专利名称：一种链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程和现代酶工程技术领域，具体是一种链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用。
背景技术：
海藻糖是由两分子葡萄糖以a，a -1，I糖苷键相连而成的非还原性二糖，广泛地存在于微生物、虾类、酿酒酵母、蘑菇及各种真菌、昆虫、植物等。外源性的海藻糖同样对生物体及生物大分子、生物膜具有良好的非特异性保护作用，它可以保护细胞免受由于环境变化(如脱水、高渗)变化后造成的损害，具体表现为对生物膜、蛋白质和DNA等的有效保护，因此被誉为“生命之糖”。天然中海藻糖的含量很低，过去主要是从干酵母中提取，由于含量低，提取过程较复杂，成本极高。如此昂贵的海藻糖只能局限于某些特殊领域如医学生物制品的活性保持的应用，随着人类社会的发展和进步，希望能将海藻糖应用于日常生活所常用各类食品的鲜味保持与质地改善，更好提高人们的生活和健康水平，因此必须要尽快地找到廉价而高效的海藻糖制造方法。目前已经在多种微生物中分离到多种不同类型的海藻糖合成酶及其相关的基因，发现的海藻糖合成相关酶和基因表明，微生物中合成海藻糖的途径可以分为三种途径，第一种途径是海藻糖磷酸化酶合成途径，主要由径6-磷酸海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase)和 6_ 憐酸海藻糖酷酶(Trehalose-6-phosphatephosphatase)组成，首先由6磷酸海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6_磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，然后再由6磷酸海藻糖酯酶脱磷酸后得到海藻糖；第二种途径是麦芽寡糖基海藻糖合成酶合成途径，主要是由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyltrehlosen,MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase,MTHase)组成，先由麦芽寡糖基海藻糖合成酶以麦芽糊精(Maltodextrin)为底物，通过分子内转糖基作用把麦芽糊精末端的两个葡萄糖分子间的a，a -1，4糖苷键转变成a，a -1，I糖苷键，形成麦芽寡糖基海藻糖(Maltooligosyltrehalose)。然后麦芽寡糖基海藻糖在麦芽寡糖基海藻糖水解酶的催化下从麦芽寡糖基海藻糖分子上水解下一个海藻糖分子，而原来的麦芽糊精则转变为减少了两个葡萄糖基的新寡糖，并可作为新的底物进行下一轮反应，如此反复就可以将麦芽糊精转化成海藻糖；第三种途径是海藻糖合成酶途径，与其它海藻糖合成途径不同是这种途径只有一种酶即海藻糖合成酶(Trehalose synthase, TreS)组成，它作用的底物是麦芽糖(Maltose)，通过催化麦芽糖分子内转糖基，将a，a-1，4糖苷键连接的麦芽糖转化为a，a-1，I糖苷键，麦芽糖转变成海藻糖。第一种途径需要用到价格昂贵的高能磷酸化合物W)P-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖为底物来生产海藻糖，由于生产成本高很难产生竞争优势，第二种和第三种途径是以淀粉的水解产物麦芽糊精或者麦芽糖为底物生产海藻糖，具有很强的竞争优势，第三种途径和第二种途径相比，第三种途径只需要一种酶，因此在利用基因工程菌生产酶，不需构建两种工程菌，由于不用生产两种酶，在生产过程设备的占用率会更低，以及由于不需要考虑两种的反应条件是否一致生产 工艺上会更简单，因而具有更强的竞争优势。目前国内已有不少海藻糖合成相关基因的克隆和分离，以及这些海藻糖合成酶基因的相关酶用于制备海藻糖的文献报道。(I)SH-1lO菌海藻糖合成酶基因克隆、表达及酶学性质研究。尚宏丽，顾英，付莉，那鑫娜。中国农学通报2012，28 (21) =169-173(2)—株嗜热菌的分离、鉴定及海藻糖合成酶基因的克隆。王慧荣，韦宇拓，黄日波。湖南师范大学自然科学学报。2011，34 (6):72-76(3)谷氨酸棒杆菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆与表达。张文德，乔宇，丁宏标。中国农业科技导报，2009，11 (I):68-72(4) 一株海藻糖合成酶产生菌的筛选及初步鉴定。