专利名称：一种巴贝斯虫的荧光定量pcr检测和分型的引物、探针及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及巴贝斯虫分子诊断的荧光定量PCR检测试剂和检测方法。此发明有效扩增感染犬、猫、牛、羊、马和人的巴贝斯虫的21个重要种(B.gibsoni, B.can iscams, B.cams rossi，B.cams vogli, B.felis，B.leo，B.bovis, B.equi，B.bigemina，B.caballi，B.capreoli，B.0docoilei，B.crassa，B.hongkangensis，B.vitalii, B.0vata, B.motasi，B.rodhaini, B.poelea，B.divergens，B.microti)，而不扩增其它类似的血液寄生虫的核酸。
背景技术：
巴贝斯虫(Babesia spp.)能引起多种动物和人以发热、贫血、消瘦为特征的疾病。巴贝斯虫是世界范围内第二最常见的感染哺乳动物的血液传播寄生虫病。巴贝斯虫感染的已有实验室诊断技术主要包括:I)血液图片法观察巴贝斯虫。此技术的灵敏度较低，而且不能有效的区分巴贝斯虫和其它类似的血液寄生虫；2)血清学和ELISA方法检测抗巴贝斯虫的抗体。此技术的局限性是不能区分巴贝斯虫感染者和感染后的康复者；3) PCR技术检测巴贝斯虫的核酸。世界范围内鉴定的巴贝斯虫有超过数十种，而现有的PCR技术仅能扩单ー种或几个种巴贝斯虫的核酸。
发明内容
为了解决现有分子诊断技术只能检测单一种或几个种巴贝斯虫的核酸不足，本发明提供ー种快速、特异性强、灵敏度高、适合临床使用的定量PCR检测重要种的巴贝斯虫的核酸的引物、探针及试剂盒。本发明的原理和最核心的技术关键是科学地设计扩增和检测巴贝斯虫的特异、高效的引物和探针。在保证设计的 引物高效扩增巴贝斯虫、设计的探针特异检测巴贝斯虫的同时，确保此引物和探针不扩增和检测其它类似的血液寄生虫。从GenBank (www.ncb1.nlm.nih.gov)获取如下巴贝斯虫以及相关寄生虫的代表株的rRNA的序列后，用ClustalMultiple Alignment Algorithm的方法对所有序列进行对齐:巴贝斯虫:Babesia microti,基因序列号:U09833;Babesia divergens,基因序列号:GQ3CM525;Babesia canis,基因序列号:DQ439545;Babesia felis,基因序列号:AY452706;Babesia gibsoni,基因序列号:AB118032;Babesia bovis,基因序列号:L19077, HQ264127。和巴贝斯虫相关的其它寄生虫:Theileria,基因序列号:L02366;
Cryptosporidium,基因序列号:DQ059473;Hepatozoon,基因序列号:AF176836;Eimeria,基因序列号:AY613853;Toxoplasma,基因序列号:L37425。图1、图2、图3、图4、图5显示设计的引物和探针如下:上游引物-1:5’ -ATGGCTTTGCCGGCGATGTATCA-3’ (SEQ ID N0.1)上游引物-2:5’-TTTHGCGATGKACCATTCAAGTTTCTG-3，(SEQID N0.2)下游引物:5’-CTGGCACCAGACTTGCCCTCCAAT-3’ (SEQ ID N0.3)6-FAM 探针:5，-ACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTC-(6-FAM)-3，(SEQ ID N0.4) Cy5.5探针:5’ _(CY5.5)-AITCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAA-PH0S (磷酸)-3’ (SEQ ID N0.5)。本发明还公开了巴贝斯虫的荧光定量PCR检测和分型试剂盒，该试剂盒由下列组成:包括5倍定量PCR反应液22 u I,以及22 ill的5倍引物和探针的混合液；所述引物和探针混合液含浓度为5 ii M的上游引物-1、上游引物-2、5 ii M下游引物、I ii M的6-FAM探针、111] 的075.5探针。