专利名称：一种基因敲除打靶载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因敲除打靶载体及其应用，具体地说，涉及一种无启动子的同 时带有正、负筛选基因的基因敲除打靶载体及其应用。
背景技术：
2000年第一例体细胞基因打靶克隆羊诞生之后，体细胞基因打靶结合核移植技术 被广泛应用于对大动物基因组进行定点修饰。基因打靶基于的原理是DNA分子间的同源 重组。在大动物体细胞中，同源重组的概率非常低，表现在细胞转染后经过药物筛选获得 的随机整合的细胞远远多于同源重组的细胞，往往需要筛选大量的细胞才能获得基因打靶 的细胞。尽管之前的研究采用很多筛选方法，比如正负筛选、无启动子筛选等用来排除随 机整合的细胞，但这种富集基因打靶事件的效率一般在0.41% -11% (Kuroiwa等，2004 ； Takahagi, 2005 ；Shen，2007)。通常需要从上百个细胞克隆点中筛选出几个发生了基因打靶 的细胞克隆，极大地增加了后续细胞冻存和鉴定的工作。PRNP基因编码朊蛋白。结构异常的朊蛋白是疯牛病和羊瘙痒病的致病蛋白。理论 上讲，敲除了 PRNP基因的牛羊将不再被疯牛病或瘙痒病传染。目前，对牛羊的PRNP基因的 敲除已经有3个课题组获得成功，他们使用的载体及细胞筛选方法富集基因打靶的效率分 别为 10. 3% (55/533，Denning 等，2001)、0· 6% (1/163，Yu 等，2006)、4· 9% (10/204, Zhu, 2008) ,6. 4% (13/203，Kuroiwa, 2004) ,5. 2% (17/327，Kuroiwa，2004)，也就是说，他们需 要从上百个细胞中筛选出几个发生了 PRNP基因打靶的细胞，很容易丢失阳性细胞。本发明利用构建的无启动子打靶载体和负筛选基因简单高效的获得了 PRNP基因 敲除细胞，富集效率为100% (2/2)和60% (3/5)。本研究的最大优点是细胞筛选方法简 单，不需大量人力物力，以及极大地方便了后续的细胞冻存和鉴定，大大降低了基因打靶的 成本。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的富集基因打靶细胞效率低而存在的缺陷，提供一种 基因敲除打靶载体，所要解决的技术问题是通过基因敲除打靶载体转染细胞，提高富集基 因打靶细胞效率，从而简化基因打靶细胞的筛选与鉴定工作，大大降低了基因打靶的成本。本发明的目的及解决其技术问题是采用以下的技术方案来实现的。依据本发明提 供的一种基因敲除打靶载体，其包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序 列，所述重组酶识别序列的另一端分别与被敲除基因的5’同源臂和3’同源臂相连，所述两 同源臂的内部不具有启动正筛选基因表达的启动子，在所述同源臂的外侧还具有负筛选基 因。本发明的目的及解决其技术问题还可以采用以下的技术措施来进一步实现。前述的基因敲除打靶载体，所述正筛选基因为编码新霉素磷酸转移酶(neo)、潮 霉素B磷酸转移酶(hph)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)或嘌呤霉素乙酰转移酶(puro)的基因。前述的基因敲除打靶载体，所述负筛选基因为胸腺去氧核苷(DTA)，或者编码次黄 嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)、胸腺嘧啶激酶(tk)、白喉 毒素(DT)或单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)的基因。前述的基因敲除打靶载体，所述重组酶识别序列为Cre酶识别序列或FLP酶识别 序列。前述的基因敲除打靶载体，所述同源臂为牛PRNP基因的序列。前述的基因敲除打靶载体，其为LoxPneo-PRNP KO或LoxPhyg-PRNP KO0所述打靶载体在胞内定点敲除基因中的应用。一种提高基因打靶细胞富集率的方法，使用前述的打靶载体转染细胞，通过含有 与正筛选基因相应药物的培养基筛选阳性克隆，使阳性克隆得到富集。一种敲除牛PRNP基因的方法，其包括使用LoxPneo-PRNP KO和LoxPhyg-PRNP KO 之一的打靶载体转染细胞并用相应的药物筛选培养基进行筛选，再用另一个打靶载体转染 细胞并用相应的药物筛选培养基进行筛选。前述的敲除牛PRNP基因的方法，其使用打靶载体LoxPneo-PRNPKO转染牛成纤维 细胞，在含有G418的细胞培养基上筛选得到阳性细胞克隆，并对阳性细胞克隆进行鉴定； 用LoxPhyg-PRNP KO转染PRNP基因一个等位基因发生敲除的牛成纤维细胞，并用含潮霉素 B的细胞培养基筛选阳性细胞克隆，并对阳性细胞克隆进行鉴定。借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果(1)本发明首次将无启动子打靶载体与正、负筛选基因结合使用，因此，能够极大 地排除随机整合的细胞，提高打靶细胞富集效率；(2)在构建基因敲除打靶载体时，本发明首次在无启动子的正筛选基因两侧引入 LoxP序列，以方便后续的标记基因的删除；(3)经基因敲除打靶载体转染后的细胞，富集基因打靶细胞效率高，细胞筛选方法 简单，不需大量人力物力，极大地方便了后续的细胞冻存和鉴定，大大降低了基因打靶的成 本。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够 更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。