尚宏丽，陈红漫。食品科学，2007,28 (I):212-215(5)硫矿硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的克隆与表达。陈晓斌，林建平，金志华，岑沛霖。化工学报。2006,57(10):293-1396(6) 一株产海藻糖合成酶嗜中温芽孢杆菌的鉴定及其酶学性质。尚宏丽，陈红漫。食品与生物技术学报，2006，25 (6): 34 -36(7)中国专利ZL200910007258.3公布了一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶及其编码基因与应用。该麦芽寡糖基海藻糖合成酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质:1)序列表中的SEQ ID N0.1的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID N0.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有麦芽寡糖基海藻糖合成酶相关功能的由SEQ ID NO:1衍生的蛋白质。该麦芽募糖基海操糖合成酶蛋白具有麦芽募糖基海藻糖合成酶活性，该麦芽寡糖基海藻糖合成酶的分子量为90kDa，酶活性的pH范围为7.0 9.0，最适pH为8.0 ;酶活性的温度范围为20 40°C，最适反应温度为35°C。(8)中国专利ZL200710100350.5公布了一种海藻糖合成酶及其应用，该海藻糖合成酶，是如下(a)或(b)的蛋白质:(a)由序列表中序列2的氣基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有海藻糖合成酶活性的由(a)衍生的蛋白质。该海藻糖合成酶可用于催化麦芽糖制备海藻糖。(9)中国专利CN200910007259.8公布了海藻糖合成酶及其编码基因与它们的应用。该海藻糖合成酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质:1)序列表中的SEQ IDN0.1的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ ID N0.1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有海藻糖合成酶相关功能的由SEQ ID NO:1衍生的蛋白质。以麦芽糖为底物，用该海藻糖合成酶蛋白进行催化，可得到海藻糖，并且该催化反应具有催化时间短、所需底物浓度低，以90mM麦芽糖为底物，催化8小时，转化率达69%的优点。(10)中国专利ZL200410073883公布了一种热稳定海藻糖合成酶及其编码基因与应用。所提供的海藻糖合成酶，是具有序列表中的SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列的蛋白质或是将序列表中SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且可催化海藻糖合成的蛋白质。海藻糖合成酶可以葡萄糖和a-1-磷酸葡萄糖为反应底物，催化合成海藻糖，为工业化酶法生产海藻糖提供了一条新的途径。
(11)中国专利ZL200410013007.3公布了一种海藻糖合成酶基因及海藻糖制造方法，该酶的基因基因克隆自Thermobifida菌属，它能够在正常的生化反应条件下将麦芽糖转化为海藻糖，该酶的底物转化率会随着反应温度的降低而升高，它可以利用麦芽糖或淀粉为原料，再由克隆得到的酶转化为a，a-l，l-海藻糖。这种海藻糖可应用于食品工业，海产品冷藏以及药物的活性保持等领域。但没有关于从链霉菌克隆到海藻糖合成酶基因的文献报道，而且这些海藻糖合成相关酶的海藻糖合成途径不同，或者是微生物菌种来源不同，导致了海藻糖合成酶的编码DNA序列和氨基酸序列相差甚远，酶的分子量、酶学特性以及酶对底物的转化率都有所不同，而且目前大部分的海藻糖合成酶基因还没有得到工业规模化的应用。
发明内容