本发明进一歩提供了巴贝斯虫分型方法，该方法包括以下步骤:(1)用上述引物和探针PCR扩增待测样本，扩增出290bp的条带，且荧光检测在640nm波长增强的为巴贝斯虫阳性样本；(2)PCR完成后，对步骤(I)巴贝斯虫阳性样本扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，根据熔解温度对巴贝斯虫进行分型，分型标准是:i)Babesia felis和Babesia microti的溶角军温度为 57°C；ii)Babesia gibsoni, Babesia canis, Babesia divergens 和 Babesiabovis的双峰的熔解温度为63°C和69°C。本发明的PCR技术特异性从五个方面得到保证。i)设计的引物用于GenBank的BLAST捜索，确认本发明设计的引物特异地扩增巴贝斯虫，而不扩增其它类似的血液寄生虫(图1、图2、图3) ;ii)由Intergrated DNA Technology公司合成如下巴贝斯虫的6个代表株的 DNA,此序列涵盖 PCR 的扩增区域:Babesia microti, Babesia divergens, Babesiacanis, Babesia felis, Babesia gibsoni, Babesia bovis。用设计的PCR系统(上游引物-1,上游引物-2，下游引物，6-FAM探针，Cy5.5探针)对合成的巴贝斯虫核酸进行PCR扩增；iii)对120个巴贝斯虫阳性样品进行PCR扩增；iii)对阴性对照和其它类似的血液寄生虫的核酸(Theileria, Cryptosporidium, Hepatozoon, Eimeria, Toxoplasma)进行 PCR 扩增；iv)观察以上扩增对象在PCR过程中荧光强度(640nm)的变化，以及PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳的条带的大小。荧光在640nm波长出现或增强，显示阳性；巴贝斯虫的PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示预期的290bp的条带；v)对扩增的PCR产物进行进行测序，测序的结果和GenBank的序列进行比较。结果显示，设计的巴贝斯虫PCR特异地扩增巴贝斯虫，而不扩增其他类似的血液寄生虫。巴贝斯虫定量PCR灵敏度的确定:由Intergrated DNA Technology合成巴贝斯虫及相关血液寄生虫的rRNA的序列。依据合成物的分子量和绝对重量以及PicoGreen的DNA定量技木，计算合成物所含的rRNA的基因拷贝的绝对数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10 ill合成物的稀释试剂含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝的rRNA。用上述的PCR系统扩增含不同浓度rRNA的巴贝斯虫，依此确定本发明检测巴贝斯虫的灵敏度。结果显示，此发明可以扩增反应系统中10个拷贝的巴贝斯虫的rRNA。高分辨率熔解曲线分析:PCR完成后，对巴贝斯虫的扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，观察不同株巴贝斯虫的熔解温度。由于设计的引物特异地扩增所有株的巴贝斯虫，而设计的探针和不同种的巴贝斯虫的核酸有不同程度的差异(图4、图5)，这样高分辨率熔解曲线技术方便地把巴贝斯虫分成2组(图6):1)Babesia felis和Babesia microti的溶角军温度为 57°C ；ii)Babesia gibsoni, Babesia canis, Babesia divergens 和 Babesiabovis的双峰的熔解温度为63°C和69°C。与现有技术相比，本发明的优点在于快速、特异、灵敏地检测巴贝斯虫的重要种，而且方便把6种重要的巴贝斯虫分为2组。巴贝斯虫诊断的主要现有技术包括:1)血液图片法观察巴贝斯虫法。此方法的灵敏度较低(仅能发现急性感染者血液中的大量巴贝斯虫)；而且此方法不能有效的区分巴贝斯虫和其它类似的血液寄生虫；2)血清学实验和ELISA检测抗巴贝斯虫的抗体。此技术的局限性是不能区分巴贝斯虫感染者和感染后的治疗康复者；3) PCR技术检测巴贝斯虫的核酸。