专利名称：一种敲除牛mstn基因的打靶载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学及生物技术领域，涉及一种启动子捕获型打靶载体，具体地，涉及一种敲除牛MSTN基因的启动子捕获型打靶载体及其应用。
背景技术：
肌肉生长抑制素(MSTN)是特异性骨骼肌生长发育负调控因子，其活性的丧失或降低，会引起动物肌肉的过度发育，牛MSTN基因的自然突变会引发“双肌”现象。双肌牛比正常牛具有较高的瘦肉率和较好的肉质，且脂肪率低，口感良好，但国内现有品种中缺少“双肌”表型的牛。通过基因敲除技术构建了 MSTN基因突变纯合体小鼠，发现并验证了生长抑素基因突变鼠的体重比正常鼠大30%，而且这种差异在成年鼠中不受年龄和性别的影响(McPherron A C, 1997, Nature 387,83-90)。以双肌现象著称的比利时蓝牛(BelgianBlue)和皮德蒙特牛(piedmontese)就是MSTN基因发生自然突变。比利时蓝牛MSTN基因序列中的第3个外显子上缺失了 11个核苷酸，是导致MSTN基因阅读框发生移位，使MSTN被截短，不能发挥其生物的活性；皮尔蒙特牛则是由于第3个外显子发生了错误突变，导致了在成熟蛋白区内酪氨酸代替了保守的半胱氨酸，而在第I个外显子也发生了突变，造苯丙氨酸代替了亮氨酸，起结果均使肌肉生成抑制素的功能全部或者几乎全部丧失(KambadurR，1997，Genome Res 7 (9),910-916) MSTN基因的发现，为生物育种工作者提供了新的思路。但是，育种工作者利用现有的双肌动物进行繁育存在育种速度慢和杂交性状不稳定等问题。2000年，McCreath等利用体外培养的绵羊胎儿成纤维细胞进行COLlAl基因的定点突变，并利用定点突变成功的细胞作为体细胞克隆的核供体，已经成功获得基因定点修饰的活的小羊，这为家畜类动物的基因修饰提供了有效的途径(McCreath，2000，Nature 405，1066-1069)。另外，研究表明，在体细胞中进行基因打靶，启动子捕获型打靶载体的效率比传统的有启动子打靶载体联合正负筛选策略的效率高出 100 倍左右(ffaldman A S，1992，Crit Rev Oncol Hematol 22(1)，127-128)。目前，在家畜MSTN基因敲除研究方面，国内外在载体构建方面做了大量的研究工作，获得了一些MSTN基因敲除细胞系。但动物出生的报道相对较少，其中利用启动子捕获型载体进行MSTN基因突变的就更加罕见。
发明内容
本发明的目的在于提供一种敲除牛肌肉生长抑制素MSTN基因的启动子捕获型打靶载体；本发明的另一个目的在于提供该启动子捕获型打靶载体的应用。为达到上述目的，本发明的技术方案是从和牛耳部组织中提取牛的基因组DNA，根据Genebank报道的牛MSTN基因序列设计长短同源臂引物，通过PCR方法从基因组DNA中克隆同源臂，将同源臂分别克隆到表达载体，经过限制性内切酶酶切和测序分析确定同源臂的准确性后，采用酶切和连接的方法将长短同源臂分别连接到基础载体PIII中，最后通过限制性内切酶酶切鉴定同源臂连接的正确性，构建获得一种敲除牛MSTN基因的启动子捕获型打靶载体PII1-MSTN(构建过程参见图1)。MSTN基因的核苷酸序列在进化过程中高度保守，包括3个外显子和2个内含子，其中第三个外显子是它的成熟区；牛的MSTN基因位于2号染色体的近着丝粒端距离TGLA44(微卫星标记，ms) 3.1cM的位置，包括6691个碱基，3个外显子分别位于10134 10506、12335 12708和14741 15121位置上。基础载体PIII包含一个不含启动子的绿色荧光蛋白EGFP基因和一个含自身启动子PGK的新霉素抗性基因(Neolr)，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。本发明提供的启动子捕获型打靶载体为PII1-MSTN，包含MSTN基因长短同源臂3’同源臂和5’同源臂，PII1-MSTN载体中的MSTN基因同源臂序列能够靶向性界定并敲除基因组上的靶基因。所述的5’同源臂不包含MSTN基因自身启动子的全部序列，且最后一个碱基为MSTN第一外显子起始密码子上游最后一个碱基。所述5’同源臂核苷酸序列如SEQ ID NO:1的8834 10133 ;3’同源臂核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 的 15091 21957。