专利名称：一种杀菌肽cad的重组表达及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉一种天蚕素杀菌肽的表达及制备方法，尤其涉及一种天蚕素杀菌肽Cecropin AD (CAD)的重组表达及其制备方法。
背景技术：
杀菌肽(anti2microbial peptides)是具有抗菌活性短肽的总称。1981年瑞典科学家Steiner等从惜古比天蚕(Hyatophora cecropia)蛹中诱导分离得到一种杀菌肽，并将其命名cecropin。杀菌肽一般含有37 39个氨基酸残基，不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。天蚕素(cecropins)对革兰氏阳性菌、部分革兰氏阴性菌具有很强的杀伤力，而对真菌和真核细胞没有毒性。天然存在的天蚕素杀菌肽分为cecropin A、cecropin B和cecropin D,其中天蚕素杀菌肽AD是由cecropin A和cecropin D设计合成的37个氨基酸的杂合肽,不含半胱氨酸，其N端区域具有强碱性，可形成近乎完美的双亲螺旋结构，而在C端区域可形成疏水螺旋，两者之间有甘氨酸和脯氨酸形成的铰链区，多数多肽的C端被酰胺化，酰胺化对其抗菌活性具有重要作用。该抗菌肽分子具有独特的广谱抗菌活性，体外试验已证明它能有效的抑制大肠杆菌、金黄色葡萄 球菌、沙门氏菌等有害菌，因此，它成为抗生素替代物的绝佳选择之一。随着研究工作的深入开展，发现某些抗菌肽会对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等均具有很强的杀伤作用，并且在其它领域也具有很好的应用前景。
目前，国内外在杀菌肽AD的基因工程方面开展了不少研究工作，有关杀菌肽基因在大肠杆菌、酵母、昆虫杆状病毒载体表达系统、以及哺乳动物细胞中的表达研究均已有报道。黄亚东等利用昆虫杆状病毒表达系统表达了天蚕杀菌肽AD(黄亚东，中国抗生素杂志，2003，28:304-307)。而使用昆虫病毒载体系统表达目的蛋白质，实验步骤繁琐，条件不易于控制，不适合大规模生产。黄亚东采用PCR技术改造杀菌肽AD基因，构建了酵母重组分泌型表达载体，用Pichia pastoris系统表达了杀菌肽AD (黄亚东，华南理工大学自然科学版，2003，30:13-16)。但酵母表达系统不仅培养密度低，杀菌肽的表达量有限，而且杀菌肽表达酰胺化不完全，影响其抗菌活性，同时酵母表达系统具有生产周期长，生产成本高的缺点。中国专利CN101307316A公开了抗菌肽CAD在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及重组枯草杆菌表达系统，但研究表明枯草芽孢杆菌分泌的蛋白酶比较多对目的蛋白易降解，并且给纯化目的蛋白带来困难。迄今为止，主要是使用细菌特别是大肠杆菌作为以重组技术工业规模生产蛋白质的宿主菌细胞。大肠杆菌的主要优点是:遗传背景清楚，易于遗传操作并能保持转化株的稳定性；经大体积培养可获得高产率的表达产物；带有易于纯化的标签蛋白；细胞易于培养，且培养周期短，从而可降低生产成本等优点。由于杀菌肽的组成特点，仅由氨基酸组成，不含外源成分及化学修饰，不需要翻译后加工修饰，可以采用原核表达系统进行表达。但杀菌肽对大肠杆菌有很强的毒性，分子量较小不能直接进行表达，需要借助融合蛋白来封闭杀菌肽的毒性。然而，使用大肠杆菌生产生物学活性蛋白质的另一个重要缺点是，表达产物在宿主胞浆内形成包涵体，即无生物活性的不溶性聚合体。为了克服原核表达容易形成包涵体的缺点，人们常采用融合表达，希望在大肠杆菌中高效表达外源蛋白。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中存在的问题，提供一种杀菌肽CAD的重组表达；