图1为本发明较佳实施例PRNP基因无启动子打靶载体构建流程图。图2为本发明较佳实施例pMD19-T-5，同源臂质粒酶切鉴定图，M，Ikb DNA marker ； 1，质粒对照；2，Not I单酶切，5kb ；3，Not I和BsiW I双酶切，2. 7kb+2. 3kb ；4，5，同源臂 PCR产物对照，2. 3kb。图3为本发明较佳实施例pGEM-T-3，同源臂质粒酶切鉴定图，M，Ikb DNA marker ； 1，质粒对照；2，Nhe I 和 Sal I 双酶切，7. lkb+3. Okb ；3，Nhe I 单酶切，10. lkb。图4为本发明较佳实施例LoxPhyg-PRNP KO质粒酶切鉴定图，1，15kb DNA marker ； 2，Nhe I 单酶切，15，472bp ;3，Sac II 酶切，12. 3kb+3. Ikb ;4，Not I 和 Sal I 双酶切，10. 9kb+4. 5kb ；5，Not I 和 Nhe I 双酶切，11. 5kb+3. 9kb ；6，质粒对照；7，Ikb DNA marker 图5为本发明较佳实施例LoxPneo-PRNP KO质粒酶切鉴定图，1，15kb DNA marker ； 2，Sac II 单酶切，15，113bp ;3，Not I 和 NheI 双酶切，11. 5kb+3. 5kb ;4，Not I 和 Sal I 双酶切，10. 6kb+4. 5kb ;5，Nhe I 和 Sal I 双酶切，8. lkb+7. Okb ;6，质粒对照；7，Ikb DNA markerο
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1 PRNP基因无启动子打靶载体的构建PRNP基因无启动子打靶载体的构建过程请参阅图1。在本实施例中，取牛胎儿皮肤组织剪碎成Imm3左右的小块，DMEM/F12清洗两遍后 分批植块于含ImL DMEM/F12+10% FBS的25cm2的培养瓶中，待组织块贴壁牢固后再补加 DMEM/F12+10% FBS至6mL，于37°C、5% CO2培养箱培养6 7天，每2天换液1次，待细胞 生长汇合后，以0. 25%胰蛋白酶消化传代2 3次，分批以DMEM/F12+20% FBS+10% DMSO 冻存，获得牛胎儿成纤维细胞。以牛胎儿成纤维细胞的基因组为模板，分别扩增5’同源臂和3’同源臂。5’ 同源臂的引物为，LoxP-5F:5’ -TTGC/GGCCGCTATAACACAG CCAGGCATTC AG-3，， 下划线部分为Not I限制性内切酶识别位点；LoxP-5R :5，TCT C/GTACG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAGTTAT GATGAC TTATCTGCAA AATAAAG-3，，下划线部分为 BsiW I 限制 性内切酶识别位点，斜体部分是IoxP序列。5 ’同源臂长度为2，323bp，从PRNP基因(Genbank No. AJ298878)的63，256bp到65，578bp处，包含了 PRNP基因第三外显子上游2，313bp和第 三外显子前IObp的序列(即第三外显子翻译起始位点ATG上游的序列)。3，同源臂的引物为，LoxP-3F 5，-ATTG/CTAGCCCTCTTATACATTTTGGCAGTG-3，，下 划线部分为Nhe I限制性内切酶识别位点；LoxP-3R:5，-TAT G/TCGAC GAAACAGTGGAAAGTG TCAGAC-3’，下划线部分为Sal I限制性内切酶识别位点。3’同源臂长度为7，074bp，从PRNP 基因的66，020bp到73，093bp处，包含了 PRNP基因第三外显子内452bp以后直到第三外显 子下游3，434bp的序列。因此，经过基因敲除后，PRNP基因的第三外显子将会被删除442bp， 此序列恰好是PRNP基因编码框的前442bp。同源臂的PCR反应体系反应体系为50μ 1反应体系，其中牛胎儿成纤维细胞基因 组 2μ KlOOng/μ 1)，primer(20pmol/μ 1)各 1μ 1，dNTP(10mM)8y 1，5XLA PCR Buffer 5 μ 1，LA Taq 酶(Takara) 0. 5 μ 1，用水补足 50 μ 1 体系。反应条件如下94°C lmin，98°C 10sec68°C 24sec，30 个循环，68°C 10min，4°C保存。将PCR扩增产物与pMD19-T载体(TaKaRa)或pGEM_T载体(Promega)进行连接、 转化，挑取重组子，进行酶切和测序鉴定，请参阅图2和图3。