专利名称：可诱导增加拷贝数的质粒及其用于筛选正交性琥珀抑制tRNA的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种通过诱导增加拷贝数的质粒载体及其构建方法，属于基因工程技术领域，国际专利分类为C12N 15/69。
背景技术：
近二十年来，一种遗传密码扩充技术突破了在生物体内由20种天然氨基酸编码蛋白质的限制，从而使含有非天然基团氨基酸(unnatural amino acids，UAAs)的蛋白质分子能够得以在大肠杆菌，酵母，哺乳动物中表达出来。遗传密码扩充技术的核心在于设计筛选获得一对特异性正交氨酰tRNA合成酶和tRNA系统(orthogonal aminoacyl-tRNA synthetase/tRNAsystem)，并利用“空白密码子”如琥珀密码子TAG等作为非天然氨基酸的编码密码子。正交性的涵义是指该正交氨酰tRNA合成酶仅特异性的将特定非天然氨基酸酰化到该正交tRNA上，而不会催化天然氨基酸的氨酰化反应；该正交tRNA仅能够被该正交氨酰tRNA合成酶所识别，而不会被内源性氨酰tRNA合成酶所识别。该技术的方法包括 设计建立一个基于氨酰tRNA合成酶活性位点的合成酶突变文库和一个基于tRNA非保守区位点的tRNA突变文库，通过对文库进行筛选从而获得针对特定非天然氨基酸的正交氨酰 tRNA合成酶和tRNA系统。文库的传统筛选方法为氯霉素法。氯霉素法原理为将氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因中的一个非活性位点突变为琥珀密码子TAG，若氨酰tRNA合成酶能够将非天然氨基酸酰化到tRNA上，并由该氨基酰化的tRNA将氨基酸引入到氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因中的琥珀密码子TAG上，则全长氯霉素乙酰转移酶被翻译表达，宿主菌在加入了氯霉素的培养基中存活；若氨酰tRNA合成酶不能将非天然氨基酸酰化到tRNA上，则氯霉素乙酰转移酶基因的翻译在琥珀密码子TAG终止，全长氯霉素乙酰转移酶不能表达，宿主菌在加入了氯霉素的培养基中死亡。基于该原理，筛选出的单菌落在以下情况下具有正交性在加入了非天然氨基酸和氯霉素的培养基中存活，同时在不加入非天然氨基酸加入氯霉素的培养基中死亡。本专利提供了一种双复制子调控的质粒的构建及其在筛选正交tRNA 中的应用。本专利筛选方法的原理为高水平转录的异源tRNA如果被内源性氨酰tRNA合成酶识别将导致宿主菌的死亡。若tRNA突变文库中的tRNA被宿主菌体内的内源性氨酰 tRNA合成酶识别，同时该tRNA的转录丰度很高，则导致宿主菌死亡，从而正交性差的tRNA 被筛选除去；若tRNA突变文库中的tRNA不被宿主菌体内的内源性氨酰tRNA合成酶识别， 即使tRNA的转录丰度很高，菌株存活。本专利中构建的重组质粒是一种可诱导的双复制子调控的质粒，在没有诱导剂如IPTG的存在下，质粒的复制起始点为F因子复制起始点，该复制起始点是严谨型低拷贝复制起始点；在诱导剂IPTG存在条件下，Pl裂解复制起始点被启动从而发挥作用，该复制起始点是高拷贝复制起始点。通过这种可诱导的双复制子调控的质粒来调控异源tRNA的转录丰度，利用该质粒进行的筛选方法较氯霉素筛选法更快速，更高效，更直观，适合大容量的tRNA突变文库的筛选。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是构建一种双复制子调控的重组质粒。所述的重组质粒，包括载体及基因片段，所述的载体含有两个复制起始点，分别为F因子复制起始点和噬菌体Pl裂解复制起始点。所述的F因子复制起始点包括严谨型低拷贝复制起始点oriS和DNA解旋酶R印E 基因，RepE基因的登录号为1263M7。所述的Pl裂解复制起始点oriL为高拷贝复制起始点，其复制起始严格受控制于一种复制起始蛋白质R印L，RepL基因的登录号为2777395。所述的复制起始蛋白质R印L由大肠杆菌乳糖启动子控制。所述的基因片段为反密码子为琥珀突变(TAG)，非保守区为随机突突变的tRNA基因。所述tRNA基因来源于詹氏甲烷球菌属或酵母属。所述的tRNA基因的启动子和终止子为大肠杆菌脯氨酸转运RNA的启动子和终止子。