打靶载体PII1-MSTN可敲除牛MSTN基因第一、二外显子的全部和第三外显子的大部分，敲除的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；PII1-MSTN核苷酸序列如SEQ ID N0:3，包含长约1.3kb和6.8kb的牛MSTN基因同源臂序列、无启动子的绿色荧光蛋白基因EGFP和自身带有启动子PGK的新霉素抗性基因Neolr表达框架。当打靶载体与靶基因序列发生同源重组时，通过表达标记基因，从而确定PII1-MSTN载体中的MSTN基因同源臂序列靶向性界定并敲除基因组上的靶基因。本发明用于扩增上述MSTN基因同源臂的引物，分别包括5’同源臂和3’同源臂的上游序列和下游序列的两组PCR引物对。本发明提供了用 PCR方法扩增牛MSTN基因同源臂的具体引物:5’ 同源臂上游引物:TTTAAGCTTTCATTTGATTAGACCTTGTGGCTCC,5’ 同源臂下游引物:TTTAAGCTTGGTTTTAAAA TCAATACAATCTTTT ；3’ 同源臂上游引物:GATCCGCGGCATGGTAGTAGATCGCTGTGGGTGT,3’同源臂下游引物:AATCCGCGGAGTAGAATGGTCTTGAATGGTTAGGA,下划线部分为酶切位点。本发明提供一种构建敲除MSTN基因启动子捕获型打靶载体的方法，包括如下步骤:I)提取牛组织基因组DNA ；2)利用上述引物用PCR方法从步骤I)的基因组DNA中克隆MSTN基因的长短同源臂，分别为3’同源臂和5’同源臂；3)将同源臂克隆到表达载体经限制性内切酶和测序分析进行鉴定；4)将鉴定正确的同源臂连接到基础载体PIII中，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，构建得到敲除牛MSTN基因的打靶载体。其中步骤2)所述的PCR方法扩增5’同源臂，其反应条件为:95°C变性50s，60°C复性50s，72°C延伸2min，共35个循环；所述的PCR方法扩增3’同源臂，其反应条件为:95°C变性50s，59。。复性50s，72。。延伸7min，共35个循环。
G418 (Geneticin selective antibiotic 418)是一种抗生素类药物，当 Neor 基因被整合进真核细胞DNA后，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。本发明还提供一种敲除牛MSTN基因的方法，利用电转染的方法将打靶载体导入牛胎儿(50天胎龄)成纤维细胞中，根据置换型打靶载体的原理，如图2中打靶载体PII1-MSTN的同源臂序列N5mstn和N3mstn分别与野生型MSTN基因发生交换，获得中靶后MSTN基因序列，即MSTN基因的第一外显子和第二外显子的全部以及第三外显子的大部分被从基因组内置换掉，而取代它的是绿色荧光蛋白基因和新霉素抗性基因。发生正确敲除的中靶后细胞将丧失转录表达肌肉生长抑制素的功能，而表现出绿色荧光和新霉素抗性。这时利用G418筛选将不带有新霉素抗性的细胞杀死，从带有新霉素抗性的细胞克隆中挑选表达绿色荧光蛋白的阳性克隆。再利用PCR检测和DNA测序的方法对阳性克隆进行鉴定，确定哪些克隆是真正成功敲除MSTN基因的。本发明提供了启动子捕获型打靶载体PII1-MSTN在培育肉用牛品种中的应用。启动子捕获通常采用IRES序列引导筛选标记基因的表达，而本发明用来捕获内源MSTN基因启动子的绿色荧光蛋白基因的上游没有连接IRES序列，绿色荧光蛋白的起始密码子ATG正好落在MSTN基 因原来的起始密码子上。本发明将同源左臂设计成一个长约
1.3kb的片段，这样的长度既有利于同源重组的发生，也没有完全包含MSTN启动子区域，不影响绿色荧光蛋白捕获启动子作用的发挥。另外，本发明提供的启动子捕获型打靶载体PII1-MSTN，能够准确地敲除MSTN基因的第一、二外显子的全部和第三外显子的大部分，可以达到使MSTN基因发生失活的目的；且中靶细胞既具有一定的G418药物抗性，又表达绿色荧光蛋白，只有同时具备这两种特性的细胞克隆才会被用于进一步同源重组鉴定，大大简化同源重组细胞克隆的筛选工作。本发明提供的启动子捕获型打靶载体pii1-mstn可以用来培育敲除了 MSTN基因的转基因肉用牛。