测序结果表明该序列与已知序 列的同源性达到99. 9%，可以作为同源臂使用。在牛中PRNP基因是位于13号染色体的单拷贝基因，因此，为了敲除PRNP基因的 两个等位基因需要对成纤维细胞进行两轮打靶，这就需要使用两种不同的正筛选基因进行 细胞筛选。本发明选择了新霉素基因和潮霉素B基因作为两种正筛选基因。本发明利用PCR扩增的方法，分别从打靶载体骨架载体pPGKneoLoxP2PGKDTA (Clontech 公司)和商业化载体pIREShyg3 (Clontech 公司)上扩增出 neo-polyA序列和 hyg-polyA 序列。扩增 neo-polyA序列的 PCR 引物为，LoxP-neoF 5'-TCT C/GTACGCCACCATGGG ATCG GCCATTGAACAAG-3，，下划线部分为BsiWI限制性内切酶识别位 点，ATG 为 neo 基因翻译起始位点；LoxP-neoR :5，-TAA G/CTAGC GGACCTAATAACTTCGTATAAT GTATGCTATAC-3，，下划线部分为Nhe I限制性内切酶识别位点。PCR产物大小为1，216bp， 包括完整的neo-polyA序列及其下游的IoxP序列。扩增hyg-polyA 序列的 PCR 引物为，LoxP-hygF :5，TCTC/GTACGCCACCATGGA TAGATC CGGAAAGCCTG-3，，下划线部分为BsiWI限制性内切酶识别位点，ATG为hyg基因翻 译起始位点LoxP-hygR :5’ -TAAG/CTAGC ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGA AG TTATCTAG AATGCAGTGAAAAAAATG-3，，下划线部分为Nhe I限制性内切酶识别位点，斜体部分是IoxP序 列。PCR产物大小为l，614bp，包括完整的hyg-polyA序列及通过PCR引物添加的IoxP序 列。扩增neo-polyA序列和hyg-polyA序列的PCR反应体系为50 μ 1反应体系，其中 质粒 1μ KlOOng/μ 1) ,primer (20pmol/μ 1)各 1 μ 1, dNTP (IOmM) 6 μ 1，5XLA PCR Buffer 5 μ 1，LA Taq 酶(Takara) 0. 3 μ 1，用水补足 50 μ 1 体系。反应条件如下94°C 5min，94°C 20sec60°C 30sec 72°C lmin，35 个循环，72°C 7min，4°C保存。将PCR扩增产物与Promega pGEM_T载体进行连接、转化，挑取在T载体多克隆位 点处连接顺序为Not I-Bsiff I-neo/hyg-polyA-Nhel的重组子，进行酶切和测序鉴定。测 序结果表明neo-polyA序列和hyg-polyA序列与载体上的相应序列完全一致，理论上说，打 靶载体发生定点整合后，在PRNP基因启动子的作用下应该能够表达出抗性蛋白。连接方向 正确的重组子称为pGEM-T-Neo/Hyg PA载体。将pGEM-T-Neo/Hyg PA质粒和pMD19_T_5，同源臂质粒小量提取后，经过Not I 和BsiW I酶切，分别回收线性化的pGEM-T-Neo/HygPA载体和5’同源臂，经过连接、转化 后，挑取有5’同源臂插入的重组子，进行酶切和测序鉴定，连接正确的称为pGEM-T-Neo/ HygPA-5’ 臂。将pGEM-T-Neo/Hyg PA-5，臂载体和打靶载体骨架载体pPGKneoLoxP2PGKDTA小量 提取后，经过Not I和Nhe I酶切，分别回收线性化的打靶载体骨架载体和Not 1_5’同源 臂-neo/hyg PA-NheI序列，经过连接、转化后，挑取有Not 1-5’同源臂-neo/hyg PA-NheI 序列插入的重组子，进行酶切和测序鉴定，连接正确的称为LoxPneo/hygPGKDTA-5’臂。将LoxPneo/hygPGKDTA-5 ’臂质粒和pGEM_T_3，同源臂质粒小量提取后，经过Nhe I和Sal I酶切，分别回收线性化的LoxPneo/hygPGKDTA-5’臂载体和3’同源臂，经过连接、 转化后，挑取有3’同源臂插入的重组子，进行酶切和测序鉴定，请参阅图4和图5，连接正确 的称为 LoxPneo/hyg-PRNP K0，大小分别为 15，113bp 和 15，472bp。实施例2牛胎儿成纤维细胞转染及细胞筛选本发明要对牛PRNP基因的两个等位基因进行敲除，对第一个等位基因敲除用的 是脂质体细胞转染方法，对第二个等位基因进行敲除用的是Lonza公司的细胞核电转染 法。2. 1牛PRNP第一个等位基因的敲除接种牛胎儿成纤维细胞于6孔细胞培养板中，在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养至70-80%汇合度时，按照说明书要求，用Lipofectamine 2000脂质体将经过Not I 线性化的PRNP基因打靶载体LoxPneo-PRNP KO转入细胞中；细胞转染48h后，胰酶消化法将细胞从6孔板中消化下来，每IOOmm细胞培养皿接 4X105个细胞，并用G418浓度为600 μ g/mL的细胞培养基筛选细胞7_9d ；用细胞克隆环将具有G418抗性的细胞克隆点挑选出来接种到24孔细胞培养板 中，待细胞培养至80%汇合，胰酶消化后，一部分液氮冻存，另一部分继续培养至长满6孔 板的一孔，提取细胞基因组，采用PCR扩增的方法对细胞克隆点进行鉴定。