所述的重组质粒的构建方法，包括以下工序LpF质粒构建全基因合成法合成一段基因，其序列包括DNA解旋酶R印E基因和oriS基因，插入用双酶切的质粒PET28a中，转化大肠杆菌，用卡那霉素筛选单克隆，即可；2.pFPl质粒构建全基因合成法合成一段基因，其序列包括大肠杆菌乳糖启动子基因，复制起始蛋白质R印L基因和oriL基因，插入用双酶切的质粒pF中，转化大肠杆菌，用卡那霉素筛选单克隆，即可；3. pFPl-tRNA 质粒构建根据tRNA序列设计引物，重叠PCR(overlapping PCR)法扩增，回收450bp的PCR 产物，插入用双酶切的质粒PFPl中，转化大肠杆菌，即可。本发明所要解决的第二个技术问题是提供使用上述重组质粒筛选正交tRNA的方法。在引入非天然氨基酸的正交氨酰tRNA合成酶和tRNA系统中，需要通过分别对氨酰tRNA合成酶和tRNA进行筛选，以获得高度正交的氨酰tRNA合成酶和tRNA分子对。本发明提出的筛选tRNA的方法原理为高水平转录的异源tRNA如果被内源性氨酰tRNA合成酶识别，将导致宿主菌的死亡。将本发明的重组质粒转化大肠杆菌，在IPTG存在的条件下， 重组质粒的拷贝数将从原来< 10增加至> 100，由此异源tRNA的丰度将大大提高如果该 tRNA被内源性氨酰tRNA合成酶识别，则宿主菌死亡，表现为转化无菌落生长；如果该tRNA 不被内源性氨酰tRNA合成酶识别，则宿主菌存活，表现为转化生长出单菌落。本发明所要解决的第三个技术问题是对筛选得到的正交tRNA进行效率检测。筛选得到的正交tRNA的效率通过β -半乳糖苷酶活性进行检测。构建一个检测质粒ρΤ 该载体含正交氨酰tRNA合成酶基因和在活性位点进行了琥珀突变的β -半乳糖苷酶基因。将重组质粒PFPl-tRNA和检测质粒ρΤ共转化大肠杆菌。加入特定非天然氨基酸的条件下，β-半乳糖苷酶活性越高，则正交tRNA效率越高，反之则越低。不加入特定非天然氨基酸的条件下，β -半乳糖苷酶活性越低，则tRNA正交性越高，反之则越低。
图1为重组质粒pFPl-tRNA示意图。图2为双酶切鉴定重组质粒pF。图3为双酶切鉴定重组质粒pFPl。图4为双酶切鉴定重组质粒pFPl-tRNA。图5为正交tRNA的筛选。图6为正交tRNA效率检测。在图1中1为卡那霉素基因片段；2为大肠杆菌脯氨酸转运RNA的启动子；3 为tRNA基因片段；4为大肠杆菌脯氨酸转运RNA的终止子；5为大肠杆菌乳糖启动子；6 为R印L基因片段和oriL基因片段；7为R印E基因片段；8为oriS基因；9为重组质粒 pFPl-tRNA。在图2中M1为MarkerlKb ；1为重组质粒pF ；2为重组质粒pF用Eco57和BglI 双酶切后的酶切产物。在图3中Ml为MarkerlKb ；4为重组质粒pFPl ；3为重组质粒pFPl用XbaI和 BglII双酶切后的酶切产物。在图4中M2为Marker2 ；Ml为MarkerlKb ；6为重组质粒pFPl-tRNA ；5为重组质粒pFPl-tRNA用DraIII和HindIII双酶切后的酶切产物。在图5中1为没有添加ImM IPTG的培养皿内菌落生长情况；2为添加ImM IPTG 的培养皿内菌落生长情况。在图6中1-6为筛选出的重组质粒pFPl-tRNAl-6号分别与检测质粒pT双转化的单菌落在含有ONPG和ImM特定非天然氨基酸的LB琼脂培养基上的生长情况。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作详细的说明。说明书及实施例中采用的菌株、质粒、化学试剂等，如未特殊说明均按常规实验条件进行操作，或按供应商提供的说明进行操作。实施例1 双复制子调控的重组质粒的构建LpF质粒构建全基因合成法合成一段基因，其序列包括DNA解旋酶R印E基因和oriS基因，用 Eco57和BglI双酶切该基因片段，与Eco57和BglI双酶切的质粒pET28a连接，转化大肠杆菌DH5a，Kan筛选单克隆，进行酶切鉴定，获得pF。如图2所示，pF质粒大小约为4. 7kb,由于F因子复制起始点是用Eco57和BglI 双酶切后插入PET28a的，故用Eco57和BglI双酶切pF后，可以看见两条条带，大小约为 3. 7kb的载体片段和11Λ的基因片段。2. pFPl质粒构建全基因合成法合成一段基因，其序列包括Iac启动子基因，复制起始蛋白质R印L 基因和oriL基因，用)(bal和BglII双酶切该基因片段，与)(bal和BglII双酶切的质粒pF连接，转化大肠杆菌Dffia，Kan筛选单克隆，进行酶切鉴定，获得pFPl。如图3所示，pFPl质粒大小约为5. 