抗gfap单克隆抗体可变区序列及其制备方法

专利名称：抗gfap单克隆抗体可变区序列及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及抗GFAP单克隆抗体可变区序列及其制备方法。
背景技术：
胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是一种由中央神经系统星形胶质细胞特异表达的中间纤维蛋白，在细胞间信号传导及脑血屏障功能中发挥重要作用。GFAP在细胞有丝分裂过程中表达水平提高，与有丝分裂时细胞内纤维网增多相适应。有研究表明GFAP基因敲除小鼠髓磷脂变异，脑血屏障结构功能严重损伤。GFAP表达 水平异常与多种遗传病和精神病相关，如亚历山大病、唐氏综合症、精神分裂症、情感型双极性疾患和抑郁症。此外，急性感染和神经性退行病变时，GFAP表达水平会降低。在一项研究中，运用体外肺膜治疗的22位儿童患者中，GFAP水平高的患者比GFAP水平正常的患者的死亡可能性高13倍，脑损伤的可能性高11倍。目前，GFAP表达水平已经作为中风、脑外损伤、星形细胞源性胶质瘤等多种疾病的诊断标志之一。GFAP抗体仅识别星形胶质细胞，而不识别神经细胞、成纤维细胞、少突胶质细胞以及肿瘤细胞等其它类型的细胞。因此GFAP抗体被广泛用于星形胶质细胞的免疫染色鉴定。此外，GFAP抗体已应用于ELISA法定量测定人血清、血浆、脑脊液、细胞培养上清或其它相关生物液体中GFAP含量。免疫组化研究中发现，在正常乳腺和良性乳腺病变组织中，有部分肌上皮细胞(MEC)表达GFAP，而乳腺原位癌中残存的MEC不表达GFAP ;在乳腺原位癌和侵润性癌中，各种癌细胞均不表达GFAP ;在乳腺的各种良性病变中，部分上皮细胞(EC)和间质的肌纤维母细胞可以表达GFAP，但是在乳腺癌的间质中，即使间质纤维化很严重，肌纤维母细胞也不表达GFAP。GFAP的免疫组化染色有助于癌细胞与良性增生的上皮细胞和肌上皮细胞的鉴别，而且在小管癌中有助于癌性小管(阴性)和良性增生性小管(阳性)的鉴别。

发明内容
如上所述，对GFAP在生物技术和医药病理等方面的的分析研究越来越多，基于这一背景，本发明的目的是构建抗GFAP单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列和轻链可变区的核苷酸序列，同时提供制备上述核苷酸序列的方法。为实现上述目的，本发明用GFAP蛋白作为抗原，免疫小鼠后，经检测得到相应抗体表达呈阳性的小鼠，取表达呈阳性小鼠的脾脏，分离脾细胞后，融合脾细胞和骨髓瘤细胞，在HAT培养基中培养后，检测得到抗体表达阳性克隆，提取阳性杂交瘤细胞总RNA，以总RNA中的mRNA为模板，反转录得到相应抗体基因的cDNA，再通过PCR扩增获得相应抗体重链可变区和轻链可变区，由此实现本发明。本发明提供了下述各项:抗GFAP单克隆抗体可变区序列，包含两种核苷酸序列，所述核苷酸序列分别为CM10330-VH和 CM10330-VL。优选地，所述核苷酸序列CM10330-VH和CM10330-VL由保藏号为180CT3.1.5的杂交瘤细胞株制备而成。优选地，所述01110330^编码114个氨基酸，分子量为12651D，其中⑶R1XDR2和CDR3 的区域相应地分别为 26aa-33aa，51aa_58aa 和 97aa_103aa。优选地，所述CM10330-VL编码108个氨基酸，分子量为12101D，其中CDR1、CDR2和CDR3 的区域相应地分别为 27aa_32aa，50aa_52aa 和 89aa_97aa。优选地，还包括与上述两种核苷酸序列具有相同氨基酸序列产物的核苷酸序列。优选地,还包括经过一个或者几个碱基替换、缺失或添加后仍具有与所述核苷酸序列产生的氨基酸序列具有相同活性的核苷酸序列。制备所述的抗GFAP单克隆抗体可变区序列的方法，包括以下步骤:(I)杂交瘤细胞的制备:首先用GFAP蛋白抗原免疫雌性健康的BALB/c小鼠，挑选出免疫后抗体表达呈阳性的小鼠，取其脾脏细胞，然后将分离的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞；(2)单克隆细胞的筛选:将上述杂交瘤细胞在HAT培养基中培养，对ELISA检测呈阳性的单克隆细胞进行ELISA复筛，然后将筛选出的ELISA阳性单克隆细胞进行WB复筛，再将WB阳性细胞进行亚克隆，经过2次亚克隆，筛选出能够稳定分泌抗体的单克隆细胞，将阳性的单克隆细胞扩大培养后定株、冻存；(3)杂交瘤细胞抗GFAP单克隆抗体的获得:首先鉴定步骤(2)所制备的单克隆细胞的亚类亚型，然后将阳性的单克隆细胞注射到小鼠体内进行腹水生产，再将产生的腹水通过层析纯化后得到抗GFAP单克隆抗体；(4)抗GFAP单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆:提取步骤(3)中所用的单克隆细胞的总RNA，以总RNA中的mRNA为模板，反转录得到cDNA，最后克隆得到抗GFAP单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。