得到的敲除细胞 命名为ko-E细胞。2. 2牛PRNP第二个等位基因的敲除将T75细胞培养瓶中培养至80%汇合的ko-E细胞用胰酶消化法消化下来，每 IX 107个细胞用ImL Lonza细胞核转液重悬，向细胞重悬液中加入80 μ g Not I线性化的 LoxPhyg-PRNP-KO无启动子打靶载体，充分混勻后，每个电击杯中加入100 μ L细胞-载体混 合液，按照NucleofectorTM细胞核电击仪程序Τ036电击；电击结束后，每个电击杯中的细胞接种至一个60mm细胞培养皿中，用含有10% FBS的DMEM细胞培养基培养48h，胰酶消化法将60mm细胞培养皿中的细胞消化下来，每个 60mm细胞培养皿中的细胞经过稀释后接种到6个IOOmrn细胞培养皿中，并用潮霉素B终浓 度为150 μ g/mL的细胞培养基筛选细胞7-9d ；用细胞克隆环将具有潮霉素B抗性的细胞克隆点挑选出来接种到24孔细胞培养 板中待细胞培养至80%汇合，胰酶消化后，一部分液氮冻存，另一部分继续培养至长满6孔 板的一孔，提取细胞基因组，采用PCR扩增的方法对细胞克隆点进行鉴定。经过PCR鉴定，获得的2个具有G418抗性的细胞克隆点均为PRNP+/-细胞， LoxPneo-PRNP KO基因打靶载体富集基因打靶的效率为100% ；获得的5个具有潮霉素B抗 性的细胞克隆点其中有3个为PRNP-/-细胞，LoxPhyg-PRNP KO基因打靶载体富集基因打 靶的效率为60%。本发明与以往研究最大的不同是，通过提高基因打靶载体的富集效率从而简化了 基因打靶的细胞筛选与鉴定工作。在本发明中，细胞经过打靶载体转染和药物筛选后，一个 IOOmrn细胞培养皿中最多可以获得2个细胞克隆点，很方便就可以把它挑取出来继续培养， 之后的鉴定工作证明这几个细胞克隆点往往就是经过基因打靶的细胞，几乎100%排除了 随机整合的细胞。此外，本发明构建的无启动子打靶载体上的真核抗性基因都是被IoxP位 点锚定的，可以通过Cre/loxP系统对其进行删除，这种策略在以往的无启动子打靶载体构 建中很少有人报道。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。参考文献K. J. McCreath, J. Howcroft, K. H. S. Campbell, A. CoIman, Α. Ε. Schnieke & Α. J. Kind, Production ofgene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells, Nature,2000,405 (29) :1066-1069C. Denning, S.Burl, A. Ainslie, J.Bracken, et al.Deletion of the α (1,3)galactosyl transferase (GGTAl) geneandthe prion protein (PrP) gene in sheep. Nature biotechnology, 2001,19 :559_562.Guohua Yu, Jianquan Chen, et al. Functional disruption of the prion proteingene in cloned goats. Journal ofgeneral virology,2006,87 :1019-1027.Caihong Zhu, Bei Li, et al. Production of Prnp-/~goats by gene targeting in adult fibroblasts. 2008, Transgenicresearch,Yoshimi Kuroiwa, et al. Sequential targeting of the genes encoding immunoglobulin-μ and prion protein in cattle.Nature genetics,2004,36 (7) 775-780.序列表<110>北京济普霖生物技术有限公司<120> 一种基因敲除打靶载体及其应用<130>KHP09112684. 1<160>8<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>1ttgcggccgc tataacacag ccaggcattc ag32<210>2<211>66<212>DNA<213>人工序列<400>2tctcgtacga taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgatgact tatctgcaaa 60ataaag66<210>3<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>3attgctagcc ctcttataca ttttggcagt g31<210>4<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>4tatgtcgacg aaacagtgga aagtgtcaga c31