图1是启动子捕获型打靶载体PII1-MSTN的构建过程图；图2是载体PII1-MSTN打靶过程示意图；图3是和牛耳组织基因组DNA电泳结果，其中1:DNA marker λ -HindIII ；2:和牛耳部组织基因组DNA;图4是PCR扩增的牛MSTN基因5’同源臂的电泳图谱，I:分子量标准(IkbLadder) ；2:PCR扩增的牛MSTN基因5，同源臂，其PCR产物为1327bp ；图5是PCR扩增的牛MSTN基因3’同源臂的电泳图谱，1:分子量标准(DNAmarker λ -EcoT14I) ；2:PCR扩增的牛MSTN基因3，同源臂，其PCR产物为6885bp ；图6是利用限制性内切酶对PII1-N5mstn质粒进行酶切鉴定的电泳图谱，a:分子量标准(DNA marker λ -EcoT14I), b:分子量标准(IOObpDNALadder), I:PII1-N5mstn 质粒；2 4:用限制性内切酶Hindlll、BglII和Sac II分别酶切鉴定PII1-N5mstn质粒，HindIII酶切产物为5640bp和1315bp,BglII酶切产物为6542bp和413bp，Sac II酶切产物为 6955bp ；
图7是利用限制性内切酶对PII1-MSTN质粒进行酶切鉴定的电泳图谱，a:分子量标准(DNA marker λ -Hindi 11), b:分子量标准(IOObp DNALadder), 1:PIII_MSTN 质粒；2 6:用限制性内切酶EcoR 1、Sac I1、HindI1、BglII和Cla I分别酶切鉴定PII1-MSTN质粒，EcoR I酶切产物为13828bp，Sac II酶切产物为6955bp和6873bp,HindII酶切产物为 8245bp 和 5683bp, BglII 酶切产物为 5789bp、3958bp、3668bp 和 413bp, Cla I 酶切产物为 13828bp。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1牛耳组织基因组DNA的提取称取500mg保存于_80°C超低温冰箱的和牛(来自于内蒙古自治区四子王旗牧场)的耳部组织，用Promega公司的Wizard Genomic DNAPurification Kit试剂盒，按鼠尾组织DNA提取方法，进行和牛耳部组织基因组DNA的提取，最后采用100 μ L无菌蒸馏水回溶DNA。用紫外分光光度计检测提取的DNA的浓度和340nm波长下的OD值，并取I μ L进行琼脂糖凝胶电泳，检测DNA完整性。电泳结果显示提取到完整的和牛基因组DNA，见图3。实施例2MSTN 基因同源臂 pMD19-T_N5mstn 和 pMD19-T_N3mstn 的获得根据模板序列G enBank Accession N0.NC_007300,分别设计启动子捕获型打革巴载体的MSTN基因5’同源臂(位于SEQ ID NO:1的8834 10133)的上、下游引物ShortA(TTTAAGCTTTCATTTGATTAGACCTTGTGGCTCC)和 ShortB (TTTAAGCTTGGTTTTAAAA TCAATACAATCTTTT)，及3’同源臂(位于SEQ ID NO:1的15091 21957)的上、下游引物LongA(GATCCGCGGCATGGTAGTAGATCGCTGTGGGTGT)和 LongB (AATCCGCGGAGTAGAATGGTCTTGAATGGTTAGGA)，下划线部分为酶切位点。以上述牛耳组织基因组DNA为模板，分别进行PCR合成启动子捕获型打靶载体的MSTN基因的5’和3’同源臂。PCR反应均为20 μ L反应体系:上下游引物各2 μ L，模板DNA0.5 μ L，10 X Buffer2 μ L, 25mM MgCl2L 4 μ L, 2.5mM dNTPs3 μ L, EXTaq0.2 μ L,灭菌 ddH20 8.9 μ L。5’同源臂的PCR反应条件:95°C变性50s，60°C复性50s，72°C延伸2min，共35个循环。3’同源臂的PCR反应条件:95°C变性50s，59°C复性50s，72°C延伸7min，共35个循环。