此技术有较高的敏感性和特异性，但是现有的技术仅能扩增巴贝斯虫的单ー种或几个种，而不同种的巴贝斯虫的宿主特异性不强。本发明建立了一套高灵敏度和高特异性、快速检测巴贝斯虫、适合临床使用的分子诊断方法。此技术可同时检测多种动物(犬、猫、牛、羊、马；B.gibsoni, B.canis canis, B.canis rossi, B.cams vogii，B.felis, B.leo, B.dovis, B.equi，B.bigemina，caballi, B.capreoli, B.0docoilei, B.crassa, B.hongkangensis, B.vitalu, B.0vata, B.motasi, B.rodhaini，B.poelea)和人(Babesia divergens, Babesia microti)的巴贝斯虫，而不扩增其它虫媒血液寄生虫。
图1:巴贝斯虫定量PCR的上游引物-1。巴贝斯虫定 量PCR的上游引物-1的序列为:5’ -ATG GCT TTG CCG GCG ATG TATCA-3’。如图所示，此引物能有效地扩增感染猫和人的巴贝斯虫(Babesia felis, Babesiamicroti)，而和其它4个巴贝斯种的DNA有9_11个碱基对的差异，不能作为扩增Babesiagiosoni，Babesia cams, Baoesia divergens, Babesia bovis 核酸的引物。此外，用此引物在GenBank的BLAST搜索(仅搜索100%吻合的序列)显示51个结果(hits)，此引物和6个巴贝斯虫的rRNA序列完全吻合(B.felis, B.equi, B.microti, B.丄eo，B.rodnaini，B.poelea)。图2:巴贝斯虫定量PCR的上游引物_2。巴贝斯虫定量PCR的上游引物-2的序列为:5’ -TTT HGC GAT GKA CCA TTC AAGTTT CTG-3，o 如图所不，此引物能有效地扩增 Babesia gibsoni, Babesia canis, Babesiadivergens, Babesia bovis,而和其它2个巴贝斯种的DNA有8个碱基的差异，不能作为扩增Babesia felis和Babesia microti核酸的引物。此外，用此引物在GenBank的BLAST搜索(仅搜索100%吻合的序列)显示350个结果，此引物和15个巴贝斯虫的rRNA序列完全仅有ニ个degenerate减達(H和K)イヽ吻合(B.gibsoni, B.divergens, B.canis canis, B.canisrossi, B.cams vogli, B.bovis, B.bigemina, B.cabalii，B.capreoli，B.0docoilei，B.crassa, B.hongkangensis, B.vitalii，B.0vata, B.motasiノ。
图3:巴贝斯虫定量PCR的下游引物。巴贝斯虫定量PCR的下游游引物的序列为:5’ -CTG GCA CCA GAC TTG CCC TCCAAT-3’。下游引物和图示的序列成反义关系。如图所示，此引物和所有6个种的巴贝斯虫的 DNA 序列完全吻合(Babesia gibsoni, Babesia canis,Babesia divergens, Babesiabovis,Babesia ielis 和 Baoesia microtiノ。此外，用此引物在GenBank的BLAST搜索(仅搜索100%吻合的序列)显示604个結果，此引物和26个巴贝斯虫的rRNA序列完全吻合(B.gibsoni, B.divergens, B.caniscams, B.cams rossi, B.cams vogli, B.bovis, B.Digemina, B.caballi, B.capreoli, B.0docoilei, B.crassa, B.hongkangensis, B.vital 11, B.0vata, B.motasi, B.f el is, B.equi, B.microti, B.leo, B.rodhaini, B.poelea, B.0ccultans, B.0vis, B.bennetti, B.conradae, B.0rientalis)。图4:巴贝斯虫定量PCR的6-FAM探针。巴贝斯虫定量PCR的6-FAM探针的序列为5’ -ACG GGT AAC GGG GAA TTA GGGTTC-(6-FAM) _3，。此探针与巴贝斯虫 4 个种(Babesia gibsoni, Babesia canis, Babesiadivergens和Babesia bovis)的序列完全吻合,而和另外2个巴贝斯种(Babesia felis和Babesia microti)有2个喊基的不吻合。图5:巴贝斯虫定量PCR的Cy5.5探针。