本发明目的是提供一种链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用。本发明人在筛选能产海藻糖的微生物时，获得一株链霉菌(Streptomyces spGXT6)，在其细胞内能检测微量海藻糖，推测该菌含有海藻糖合成酶基因。然后利用基因组高通量测序技术对该链霉菌进行 基因组测序，对获得的基因组DNA序列进行生物信息学分析，发现一个ORF的DNA序列与已经有文献报道的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的基因都有较高的同源性，同源性达到70%以上，而其编码蛋白质的氨基酸序列与已发表的海藻糖合成酶、糖苷酶、淀粉酶家族蛋白的氨基酸也有较高同源性，氨基酸同源性达到80%以上，所以很难通过氨基酸序列的对比分析确定其为何种酶，必须要经过具体实验来验证这段基因的功能是属于何种酶，经过实验表明，这段DNA是一个新的海藻糖合成酶基因。本发明所述的海藻糖合成酶基因克隆自一株链霉菌(Streptomyces sp)菌株,该菌株已经于2013年I月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC N0.7091，保藏单位地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，邮编100101。链霉菌(Streptomyces sp GXT6)克隆得到的海藻糖合成酶具有以下特征:1.由568个氨基酸组成，分子量约为65.68kD。2.酶的最适反应温度为25 30°C3.酶的反应的pH在6.5 7.5，优选pH为7.0 7.54.二价金属离子的浓度在5mmol/L时，Cu2+和Tris能够强烈抑制酶活性；Li+、Mn2+、Co2+、Pb2+、Ni2+、EDTA可以轻微抑制酶活；Fe3+和Ca2+对酶活影响很小，然而K+、Mg2+对酶活没有任何影响；Zn2+对酶活有激活作用。5.在pH7.0和25°C的反应条件下，反应I小时后产物中海藻糖含量达到最大86.68%，葡萄糖3.65%，麦芽糖8.76 %，随着反应时间的增加海藻糖和麦芽糖的含量都会减少，而葡萄糖的含量会增加，但在5个小时变化不大。本发明所述的海藻糖合成酶的基因是克隆链霉菌(Streptomycessp GXT6),该基因是通过分离筛选能产海藻糖的微生物，鉴定为链霉菌(Streptomyces sp GXT6),然后通过基因组的随机测序，再利用生物信息分析找到可能为海藻糖合成酶基因的0RF。把这一段推测可能为海藻糖合成酶基因ORF的DNA序列连接到表达载体上PSE380上，然后导入大肠杆菌进行高效表达，获得该基因表达的目的蛋白进行研究，确定其功能和酶学特性，证实了这一段可能为海藻糖合成酶基因ORF编码的是一种特性特征与前人发现的不同的海藻糖合成酶。这些不同的特性特征包括了氨基酸序列和DNA序列的不同，酶的分子大小不同，酶的最适反应温度和最适PH不同，反应条件的不同以及酶对底物麦芽糖转化为海藻糖比例的差异等特性，因此判定是一种新的发现。编码本发明所述的海藻糖合成酶的基因长度为1704bp，编码568个氨基酸，GC含量为 66.67%。本发明与现有技术相比，具有实质性特点和显著的优势:1.同样具有转化麦芽糖生成海藻糖的功能，但具有较小的分子量只有568个氨基酸，与日本林原研究所专利报道的来自Pimerlobacter sp.R48的海藻糖合成酶的625个氨基酸相比，本发明的海藻糖合成酶的氨基酸个数少了 29个，比同样是林原研究所报道的来自水栖嗜热菌Thermus aquaticus的海藻糖合酶的964少了 394个氨基酸,与中国专利专利号:ZL200410013007.3所报道的Thermobifida fusca海藻糖合成酶的相比少了 41个氨基酸，小分子的蛋白质酶更加容易地通过基因重组与表达技术来进行工业化生产重组酶，因而更有市场竞争力。
2.转化麦芽糖生成海藻糖时能产生较高的海藻糖及产生较少的葡萄糖，目前报道的海藻合成酶基因在转化麦芽糖，随着反应温度的提高，会产生较多葡萄糖副产物，大多会产生10 - 30%的葡萄糖，反应产物海藻糖糖的含量一般在65%左右，而本发明的海藻糖合成酶与已经报道的海藻糖合成酶相比具有反应产物中海藻糖含量高和较低葡萄糖副产物的特点，反应速度快，在25°C的反应温度时，反应I个小时海藻糖含量可以达到86.68%以上，而葡萄糖含量约为3.65%，麦芽糖为9.76%，特别是葡萄糖的含量很低。与申请专利号为CN200910007259.8所报道69%的转化率相比转化率更高，反应速度也更快。这就有利于提高底物的转化效率和降低副产物的生成，从而可以降低生产成本，更具有市场竞争力。3.本发明的海藻糖合成酶在5mmol/L的二价金属离子浓度时，Cu2+和Tris能够强烈抑制酶活性；Li+、Mn2+、Co2+、Pb2+、Ni2+、EDTA可以轻微抑制酶活；Fe3+和Ca2+对酶活影响很小，然而K+、Mg2+对酶活没有任何影响；Zn2+对酶活有激活作用，这可以降低酶在生产中对水和淀粉麦芽糖糖浆纯度的要求，避免生产过程中水和原料中金属离子对酶活力的抑制，使生产工艺更稳定。