分别将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(参见图4和5)后，利用大连宝生物公司的DNA凝胶回收试剂盒回收获得MSTN基因5’同源臂和3’同源臂，并将它们连接到PMD19-T Simple (购自大连宝生物公司)载体上，连接产物分别转化大肠杆菌DH5 α，分别挑取连接阳性菌落进行菌体扩培和质粒提取，获得MSTN基因同源臂pMD19-T-N5mstn和pMD19-T-N3mstn 两种质粒。实施例3 5’同源臂pMD19-T-N5mstn的酶切鉴定及测序分析取IyL 5’同源臂pMD19-T-N5mstn质粒，分别利用限制性内切酶HindIII和BglII进行酶切鉴定，它们的酶切位点分别位于5’同源臂的两端和内部，可初步检测PCR获得的5’同源臂的正确性。酶切体系均为IOyL:5’同源臂pMD19-T-N5mstn质粒lyL，10\81^€61'14 1^，内切酶0.5 4 1^，灭菌(1(1!120 7.5 μ L0将酶切鉴定正确的质粒进行DNA测序分析，结果表明5’同源臂与GenBank报道的牛MSTN基因序列的同源性为96%。实施例43’同源臂pMD19-T-N3mstn的酶切鉴定及测序分析取IyL 3’同源臂pMD19-T_N3mstn质粒，分别利用限制性内切酶Sac II和HindIII进行酶切鉴定，它们的酶切位点分别位于3’同源臂的两端和内部，可初步检测PCR获得的3’同源臂的正确性。酶切体系同实例3。将酶切鉴定正确的质粒进行DNA测序分析，结果表明3’同源臂与GenBank报道的牛MSTN基因序列的同源性为97%。实施例55’同源臂连入基础载体PIII将测序正确的克隆的质粒pMD19-T-N5mstn与基础载体PIII同时用HindIII酶切，酶切体系同前，分别回收1315bp的5’同源臂和5640bp的骨架载体片段，按照摩尔比2:1的比例16°C经T4DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌DH5a，提取质粒(命名为PII1-N5mstn)。利用限制性内切酶HindII1、Bgl II和Sac II酶切鉴定连接的方向和正确性(参见图6)，结果表明5’同源臂序列正确插入基础载体PIII中。实施例6 3’同源臂连入基础载体PIII将测序正确的克隆的质粒pMD19-T_N3mstn与质粒PII1-N5mstn同时用Sac II酶切，酶切体系同前，分别回收6873bp的3’同源臂和6955bp的线性PII1-N5mstn片段，按照摩尔比2: I的比例16°C经T4DNA连接酶连接过夜，转化大肠杆菌DH5a，提取质粒。利用限制性内切酶EcoRI，Sac II，HindII，Bgl II和Cla I酶切鉴定连接的方向和正确性，参见图7，结果表明3’同源臂序列正确插入基础载体PIII中，成功获得用于牛MSTN基因敲除的启动子捕获型打靶载体PII1-M STN。 实施例7载体PII1-MSTN的打靶实例用限制性内切酶Cla I于30°C酶切打靶载体PII1-MSTN质粒4_6h线性化质粒PII1-MSTN后，取牛胎儿成纤维细胞和线性化的质粒PII1-MSTN混匀，电击转染细胞(转染条件:细胞密度为I X IOVmL,体积400 μ 1，质粒含量20 μ g，4mm电击杯中，500V电压、4ms电脉冲时间，电脉冲次数I次)，转染后的细胞以密度3X 105/100mm培养。转染后的第48小时加入G418进行抗药性筛选，筛选7-10天后，显微镜下察看细胞克隆，并用自制的克隆杯和胰蛋白酶消化并用移液器吸取100个细胞以上克隆，且在荧光显微镜下分选出绿荧光细胞克隆和非绿荧光细胞克隆。将绿色荧光细胞单克隆扩大培养后，一部分冷冻保存，一部分提取基因组等待鉴定。以基因组染色体定点整合序列为模板，设计跨越5’同源臂序列的PCR引物，利用PCR法和DNA测序检测同源重组事件。PCR方法所用引物为:Pa:5/ -CGATGCCTGCTTGCCGAATATCATG-3'(位于 pPLP-MSTN载体内 Neo 基因上)和Pb:5/ -TCCTGGTGTCTCATTTCCTCAGAGC-3'(位于 pPLP-MSTN 载体的 3’ 同源臂外侧);反应条件:95°C50s, 63°C 50s，72°C 7min，35 个循环；通过 PCR 法扩增出 2.4kb 的片段，并进行DNA测序确定序列的准确性。