本发明的另一目的是提供一种杀菌肽CAD的制备方法。本发明杀菌肽CAD的重组表达，是以pUC18为表达载体，以大肠杆菌E.coli ER2566为宿主，以天蚕素杀菌肽CAD的基因与分子伴侣β -半乳糖苷酶Abg蛋白标签融合,合成编码Abg-CAD的融合基因重组表达。所述融合基因的核苷酸序列为: ATGGGCGGCCATCATCATCATCATCATGGCGGCAATGTTCTTCTGCTGATTTGCTATGGCGGCGATTATAAT
CCGGAACAATGGCCGGAAGAAATTTGGTATGAAGATGCAAAACTTATGCAAAAAGCAGGCGTTAATCTTGTTCTGCTTGGCATTTTTCTGTGGCTGAAAATTGAACCGCTGGATGGCGTTTTTGATTTTGAATGGCTTGATAAAGTTATTGATATTCTTTATGATCATGGCGTTTATATTAATCTTGGCACAGCAACAGCAACAACACCGGCATGGTTTGTTAAAAAATATCCGGATCTGCTTCCGATTGATGAACTGGGCCTTAAAGCAGTTGTTTGCCTGTGCAGACTTGTTAGAGTTGGCAATTGCCTTATTGGCGGCGTTCTGTTTTGCAGAAGAACAGAACTTTTTACATATTGCTGCACAAGAGTT ；
其氨基酸序列序列为: MGGHHHHHHGGNVLSSICYGGDYNPEQWPEEIWYEDAKLMQKAGVNLVSLGIFSffSKIEPSDGVFDFEWLDKVIDILYDHGVYINLGTATATTPAWFVKKYPDSLPIDESGLKAVKWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAK。本发明杀菌肽CAD的制备方法，包括以下工艺步骤:
(I)将天蚕素杀菌肽CAD的基因与分子伴侣β -半乳糖苷酶Abg蛋白标签融合，合成编码Abg- CAD融合蛋白的融合基因；具体是采用固相亚磷酰胺三酯法合成如下片段:在AbgDNA序列的N-末端连上亲和层析纯化标签6 XHis的DNA序列；在其C-末端连上FactorXa蛋白酶识别位点Ile-Glu-Gly-Arg和目的蛋白CAD的DNA序列，并在整个融合DNA序列的5’端和3’端分别加上EcoRI和PstI酶切位点及相应保护碱基。(2)用限制性内切酶EcoR I和Pst I对杀菌肽的Abg- CAD融合基因进行双酶切，并与同样用限制性内切酶双酶切的表达载体PUC18质粒连接，构建一种表达毒性蛋白的表达载体；
(3)将表达载体转化至大肠杆菌E.coli ER 2566，获得基因工程菌；
(4)通过培养基因工程菌组成型表达获得融合蛋白Abg-CAD:将筛选的基因工程菌单克隆，接种到LB+Amp培养基中，于温度37°C、摇速225 rpm下振荡培养10 12h ;再按5%的比例转接到新鲜培养基中，于温度30°C、摇速225rpm下培养至菌液OD为0.6 0.8，
0.5mM的IPTG诱导10 12h ;离心收集菌体，加入裂解液，超声破菌后离心，取上清液，进行N1-NTA亲和层析，再经洗涤、洗脱，即得含Abg-CAD的可溶性融合蛋白。所述裂解液是由TriS-HCl缓冲液，pH8.0的NaCl溶液，pH8.0的CaCl2溶液组成的混合体系；其用量为:在50ml混合体系中，20mM Tris-HCLlOOmM NaCl, 2mM CaCl2 ； Img的Factor Xa酶加入50mg融合蛋白底物,25°C温育不超过6小时.所述超声破菌的工艺:在超声波的功率400w下，超声2s，停2s，共2(Γ40个周期。(5)融合蛋白Abg-CAD分离纯化后,通过Factor Xa蛋白酶酶切,纯化,获得天蚕素杀菌肽CAD。所述Factor Xa蛋白酶酶切获得杀菌肽CAD的工艺为:在分离纯化后的融合蛋白中加入Factor Xa蛋白酶，于25°C进行酶切反应，检测酶切完全后的融合蛋白进行N1-NTA亲和层析，收集穿透液，即得纯化后的杀菌肽CAD。经考马氏亮蓝染色，BandScan软件分析，证实本发明制备的杀菌肽AD，蛋白纯度达90%以上。本发明相对于现有技术具有以下优点:
1、本发明通过 Abg蛋白与杀菌妝CAD基因融合，以借助Abg蛋白来封闭杀菌妝AD的毒性，使融合蛋白的毒性减弱，蛋白表达量明显提高。2、本发明的杀菌肽CAD的重组融合表达可能促使重组蛋白胞内区域化，降低对酶解的敏感性。3、本发明的通过与分子伴侣β -半乳糖苷酶Abg蛋白标签融合，由于Abg有一个亲水表面和一个高度疏水的内核，这对于在其它情况下不可溶的蛋白能起到一个类似于洗涤剂的效果，从而增强所融合目的蛋白的可溶性。4、以Abg蛋白作为融合标签,能给被Factor Xa蛋白酶准确无误地切除融合标签，产生天然N端的目标蛋白。目的蛋白在细胞内为可溶性蛋白，通过N1-NTA柱亲和层析、Sephadex G_25脱盐和Factor Xa蛋白酶酶切，最终获得蛋白纯度超过95%。5、本发明的表达系统的构建比较简单，成本低，为取代抗生素应用于医药、兽药、水产、饲料添加剂等产业奠定了基础。
图1为杀菌肽CAD表达和制备的Tricine-SDS-PAGE 图2为本发明杀菌肽CAD蛋白对不同细菌的抑菌图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明杀菌肽CAD的融合基因的表达及制备方法作进一步的说明。未特别指明，实施例中所有的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明所采用的CAD的基因、载体pUC18、宿主细胞E.coli ER 2566等可由商业途径得到:如CAD的基因由南京金斯瑞合成，表达载体由克隆载体pUC18、宿主细胞大肠杆菌E.coli ER 2566 购自 Biovector 公司。1、Abg-CAD杀菌肽融合基因的人工合成
根据大肠杆菌的偏爱密码子优化β -半乳糖苷酶(Abg)和天蚕素杀菌肽CAD，采用固相亚磷酰胺三酯法合成如下片段:在Abg DNA序列的N-末端连上亲和层析纯化标签6XHis的DNA序列；在其C-末端连上Factor Xa蛋白酶识别位点Ile-Glu-Gly-Arg和目的蛋白CAD的DNA序列，并在整个融合DNA序列的5’端和3’端分别加上EcoRI和PstI酶切位点及相应保护碱基。2、pUC18-Abg-CAD表达载体的构建
人工合成的融合基因Abg-CAD用EcoR I和Pst I双酶切，与同样用两种酶双酶切的PUC18质粒连接，构建一种表达毒性蛋白的表达载体pUC18-Abg-CAD ;将表达载体转化至大肠杆菌E.coli ER 2566 ;将测序正确的pUC18-Abg-CAD转化大肠杆菌E.coli BR 2566化学感受态细胞用氨苄青霉素抗性平板筛挑选阳性转化子，获得基因工程菌E.coli ER 2566/pUC18-Abg-CAD。3、杀菌妝CAD蛋白的获得
(1)将筛选的基因工程菌E.coli ER 2566/pUC18-Abg-CAD单克隆，接种到LB+Amp培养基中，于37°C，摇速225 rpm下振荡培养10 12h ；
(2)扩大培养:按5%比例转接到新鲜培养基中，于30°C、摇速225rpm下培养至菌液OD为 0.6 0.8，0.5mM 的 IPTG 诱导 10 12h ；