图1是海藻糖合成酶基因表达产物的SDS-PAGE分析图。图2是不同pH对酶活力的影响的曲线3是不同温度对酶活力的影响的曲线4是温度对酶活热稳定性影响的曲线5是不同金属离子对酶活力影响的曲线6是反应I小时后反应产物中各中糖的含量的HPLC分析的结果7是不同反应时间对产物中各种糖含量影响的曲线图
具体实施例方式以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明，下述实验和实例所述内容属于本发明的主要内容，但并不仅仅限于这些内容，有些对本领域专业人员来说显而易见的扩展内容虽然并未在本说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。1.链霉菌的培养链霉菌Sti^ptomyces sp GXT6，菌株编号为CICC11021保存于中国工业微生物菌种保藏中心，将链霉菌接种于以下培养基(克/L):酵母提取物3g，蛋白胨5g，麦芽提取物3g,葡萄糖IOg,鹿糖340g,加蒸懼水至1L, 120°C灭菌20min,高压灭菌后加入2ml.2.5mol/L的MgCl2溶液，接种后在45 50°C恒温摇床上振荡40小时，然后收集菌体用于总DNA的提取。2.链霉菌的基因组的测序将提取的链霉菌总DNA委托深圳华大基因公司进行全基因组测序，测序后利用生物信息学进行基因功能预测，找到可能为海藻糖合成酶基因的ORF进行酶学功能和性质的研究。3.链霉菌海藻糖合成酶基因(treS)的克隆、表达及粗酶的制备根据步骤2确定的链霉菌基因序列可能为海藻糖合成酶基因ORF的序列(命名为Sts)，设计相应引物扩增 该基因并连接到表达载体上然后导入大肠杆菌进行表达，设计引物如下:上游引物:5'-CCGCCATGGATCACCATCATCATCATCATATCGTCAATGAGCCC-3'下游引物:5'-CGCAAGCTTCTAGAGATTGGCGGCGTC-3'上下游引物的5'端分别设计了的Ncol和Hind III酶切位点用于连接到表达载体PSE380上，上游在其起始密码子后添加六个组氨酸(斜体部分)以便于一步纯化重组蛋白。用设计好的引物扩增可能为海藻糖合成酶基因的序列的DNA序列Sts，扩增产物用试剂盒纯化回收目的扩增片段，然后利用Ncol和Hind III进行双酶切，与同样利用Ncol和Hind III进行双酶切的表达载体PSE380进行连接，然后经过筛选验证得到Sst基因的表达重组质粒pSE380-Sts。把重组的表达质粒pSE380_Sts转化到大肠杆菌BL21菌株的感受态细胞中，调取转化子于LB液体培养基中，在37°C摇床中培养，当0D600达到0.8左右时，加入IPTG使其终浓度达到lmmol/L，继续培养20h进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用破胞缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波进行破胞，破胞至菌液澄清，12000rpm/min离心15分钟离心收集上清，所收集的上清液即为粗酶液，可用于转化麦芽糖的试验。用金属镍亲和层析法一步纯化目的蛋白，SDS-PAGE电泳检测纯化效果，结果如图1，表明链霉菌海藻糖合成酶基因已经成功表达和得到纯化，是和用于酶学功能和性质的分析。4.链霉菌海藻糖合成酶转化麦芽糖产物的分析利用高效液相色谱仪(HPLC)来进行海藻糖合成酶转化麦芽糖后的产物分析，分析条件，色谱柱:AlltimaAminol00A5u 柱(4.6mmX 250mm);检测器:Alltech2000ES 型蒸发光散射检测器；流动相:70%乙腈/30%H20 ;流速:lmL/min，柱温:35°C。( I)最适反应pH值的分析分别取96 ii L用分别取96 ii L分别用pH为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的磷酸盐缓冲液配制10%的麦芽糖底物加4 ii L的酶液(32ug)，分别在30°C反应lh，然后用HPLC分析反应的产物组分，结果见图2。结果表明海藻糖酶的活力在pH6 8.5都能维持较高的活力，其中在PH7.0时活力最高。(2)最适反应温度测定:取96 ii L的10 % pH7.0的麦芽糖底物+4 y L含32ug蛋白的酶液，分别在10°C、15°C、20°C、25°C、30°C、35°C、40°C和45°C不同的反应温下保温反应Ih，然后用HPLC分析反应的产物组分，结果见图3。