当检测到的序列同时包含MSTN基因5’同源臂上游部分序列、5’同源臂全部序列和egfp基因部分序列时，认为该细胞已发生MSTN基因敲除。将MSTN基因敲除的细胞作为体细胞核移植的供体，进行牛体细胞克隆实验及胚胎移植实验，即可通过受体母牛的妊娠和分娩产下MSTN基因敲除的犊牛。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范 围。
权利要求
1.一种敲除牛肌肉生长抑制素MSTN基因的启动子捕获型打靶载体。
2.按权利要求1所述的打靶载体，其包含MSTN基因上下游同源臂3’同源臂和5’同源臂，所述5’同源臂的最后一个碱基为MSTN第一外显子起始密码子上游最后一个碱基，在同源臂之间还具有标记基因。
3.按权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述5’同源臂核苷酸序列如SEQIDNO:1的8834 10133 ;3’同源臂核苷酸序列如SEQID NO:1的15091 21957。
4.按权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，所述标记基因包括报告基因EGFP和带有启动子PGK的新霉素抗性选择基因Nec/。
5.按权利要求1 4之一所述的打靶载体，其为PII1-MSTN，质粒图谱如图1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3o
6.一种扩增权利要求1 5之一所述的打靶载体中MSTN基因同源臂的引物，其分别包括5’同源臂和3’同源臂的上游序列和下游序列的两组PCR引物对。
7.按权利要求6所述的引物，其特征在于，所述引物为: 5’ 同源臂上游引物:TTTAAGCTTTCATTTGATTAGACCTTGTGGCTCC, 5’ 同源臂下游引物:TTTAAGCTTGGTTTTAAAA TCAATACAATCTTTT ； 3 ’ 同源臂上游引物:GATCCGCGGCATGGTAGTAGATCGCTGTGGGTGT， 3’ 同源臂下游引物:AATCCGCGGAGTAGAATGGTCTTGAATGGTTAGGA0
8.一种构建权利要求1 5之一所述打靶载体的方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)提取牛组织基因组DNA; 2)以权利要求6或7所述的引物用PCR方法从步骤I)的基因组DNA中克隆MSTN基因的长短同源臂，分别为3’同源臂和5’同源臂； 3)将同源臂克隆到表达载体经限制性内切酶和测序分析进行鉴定； 4)将鉴定正确的同源臂连接到基础载体PIII中，该基础载体核苷酸序列如SEQIDNO:2所示，构建得到敲除牛MSTN基因的打靶载体。
9.按权利要求8所述的方法，其中步骤2)所述的PCR方法扩增5’同源臂，其反应条件为:95°C变性50s，60°C复性50s，72°C延伸2min，共35个循环；所述的PCR方法扩增3’同源臂，其反应条件为:95°C变性50s，59°C复性50s，72°C延伸7min，共35个循环。
10.一种敲除牛MSTN基因的方法，其特征在于，利用电转染的方法将权利要求1 5之一所述的打靶载体导入胎儿成纤维细胞中，通过同源臂的置换，达到敲除MSTN基因的目的。
11.按权利要求1 5之一所述的打靶载体在培育肉用牛品种中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种敲除牛肌肉生长抑制素MSTN基因的启动子捕获型打靶载体PIII-MSTN，其可敲除牛MSTN基因第一、二外显子的全部和第三外显子的大部分，敲除的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示；PIII-MSTN核苷酸序列如SEQ ID NO3，包含长约1.3kb和6.8kb的牛MSTN基因同源臂序列、无启动子的绿色荧光蛋白基因EGFP和自身带有启动子PGK的新霉素抗性基因Neor表达框架。本发明的启动子捕获型打靶载体PIII-MSTN可用于培育敲除了MSTN基因的转基因肉用牛。
文档编号C12N15/09GK103088044SQ20111034221
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月2日 优先权日2011年11月2日
发明者李荣凤, 赵丽华, 李雪玲, 梁浩, 云亭 申请人:内蒙古大学