(3)离心收集菌体:在50ml如下反应体系中:20mMTris-HCl, IOOmM NaCl, 2mM CaCl2(ρΗ8.0 25°C ) , Img的Factor Xa酶加入50mg融合蛋白底物,温育不超过6小时；超声波(功率400w，超声2s，停2s，共30个周期)破菌，离心分离上清和沉淀，收集上清液，15%Tricine -SDS-PAGE 检测。4、融合蛋白的纯化
将上述离心收集的上清菌体用Lysis buffer (IOmmol /L咪唑,300mmol/L NaCl,50mmo 1/L Na3P04, p H 8.0)重悬后加入溶菌酶至终浓度为lg/L，冰浴中放置30min后超声破碎，IOOOOg 40C离心30 min，收集上清。上清利用AKTA purifier 100系统经过HisTrapTMFF crude 亲和层析，用 Wash buffer(20 mmol/L 咪唑，300 mmol/L NaCl, 50 mmol /L Na3P04, pH 8.0 )洗去杂蛋白后，再用 Elution buffer (250mmol/L 咪唑，300 m mol/LNaCl，50 mmol/L Na3P04, pH 8.0)洗脱，收集唯一的洗脱峰即为融合蛋白，并进行Tricine-SDS-PAGE 检测。5、利用Factor Xa蛋白酶切除Abg蛋白标签
将收集的融合蛋白脱盐后，参考NEB公司Factor Xa Protease的酶切条件，加入Factor Xa Protease 和终浓度 2 mmo 1/L 的 DTT,于 25 °C 切割 6h,取样进行 Tricine-SDS-PAGE电泳检测。6、杀菌肽CAD的纯化
将酶切样品再经His TrapTMFF crude亲和层析:先用缓冲液(20 mmol/L咪唑，150mmol/L NaCl, 50 mmol/L Na3P04, pH 8.0 )平衡亲和柱，酶切样品过柱，收集穿透液(杀菌肽 ZLJ)，上样完毕后用缓冲液(40 mmol/L 咪唑，150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Na3P04, pH
8.0)进行洗涤，收集洗涤液。最后，以缓冲液(250mmol/L咪唑，150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Na3P04, pH 8.0)进行目的蛋白Abg标签洗脱纯化，于_20°C下保存。纯化后的蛋白杀菌肽 CAD 进行 Tricine -SDS-PAGE。图1为为杀菌肽CAD生产工艺相关节点的Tricine-SDS-PAGE，其中，泳道I为NEB公司蛋白marker ;泳道2为大肠杆菌表达宿主菌ER2566 ;泳道3为杀菌肽工程菌可溶蛋白上清部分，箭头所指为融合蛋白；泳道4为分离纯化后的杀菌肽融合蛋白；泳道5为经裂解后的杀菌肽融合蛋白，箭头所指为杀菌肽CAD单体；泳道6为经纯化后的杀菌肽CAD单体，分子量大小3.9kD,与蛋白marker标准相比较得出，杀菌肽Abg-CAD的浓度彡lg/ L。可溶性目的蛋白占菌体总目的蛋白的90%以上，蛋白纯度达95%以上。Abg-CAD融合蛋白的核苷酸序列为: ATGGGTGGTCATCATCATCATCATCACGGCGGCAATGTGTTATCCTCAATTTGTTACGGAGGAGATTATAAC
CCAGAGCAATGGCCAGAGGAAATTTGGTATGAAGATGCTAAGTTGATGCAAAAAGCGGGGGTGAATTTAGTATCTTT
AGGGATTTTCAGTTGGAGCAAGATCGAACCGTCTGATGGAGTGTTCGACTTTGAATGGCTAGACAAGGTTATAGATA