本发明提供了抗GFAP单克隆抗体可变区序列，及其克隆测序方法，其可用于用于制备重组抗体、ScFv抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、单域抗体等；GFAP表达水平可以用来判断中风、脑外损伤、星形细胞源性胶质瘤等多种疾病，抗GFAP被广泛用于星形胶质细胞的免疫染色鉴定中。


图1、183CT3.1.5克隆抗体的免疫印迹实验图；其中1-5 条带分别表示 8ug/ml, 4ug/ml, 3ug/ml, lug/ml, 0.5ug/ml, 表示阴性
血清，“ + ”表示阳性血清，最右边是腹水。图2、183CT3.1.5克隆抗体可变区VH和VL的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图分析结果图；其中泳道I 为VH基因，泳道2为VL基因，泳道3为DL2000DNAMarker。图3、183CT3.1.5克隆抗体可变区VH和VL目的片段构建到pMD18_T载体上酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图；其中泳道I 为 pMD18-T/VH，泳道 2 为 pMD18_T/VL，泳道 3 为 DL2000DNAMarker。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明做进一步描述:实施例1.抗GFAP单克隆抗体的制备与鉴定1、杂交瘤细胞制备(I)动物免疫:以GFAP蛋白抗原同时免疫3只6-8周龄的雌性健康的BALB/c小鼠，3次免疫后，每周采血一次，选择1:4000稀释时ELISA检测OD值大于1.0的血清，同时血清WB检测呈阳性的BALB/c小鼠用于融合，并且在融合之前的3天，用不加佐剂的抗原腹腔加强免疫注射，注射剂量为50ug/只。(2)收集B淋巴细胞:追加免疫后3天，取小鼠血液，将血液离心，其中血清留作阳性对照；然后在无菌条件下取小鼠脾脏，将脾脏放在IOml预温不完全培养基中，剥去周围结缔组织，置于100目不锈钢网中，用注射器的内芯研磨，边研磨边滴加不完全培养基冲洗；收集过滤后的细胞悬液于离心管中，离心后弃上清液，用不完全培养基悬浮细胞，取I X IO8个细胞，置于室温下待用。(3)小鼠骨髓瘤细胞的制备:融合前10天，将骨髓瘤细胞从液氮中取出，迅速放A 37°C水浴中，在Imin内使冻存液完全溶解；然后离心并弃上清液，再置于MDM完全培养基中，在37°C，5%C02的条件下培养；融合前2-3天，细胞应处于对数生长期。融合前将对数生长期小鼠骨髓瘤细胞收集到离心管中，计数，取2X 107-3X 107个细胞，离心弃上清液，用不完全培养基悬浮细胞，置室温 待用。(4)细胞融合:融合前将50%PEG置37°C，5%C02细胞培养箱中调整温度，将2X 107-3X 107个骨髓瘤细胞悬液和IX IO8个脾脏B淋巴细胞悬液移至一个50ml离心管中，补加30ml不完全培养基,在转速1200rpm的条件下离心IOmin,弃去上清液,轻轻弹击管底，使细胞团松散，均匀转动离心管的同时加入Iml预温的PEG融合剂，该过程控制在60s内，加完后轻摇离心管30s,再静置60s,然后立即加入20ml不完全培养液,具体加法是第一分钟加lml，第二分钟加4ml，随后的三分钟之内将剩余液体加完，使PEG稀释而失去促融作用；在37°C水浴中静置IOmin后，1200rpm,离心lOmin，弃去上清，加入含有HAT的完全培养基，制成细胞悬液，铺到96孔细胞培养板上，置37°C，5%C02细胞培养箱中。