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
tctcgtacgc caccatggga tcggccattg aacaag36
<210>6
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
taagctagcg gacctaataa cttcgtataa tgtatgctat ac42
<210>7
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
tctcgtacgc caccatggat agatecggaa agcctg36
<210>8
<211>65
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
taagctagca taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatctagaat gcagtgaaaa60
aaatg65
9
权利要求
一种基因敲除打靶载体，其包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序列，所述重组酶识别序列的另一端分别与被敲除基因的5’同源臂和3’同源臂相连，所述两同源臂的内部不具有启动正筛选基因表达的启动子，在所述同源臂的外侧还具有负筛选基因。
2.如权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述正筛选基因为编码新霉素磷酸转 移酶、潮霉素B磷酸转移酶、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶或嘌呤 霉素乙酰转移酶的基因。
3.如权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述负筛选基因为胸腺去氧核苷，或者 编码次黄嘌呤磷酸核糖转移酶、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶、胸腺嘧啶激酶、白喉毒素或单 纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶的基因。
4.如权利要求1 3任意一项所述的打靶载体，其特征在于，所述重组酶识别序列为 Cre酶识别序列或FLP酶识别序列。
5.如权利要求4所述的打靶载体，其特征在于，所述同源臂为牛PRNP基因的序列。
6.如权利要求5所述的打靶载体，其为LoxPneo-PRNPKO或LoxPhyg-PRNP KO0
7.权利要求1 6任意一项所述打靶载体在细胞内定点敲除基因中的应用。
8.一种提高基因打靶细胞富集效率的方法，其特征在于，使用权利要求1 6任意一项 所述打靶载体转染细胞，通过含有与正筛选基因相应药物的培养基筛选阳性克隆，使阳性 克隆得到富集。
9.一种敲除牛PRNP基因的方法，其包括使用LoxPneo-PRNP KO和LoxPhyg-PRNP KO之 一的打靶载体转染细胞并用相应的药物筛选培养基进行筛选，再用另一个打靶载体转染细 胞并用相应的药物筛选培养基进行筛选。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，使用打靶载体LoxPneo-PRNPKO转染牛成 纤维细胞，在含有G418的细胞培养基上筛选得到阳性细胞克隆，并对阳性细胞克隆进行鉴 定；用LoxPhyg-PRNP KO转染PRNP基因一个等位基因发生敲除的牛成纤维细胞，并用含潮 霉素B的细胞培养基筛选阳性细胞克隆，并对阳性细胞克隆进行鉴定。
全文摘要
本发明涉及一种基因敲除打靶载体，包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序列，该重组酶识别序列的另一端分别与被敲除基因的5’同源臂和3’同源臂相连，所述两同源臂的内部不具有启动正筛选基因表达的启动子，在所述同源臂的外侧还具有负筛选基因。所述打靶载体转染细胞，通过含有与正筛选基因相应药物的培养基筛选阳性克隆，得到的阳性克隆富集效率高，细胞筛选方法简单，不需大量人力物力，极大地方便了后续的细胞冻存和鉴定，大大降低了基因打靶的成本。
文档编号C12N15/63GK101955961SQ20091008816
公开日2011年1月26日 申请日期2009年7月3日 优先权日2009年7月3日
发明者丁方荣, 戴蕴平, 李宁, 李松, 王少华 申请人:北京济福霖生物技术有限公司