TACTATATGACCACGGTGTTTATATTAACTTGGGGACGGCGACTGCAACTACTCCAGCTTGGTTTGTAAAAAAGTAT
CCAGATTCTTTGCCGATCGATGAAAGCGGATTGAAGGCCGTTAAGTGGAAGCTGTTCAAAAAAATCGAAAAAGTTGG
CCAGCGTGTTCGTGATGCTGTTATCTCTGCTGGCCCGGCTGTTGCTACGGTTGCTCAGGCTACGGCTCTGGCTAAA。Abg-CAD融合蛋白的氨基酸序列为: MGGHHHHHHGGNVLSSICYGGDYNPEQWPEEIWYEDAKLMQKAGVNLVSLGIFSffSKIEPSDGVFDFEWLDK
VIDILYDHGVYINLGTATATTPAWFVKKYPDSLPIDESGLKAVKWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAK。7、杀菌肽CAD抑菌活性的鉴定
采用标准琼脂孔扩散法，以金黄 色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌和酵母菌为实验菌株，将供试菌悬浮液(0D600=0.2 0.3)20ul与55°C的LB固体培养基25ml混匀后平铺板待其凝固后，用灭过菌的打孔器(直径5_)打孔，孔中加20ul纯化后的蛋白杀菌肽CAD，在37 °C培养过夜。图2为上述制备的杀菌肽CAD对不同细菌的抑菌图。其中，A为对金黄色葡萄球菌的抑菌图，B为对沙门氏菌的抑菌图，C为对大肠杆菌抑菌图，D为对酵母菌的抑菌图。从图2可以看出，本发明制备的蛋白杀菌肽CAD对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌、对酵母菌等都具有很好的抑制效果，因而在医药、兽药、水产、饲料添加剂中具有广泛的应用。
权利要求
1.一种杀菌肽CAD的重组表达，是以PUC18为表达载体，以大肠杆菌E. coli ER 2566为宿主，以天蚕素杀菌肽CAD的基因与分子伴侣β -半乳糖苷酶Abg蛋白标签融合，合成编码Abg-CAD的融合基因重组表达。
2.如权利要求I所述天蚕素杀菌肽AD的重组表达，所述融合基因的核苷酸序列为ATGGGCGGCCATCATCATCATCATCATGGCGGCAATGTTCTTCTGCTGATTTGCTATGGCGGCGATTATAATCCGGAACAATGGCCGGAAGAAATTTGGTATGAAGATGCAAAACTTATGCAAAAAGCAGGCGTTAATCTTGTTCTGCTTGGCATTTTTCTGTGGCTGAAAATTGAACCGCTGGATGGCGTTTTTGATTTTGAATGGCTTGATAAAGTTATTGATATTCTTTATGATCATGGCGTTTATATTAATCTTGGCACAGCAACAGCAACAACACCGGCATGGTTTGTTAAAAAATATCCGGATCTGCTTCCGATTGATGAACTGGGCCTTAAAGCAGTTGTTTGCCTGTGCAGACTTGTTAGAGTTGGCAATTGCCTTATTGGCGGCGTTCTGTTTTGCAGAAGAACAGAACTTTTTACATATTGCTGCACAAGAGTT ； 其氨基酸序列为MGGHHHHHHGGNVLSSICYGGDYNPEQWPEEIWYEDAKLMQKAGVNLVSLGIFSffSKIEPSDGVFDFEWLDKVIDILYDHGVYINLGTATATTPAWFVKKYPDSLPIDESGLKAVKWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAK。