(5)单克隆细胞的筛选:融合的杂交瘤细胞在HAT培养基中存活和增殖；在37°C，5%C02细胞培养箱中培养7-10天；用抗原包被酶标板在37°C下包被2h，然后用2%BSA封闭；吸取96孔板中生长克隆的细胞上清液加到封闭好的酶标板中，37°C孵育Ih ;洗涤5遍后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育Ih ;洗涤后加入TMB显色液，然后加2M硫酸终止反应，在酶标仪上进行读数；将ELISA检测阳性的克隆挑入24孔细胞培养板培养，3天后进行ELISA复筛，将筛选出的ELISA阳性克隆进行WB复筛，WB阳性细胞进行亚克隆，经过2次亚克隆，筛选出能够稳定分泌抗体的单克隆细胞，将阳性的单克隆扩大培养后定株、冻存。2、杂交瘤细胞抗GFAP单克隆抗体的获得与生物学鉴定(I)单克隆抗体的获得:将定株的单克隆细胞的细胞上清液用美国BD公司MouseMonoc lonal Antibody Isotyping Kit鉴定单抗的亚类亚型,然后将阳性的单克隆细胞注射到小鼠体内进行腹水生产，生产的腹水通过层析纯化后的得到抗体。(2)ffestern blot检测抗体的特异性:取已处理的细胞裂解液，在凝胶上进行垂直SDS-PAGE, 120v90min,电泳结束后，取下凝胶，置于PVDF膜上，将蛋白用半干法转染到PVDF膜上，IOv, 120min ;将转印后的PVDF膜在5%脱脂奶粉中室温封闭2h ;将抗体溶解于3ml封闭液中，4°C过夜；用洗涤液洗涤3次，每次5min，用封闭液来稀释HRP标记的羊抗鼠IgG，室温下孵育2h ;再用洗涤液洗涤3次，将化学发光试剂加到PVDF膜上，到暗室曝光到X胶片上，通过显影和定影，将结果反映在胶片上；扫描胶片，分析结果，其结果参照图1。(3)单克隆抗体亲和常数测定:用包被液将抗原稀释，分别加入酶标板，100微升/孔，370C 2h，PBS洗涤5次，拍干；加2%BSA封闭液200微升/孔，4°C过夜，洗涤5次，拍干；将抗体从4ug/ml开始进行梯度稀释后加入到包被好的酶标板中，100微升/孔，37°C lh，洗涤5次，拍干；加入HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，工作液100微升/孔，370C Ih,洗涤5次，拍干；加入TMB显色液，37°C反应5-10min，加终止液50微升/孔，立即在酶标仪上以450nm波长测定OD值，按照公式计算出单克隆抗体亲和常数。3、抗GFAP单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆所用细胞株为采用上述方法获得的能分泌高亲和力、高特异性的抗GFAP的杂交瘤细胞株，对应的保藏编号分别 为183CT3.1.5，其分泌的抗体分子亚型为IgG2b。取对数生长期的183CT3.1.5杂交瘤细胞(2X 106)，用QIAGEN公司的试剂盒RNeasy Mini Kit(货号:QIAGEN_74106)提取总RNA，取少量用nanodrop定量及1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测，随后用 Superscript.1IIFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒(货号:Invitrogen-18080-051)反转录cDNA,用特异引物扩增抗GFAP抗体基因的轻链或重链可变区。将含有相应重链可变区或轻链可变区片段的PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳，切胶分离目的片段。通过胶回收试剂盒(捷瑞-GK2042)纯化目的产物后，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定目的片段的纯度。之后，将回收得到的相应重链可变区和轻链可变区克隆至测序载体，送测序公司测序，对测序结果进行同源性和结构分析。(I)引物设计:根据IgG可变区的序列，在信号区和恒定区合成5’和3’端引物用于扩增GFAP抗体重链可变区，引物序列如下:VHF (5，-ACTAGTCGACATGGVTTGGSTGTGGAMCTTGCYATTCCT-3’)，含有 Sal I 酶切位占.
VHR (5，-00^六6(:170^6661 0^1 1 6六1六狀(:161^^-3’)，含有把11(1111酶切位点。根据IgG可变区的序列，在信号区和恒定区合成5’和3’端引物用于扩增GFAP抗体轻链可变区，引物序列如下:LHF (5，-ACTAGTCGACATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT-3’)，含有 Sal I 酶切位占.