结果表明反应温度在15 40°C海藻糖合成酶的活力都可以维持在70%以上，在30°C的反应温度时反应产物中的海藻糖合成酶的活力最高。(3)温度对TreS热稳定性的影响将纯化好的海藻糖合成酶于20_70°C保温60分钟后，立即冰上冷却，然后于最适条件下反应测定残留酶活，以未保温处理的酶活为100%，绘制温度-相对残余酶活力曲线。结果如图4，结果表明酶在低于50°C时保留了 80%以上的酶活力，热稳定性较好，而高于50°C时酶活力损失大，此时热稳定性较差。(4)金属离子对酶活的影响:在酶的最佳反应体系中添加终浓度为5mmol/L或10mmol/L不同的金属离子和化学试剂在最适合条件下 反应60min后测定酶活，以未经处理的酶活为100%，绘制金属离子-相对酶活力曲线。结果见图5，表明Cu2+和Tris能够强烈抑制酶活性；Li+、Mn2+、Co2+、Pb2+、Ni2+、EDTA可以轻微抑制酶活；Fe3+和Ca2+对酶活影响很小，然而K+、Mg2+对酶活没有任何影响；Zn2+对酶活有激活作用。(5)不同反应时间，产物中各种糖含量变化:取96 ii L的10% pH7.0的麦芽糖底物+4ul含32ug蛋白的酶液，在pH7.0和25°C的条件下反应不同的时间，然后用HPLC测定各时间段反应产物中各种糖的含量，结果表明反应I小时后，反应产物总海藻糖含量就可以达到大86.68%，而葡萄糖含量很低仅为3.56%，麦芽糖9.76%，产物的HPLC分析见图6。反应产物各种糖含量随着时间的变化结果见图7，结果表明随着反应时间的增加海藻糖和麦芽糖的含量都会减少，而葡萄糖的含量会增加，但在5个小时变化不大。4.从麦芽糖浆制造海藻糖取市售以淀粉制备麦芽糖含量为70%的麦芽糖浆，用5mM，pH为7.0磷酸氢二钠和磷酸二氢钠配成的缓冲液配制成含30%麦芽糖pH为7.0 7.5的反应底物，取100升配制好的反应底物放置于不锈钢反应罐中，取上述第2步骤制得的海藻糖合成酶粗酶液10升，加入到100升含30%麦芽糖的反应底物中，然后在25°C条件下反应24小时，然后用HPLC对反应产物进行分析，结果如表1:表1:30%麦芽糖底物反应24小时后反应液中各糖的百分含量(％)
^藻糖I麦芽糖I葡萄糖 20.6 丨5.5% |l.2%结果表明，100升浓度为30%的麦芽糖底物，加入10升的酶液后，浓度变成27.3%，总的转化率便是20.6%/27.3%=75.5%，也就是说以30%麦芽糖的为原料底物约有75.5%的麦芽糖转化为海藻糖，即在110升的总反应体积中共形成了约22.65千克海藻糖。以上所述实施方式是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明，所述内容属于本发明的主要内容，但并不仅仅限于这些内容。有些可以显而易见地扩展的内容虽然并未在说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。
权利要求
1.一种链霉菌海藻糖合成酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.1所示。
2.根据权利要求1所述的基因所编码的海藻糖合成酶，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.2所示。
3.权利要求2所述的海藻糖合成酶在转化麦芽糖生产海藻糖中的应用，其特征在于，I)将海藻糖合成酶基因构建基因工程菌进行藻糖合成酶的高效表达；2)收集制备重组的海藻糖合成酶；3) 以麦芽糖或者淀粉制备的麦芽糖浆为原料用海藻糖合成酶制造海藻糖。
全文摘要
一种链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用，该基因克隆自链霉菌(Streptomyces sp GXT6)它表达的海藻糖合成酶能将麦芽糖转化为海藻糖，该基因的最大特点是底物转化效率高，反应速度快，在最佳的反应条件下转化麦芽糖生成海藻糖的反应产物中海藻糖含量可以达到86.68％，并且只产生很少的葡萄糖仅为3.56％，这有利于提高底物的转化率，降低生产成本。该海藻糖合成酶可以应用于海藻糖中的生产，这种海藻糖可应用于食品工业、美容化妆品、医药生物制品等领域。
文档编号C12N15/54GK103224944SQ201310067160
公开日2013年7月31日 申请日期2013年3月3日 优先权日2013年3月3日
发明者韦宇拓, 黄英, 谭惠敏, 杜丽琴, 梁甲元, 黄日波 申请人:广西大学