巴贝斯虫定量PCR的下游引物的Cy5.5探针的序列为:5’ _(CY5.5)-ATT CCG GAGAGG GAG CCT GAG AAA-(PHOS)-3’。此探针与巴贝斯虫4个种的序列完全吻合(Babesiafelis, Babesia microti, Babesia gibsoni 和 Babesia divergens),而和另夕卜 2 个巴贝斯种(Babesia canis和Babesia bovis)有I个喊基的不吻合。图6:巴贝斯虫定量PCR的高分辨率熔解曲线分析。PCR完成后，对6个种巴贝斯虫的DNA扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，观察其熔解温度。本发明设计的巴贝斯虫定量PCR的6-FAM探针与巴贝斯虫4个种的序列完全吻合(Babesia gibsoni, Babesia canis, Babesia divergens 和Babesia bovis),而和另夕卜2个巴贝斯种有2个喊基的不吻合(Babesia felis和Babesia microti)(图4)。因此，Babesia felis 和 Babesia microti 的溶解温度(57°C )低于 Babesia gibsoni, Babesiacanis, Babesia divergens 和 Babesia bovis 的双峰的溶解温度(63°C和 69°C )。
具体实施例方式本发明的PCR检测方法所用引物和探针的核苷酸序列如下:上游引物-1:5，-ATG GCT TTG CCG GCG ATG TAT CA-3，上游引物-2:5’ -TTT HGC GAT GKA CCA TTC AAG TTT CTG-3，下游引物:5，-CTGGCA CCA GAC TTG CCC TCC AAT-3，6-FAM 探针:5，-ACG GGT AAC GGG GAA TTA GGG TTC-(6-FAM)-3’Cy5.5 探针:5，-(CY5.5) -ATT CCG GAG AGG GAG CCT GAG AAA-PH0S-3，本发明的检测方法过程如下:(I)制备 PCR 用的标准定量试剂(standards)。由 Intergrated DNA Technology合成巴贝斯虫的核酸序列，此序列涵盖PCR的扩增区域。依据合成物的分子量和绝对重量以及PicoGreen的DNA定量技木，计算合成物所含的rRNA的基因拷贝数目。随后，对合成物进行稀释，制备每10 合成物的稀释试剂含10000拷贝、1000拷贝、100拷贝、10拷贝的rRNA,作为PCR用的标准定量试剂。(2)制备待检样品的DNA模板。收集犬的全血于含EDTA的试管，用于DNA纯化；纯化的 DNA 洗脱在 100 u I T10Eai (含 IOmM Tris-HCl, 0.1mM EDTA，pH8.5)作为 PCR 的扩增模板。(3) PCR扩增体系。20 U I的扩增体系包含10 U I的样品DNA模板或者定量标准试剂(standard )、IxPCR缓冲液、0.7 y M上游引物-1、0.7 y M上游引物-2、I y M下游引物、
