可用于合成人谷氨酰 胺酰基环化酶。合成得到的人谷氨酰胺酰基环化酶qc 33_361为具有显著催化底物分子内谷氨 酰胺酰基环化反应的活性，可以高效催化蛋白（多肽）N端谷氨酰胺酰基的分子内环合反应 生成焦谷氨酸化的产物。合成得到的人谷氨酰胺酰基环化酶QC 33_361可用于QC抑制剂、激动 剂、诘抗剂等的筛选发现、QC相关作用机制研宄、QC检测相关试剂盒的开发、QC尚表达相关 疾病的检测诊断等。
【附图说明】
[0022] 图1是本发明QC重组表达载体的构建示意图。
[0023] 图2是本发明实施例1中QC33_361基因 PCR扩增结果。
[0024] 图3是本发明实施例1中重组质粒pET32a/QC33_361的双酶切鉴定结果。
[0025] 图4是本发明实施例4中QC33_361蛋白的表达纯化过程中的SDS-PAGE分析结果。
[0026] 图5是本发明实施例4中所得QC33_361蛋白质谱分析比对结果。
[0027] 图6是本发明实施例5中QC33_361酶活性测试原理示意图
[0028] 图7是本发明实施例5中QC33_361双倒数拟合曲线图。
【具体实施方式】
[0029] 本发明提供一种用于表达人谷氨酰胺酰基环化酶的重组载体及其制备方法，为使 本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解， 此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0030] 本发明利用人谷氨酰胺酰基环化酶QC33_361，是EC2. 3. 2. 5全长蛋白的一个片段，从 GenBank检索出人脑垂体QC的cDNA序列，结合pET32a载体的特点，用软件Oligo设计一 对特异性引物，扩增得到QC酶的基因序列，并将其插入pET32a载体上，构建得到可以用于 表达人谷氨酰胺酰基环化酶的重组载体。并且，将该载体转化到受体细胞中，可用于合成人 谷氨酰胺酰基环化酶。合成得到的人谷氨酰胺酰基环化酶QC 33_361为具有显著催化底物分子 内谷氨酰胺酰基环化反应的活性，可以高效催化蛋白（多肽）N端谷氨酰胺酰基的分子内环 合反应生成焦谷氨酸化的产物。合成得到的人谷氨酰胺酰基环化酶QC 33_361可用于QC抑制 剂、激动剂、拮抗剂等的筛选发现、QC相关作用机制研宄、QC检测相关试剂盒的开发、QC高 表达相关疾病的检测诊断等。其中，所述人谷氨酰胺酰基环化酶QC 33_361的氨基酸序列为：
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