LHR (5，-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGA-3’)，含有 Hind III酶切位点。(2)杂交瘤细胞总RNA提取用QIAGEN公司的试剂盒(货号:74106)提取总RNA，具体步骤如下:收集对数生长期杂交瘤细胞183CT3.1.5，2\106个，800印111离心51^11，去上清，沉淀即细胞，保存于_80°C，或直接用于RNA提取；细胞样品中加入350 u LRTL溶液，涡旋30s ；向上述体系中加入70%乙醇，用Iml移液枪轻轻吹打均匀；
将上述体系混合液转入RNeasy spin column，8000xg离心15s，去滤液；向上述RNeasy spin column中各加入700 u LRWl溶液，8000xg离心15s，去滤液；向上述RNeasy spin column中各加入500 u LRPE溶液，8000xg离心15s，去滤液；向上述RNeasy spin column 中各加入 500 u LRPE 溶液，8000xg 离心 2min，去滤液；将RNeasy spin column换到无RNA酶的2ml收集管中，全速离心Imin ；将RNeasy spin column 换到无 RNA 酶的的 1.5mlEP 管中，加入 30-50 U L 无 RNA酶的 H20，8000xg 离心 lmin，洗脱 RNA。(3)反转录 PCR用Invitrgen 的 RT-PCR 第一链合成 SuperScript.1II 试剂盒(货号 18080-051)，以杂交瘤细胞总RNA为模板，反转录cDNA，具体步骤如下:引物与模板变性:按表1，配成10 U LA体系，放置65°C水浴中加热5min，随后冰浴中放置lmin，让引物与RNA模板充分结合。表I
权利要求
1.抗GFAP单克隆抗体可变区序列，其特征在于，包含两种核苷酸序列，所述核苷酸序列分别为 CM10330-VH 和 CM10330-VL。
2.根据权利要求1所述的抗GFAP单克隆抗体可变区序列，其特征在于，所述核苷酸序列CM10330-VH和CM10330-VL由保藏号为180CT3.1.5的杂交瘤细胞株制备而成。
3.根据权利要求1所述的抗GFAP单克隆抗体可变区序列，其特征在于，所述CM10330-VH编码114个氨基酸，分子量为12651D，其中⑶R1XDR2和⑶R3的区域相应地分别为 26aa_33aa, 51aa_58aa 和 97aa_103aa。
4.根据权利要求1所述的抗GFAP单克隆抗体可变区序列，其特征在于，所述CM10330-VL编码108个氨基酸，分子量为12101D，其中CDR1、CDR2和CDR3的区域相应地分别为 27aa_32aa, 50aa_52aa 和 89aa_97aa。
5.根据权利要求1所述的抗GFAP单克隆抗体可变区序列，其特征在于，还包括:与上述两种核苷酸序列具有相同氨基酸序列产物的核苷酸序列。
6.根据权利要求5 所述的抗GFAP单克隆抗体可变区序列，其特征在于，还包括:经过一个或者几个碱基替换、缺失或添加后仍具有与所述核苷酸序列产生的氨基酸序列具有相同活性的核苷酸序列。
7.制备权利要求1至6任意一项所述的抗GFAP单克隆抗体可变区序列的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)杂交瘤细胞的制备:首先用GFAP蛋白抗原免疫雌性健康的BALB/c小鼠，挑选出免疫后抗体表达呈阳性的小鼠，取其脾脏细胞，然后将分离的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞； (2)单克隆细胞的筛选:将上述杂交瘤细胞在HAT培养基中培养，对ELISA检测呈阳性的单克隆细胞进行ELISA复筛，然后将筛选出的ELISA阳性单克隆细胞进行WB复筛，再将WB阳性细胞进行亚克隆，经过2次亚克隆，筛选出能够稳定分泌抗体的单克隆细胞，将阳性的单克隆细胞扩大培养后定株、冻存； (3)杂交瘤细胞抗GFAP单克隆抗体的获得:首先鉴定步骤(2)所制备的单克隆细胞的亚类亚型，然后将阳性的单克隆细胞注射到小鼠体内进行腹水生产，再将产生的腹水通过层析纯化后得到抗GFAP单克隆抗体； (4)抗GFAP单克隆抗体重链和轻链可变区基因的克隆:提取步骤(3)中所用的单克隆细胞的总RNA，以总RNA中的mRNA为模板，反转录得到cDNA，最后克隆得到抗GFAP单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区。
全文摘要
抗GFAP单克隆抗体可变区序列，包含两种核苷酸序列，所述核苷酸序列分别为CM10330-VH和CM10330-VL。用GFAP蛋白作为抗原，免疫小鼠后，检测得到相应抗体表达呈阳性的小鼠，分离其脾细胞后，融合脾细胞和骨髓瘤细胞，在HAT培养基中培养后，检测得到抗体表达阳性克隆，提取阳性杂交瘤细胞总RNA，以总RNA中的mRNA为模板，反转录得到相应抗体基因的cDNA，再用特异引物PCR获得相应抗体重链可变区和轻链可变区，并进行克隆和测序。
文档编号C12N15/13GK103173458SQ20131006671
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月4日 优先权日2013年3月4日
发明者吴纯, 李静文, 邹建炫, 汪伟, 杨春花, 周延庆, 李顺玲, 孙其玲, 洪扬, 陈媛 申请人:百奇生物科技(苏州)有限公司