3.如权利要求I所述杀菌肽CAD的制备方法，包括以下工艺步骤 (1)将天蚕素杀菌肽CAD的基因与分子伴侣β-半乳糖苷酶Abg蛋白标签融合，合成编码Abg- CAD融合蛋白的融合基因； (2)用限制性内切酶EcoRI和Pst I对杀菌肽的Abg- CAD融合基因进行双酶切，并与同样用限制性内切酶双酶切的表达载体PUC18质粒连接，构建一种表达毒性蛋白的表达载体； (3)将表达载体转化至大肠杆菌Ε.coli ER 2566，获得基因工程菌； (4)通过培养基因工程菌组成型表达获得融合蛋白Abg-CAD； (5 )融合蛋白Abg-CAD分离纯化后，通过Factor Xa蛋白酶酶切，纯化，获得杀菌肽CAD。
4.如权利要求3所述杀菌肽CAD的制备方法，其特征在于步骤(I)所述的标签融合，是采用固相亚磷酰胺三酯法合成如下片段在Abg DNA序列的N-末端连上亲和层析纯化标签6XHis的DNA序列；在其C-末端连上Factor Xa蛋白酶识别位点Ile-Glu-Gly-Arg和目的蛋白CAD的DNA序列，并在整个融合DNA序列的5’端和3’端分别加上EcoRI和PstI酶切位点及相应保护碱基。
5.如权利要求3所述杀菌肽CAD的制备方法，其特征在于步骤(4)所述通过培养基因工程菌组成型表达获得融合蛋白Abg-AD的工艺为将筛选的基因工程菌单克隆，接种到LB+Amp培养基中，于温度37°C、摇速225 rpm下振荡培养10 12h ;再按5%的比例转接到新鲜培养基中，于温度30°C、摇速225rpm下培养至菌液OD为O. 6 O. 8，O. 5mM的IPTG诱导10 12h ;离心收集菌体，加入裂解液，超声破菌后离心，取上清液，进行Ni-NTA亲和层析，再经洗涤、洗脱，即得含Abg-AD的可溶性融合蛋白。
6.如权利要求5所述杀菌肽CAD的制备方法，其特征在于所述裂解液是由Tris-HCl缓冲液，PH8. O的NaCl溶液，pH8. O的CaCl2溶液组成的混合体系；其用量为在50ml混合体系中，20mM Tris-HCl, IOOmM NaCl, 2mM CaCl2 ； Img 的 Factor Xa 酶加入 50mg 融合蛋白底物，25°C温育不超过6小时。
7.如权利要求3所述天蚕素杀菌肽CAD的制备方法，其特征在于所述超声破菌的工艺在超声波的功率400w下，超声2s，停2s，共20 40个周期。
8.如权利要求3所述杀菌肽CAD的制备方法,其特征在于步骤(5)所述Factor Xa蛋白酶酶切获得杀菌肽CAD的工艺为在分离纯化后的融合蛋白中加入Factor Xa蛋白酶，于25°C进行酶切反应，检测酶切完全后的融合蛋白进行Ni-NTA亲和层析，收集穿透液，即得纯化后的杀菌肽Abg-CAD。
全文摘要
本发明提供了一种杀菌肽CAD的重组表达及制备方法，属于生物技术领域。本发明是将天蚕素杀菌肽CAD的基因与分子伴侣β-半乳糖苷酶Abg蛋白标签融合，合成编码Abg-杀菌肽CAD融合蛋白的融合基因；再用限制性内切酶对杀菌肽CAD融合基因进行双酶切，并与同样用限制性内切酶双酶切的表达载体pUC18质粒连接，构建一种表达毒性蛋白的表达载体转化至大肠杆菌E.coliER2566，获得基因工程菌；然后通过培养基因工程菌组成型表达获得融合蛋白Abg-CAD；最后通过FactorXa蛋白酶酶切，纯化，获得杀菌肽CAD，其中可溶性目的蛋白占菌体总目的蛋白的90%以上，蛋白纯度达95%以上，为取代抗生素应用于医药、兽药、水产、饲料添加剂等产业奠定了基础。
文档编号C12N15/70GK103255159SQ201310067480
公开日2013年8月21日 申请日期2013年3月4日 优先权日2013年3月4日
发明者姬生跃, 李伟丽, 武刚 申请人:张掖市奥林贝尔生物科技有限公司