0.2 ii M的6-FAM探针、0.2 y M的Cy5.5探针、2个单位的商业化Taq酶、200 y M dNTP。(4) PCR扩增循环參数。PCR扩增包括18个温度递减的高严谨循环(high-stringency step-down)和 25 个欠严谨的突光获得循环(relaxed-stringencyfluorescence acquisition)。18个温度递减的高严谨循环:6xl5sec@95° C, 60seci74° C;9xl5seci95° C, 60seci72° C; 3xl5seci95° C, 10sec@70° C, 15sec@72。C.25 个欠严谨的荧光获得循环:25xl5sec@95° C，8sec@58。C, 10seci65° C, andl5seci72° C。(5)高分辨率熔解曲线分析。PCR扩增结束后，立即实施高分辨率熔解曲线分析，温度从38° C上升到80° C，以每秒0.2° C递增。数据分析是分析705nm:530nm(F3/Fl)的荧光强度的比例。F3/F1的第一衍生值(_d(F3/Fl)/dt)被读为该DNA的熔解温度。(6) PCR结果的判定和定量分析。DNA模板的制备过程均设有DNA提取的阴性和阳性对照，随后的PCR扩增对象包括待测样品的DNA模板、DNA提取的阴性和阳性对照、定量的标准试剂海10 ill standard含104，IO3, IO2, IO1拷贝的巴贝斯虫的rRNA)。本发明的PCR扩增效率高，有效地扩增含IO1拷贝的巴贝斯虫的rRNA。
实施例1:巴贝斯虫阳性株(Babesia gibsoni)的PCR扩增从感染Babesia gibsoni的阳性犬(17例)获得的全血,并用商业试剂盒且用常规方法进行DNA提取，取10 ill作为PCR模板。用本发明技术进行PCR扩增以及高分辨率熔解曲线分析(具体技术细节如上所述)。结果显示，PCR能特异高效的扩增所有17例阳性株的犬巴贝斯虫，且出现双峰(63°C和690C )的熔解温度。实施例2:犬感染巴贝斯虫的流行病学调查从372例来兽医院做体检、疫苗注射、或就诊的犬获得的全血，用商业试剂盒和常规的方法进行DNA提取，取10 Ul作为PCR模板。用本发明技术进行PCR扩增(具体技术细节如上所迷)。结果显示，22%的犬(90/372)有巴贝斯虫的感染。感染巴贝斯虫的犬，仅6%显示临床症状，13%表现血常规异常；而81%的感染犬完全健康，不表现临床症状和异常血常规。此PCR诊断结果经电泳、测序等试验确认。
权利要求
1.ー种巴贝斯虫的荧光定量PCR检测和分型的引物及探针，其特征在于检测引物为: 上游引物-1:5’ -ATGGCTTTGCCGGCGATGTATCA-3’ 上游引物-2:5’ - TTTHGCGATGKACCATTCAAGTTTCTG -3’ 下游引物:5’ - CTGGCACCAGACTTGCCCTCCAAT -3’ 所述探针为: 6-FAM 探针: 5，- acgggtaacggggaattagggttc-(6-FAM) _3’Cy5.5 探针:5，_ (Cy5.5) _attccggagagggagcctgagaaa_phos_3，
2.ー种巴贝斯虫的荧光定量PCR检测和分型试剂盒，包括5倍定量PCR反应液22μl,以及22 μl的5倍引物和探针的混合液；所述引物和探针混合液含浓度为5 PM的上游引物-1、上游引物-2、5 PM下游引物、1PM的6-FAM探针、1 PM的Cy5.5探针。
3.—种巴贝斯虫分型方法，该方法包括以下步骤: (1)用权利要求1所述引物和探针PCR扩增待测样本，扩增出290bp的条带，且荧光检测在640nm波长增强的为巴贝斯虫阳性样本； (2)PCR完成后，对步骤(1)巴贝斯虫阳性样本扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，根据熔解温度对巴贝斯虫进行分型，分型标准是:i) Babesia felis取Babesia microti的溶角军温度为 57 °C ;ii) Babesia gibsoni, Babesia can is, Babesia di vergens 和Babesiaか的双峰的熔解温度为63°C和69°C。
全文摘要
一种巴贝斯虫的荧光定量PCR检测和分型的引物、探针及试剂盒。所述引物序列如SEQIDNO.1、2和3所示，所述探针为SEQIDNO.4和5。用上述引物和探针PCR扩增待测菌，扩增出290bp条带，且荧光检测在640nm波长增强的为埃里希氏菌阳性样本；再根据熔解温度可对巴贝斯虫进行分型。本发明的技术优势明显，具有很高的特异性和敏感,且可以方便的检测重要种的巴贝斯虫。
文档编号C12Q1/68GK103103286SQ20131006886
公开日2013年5月15日 申请日期2013年3月5日 优先权日2013年3月5日
发明者王成明, 陶建平 申请人:扬州大学