81Λ，用)(baI和BglII双酶切后有两条带，大小约为4. 7kb的载体片段和1. Ikb的基因片段。3. pFPl-tRNA 质粒构建设计两对引物，重叠PCR(overlapping PCR)法扩增，回收450bp的PCR产物，用 DraIII和HindIII双酶切PCR产物，插入用DraIII和HindIII双酶切的质粒pFPl中，转化大肠杆菌DH5a，Kan筛选单克隆，进行酶切鉴定，获得pFPl-tRNA。如图4所示，pFPl-tRNA质粒大小约为61Λ，用DraIII和HindIII双酶切后有两条带，大小约为5. 5kb的载体片段和450bp的tRNA片段。实施例2 筛选正交性琥珀抑制tRNA将实施例1中所制备的重组质粒pFPl-tRNA转化大肠杆菌，进行平板涂布时，涂布两种Kan LB琼脂培养基，一种含有终浓度为ImM的IPTG，一种不含有IPTG，37°C培养20小时。如图5所示，添加了 ImM IPTG的培养皿内生长的单菌落较稀疏，而不添加IPTG的培养皿内生长密集。表明在IPTG的诱导下，重组质粒pFPl-tRNA的拷贝数增加，从而tRNA 的丰度大大增加，其中正交性差的tRNA因被内源性氨酰tRNA合成酶识别而菌落死亡；存活的单菌落内含的tRNA因未被内源性氨酰tRNA合成酶识别得以存活。由此筛选除去正交性差的tRNA，而保留较高正交性的tRNA。实施例3 正交tRNA效率检测第一步构建一个检测质粒pT 该载体含正交氨酰tRNA合成酶基因和在活性位点进行了琥珀突变的半乳糖苷酶基因。第二步将实施例2中筛选出的存活的单菌落，挑取6个单菌落接种于LB培养基中，37°C培养20小时，提取重组质粒pFPl-tRNAl-6号，将pFPl_tRNAl_6号分别与检测质粒 PT共转化大肠杆菌DH5a，涂布，37°C培养20小时。第三步从6块转化板上分别挑取一个单菌落，接种于含有ONPG和ImM特定非天然氨基酸的LB琼脂培养基，37°C培养20小时。如图6所示，在含有ONPG和ImM特定非天然氨基酸的LB琼脂培养基上，菌体表现为蓝色的单菌落，表明其中的相对应的正交tRNA效率较高，能够将非天然氨基酸引入到 β-半乳糖苷酶基因的琥珀突变位点上，从而表达出全长半乳糖苷酶。菌体菌体表现为白色的单菌落，表明其中的相对应的正交tRNA效率较低，不能将非天然氨基酸引入到β -半乳糖苷酶基因的琥珀突变位点上，未能表达出全长半乳糖苷酶。
权利要求
1.一种重组质粒，包括载体和tRNA基因转录单元，其特征在于所述的载体含有两个复制起始点，分别为F因子复制起始点和噬菌体Pl裂解复制起始点。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述的F因子复制起始点包括严谨型复制起始点oriS和DNA解旋酶R印E基因，RepE基因的登录号为1263M7。
3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述的噬菌体Pl裂解复制起始点 oriL严格受控制于一种复制起始蛋白质R印L，RepL基因的登录号为2777395。
4.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述的复制起始蛋白质R印L的启动子为大肠杆菌乳糖启动子。
5.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于所述tRNA基因转录单元包括启动子、终止子和tRNA基因片段。
6.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于所述启动子和终止子为大肠杆菌脯氨酸转运RNA的启动子和终止子。
7.根据权利要求5所述的重组质粒，其特征在于所述tRNA基因片段来源于詹氏甲烷球菌属或酵母属。
8.根据权利要求7所述的重组质粒，其特征在于所述tRNA基因片段为琥珀抑制性 tRNA突变体，即反密码子为琥珀突变(TAG)，非保守区为随机突变的tRNA基因。
9.权利要求1所述的重组质粒的构建方法，包括以下工序(1)PF质粒构建全基因合成法合成一段基因，其序列包括DNA解旋酶R印E基因和 oriS基因，插入用双酶切的质粒PET28a中，转化大肠杆菌，用卡那霉素筛选单克隆，即可；(2)pFPl质粒构建全基因合成法合成一段基因，其序列包括大肠杆菌乳糖启动子基因，复制起始蛋白质R印L基因和oriL基因，插入用双酶切的质粒pF中，转化大肠杆菌，用卡那霉素筛选单克隆，即可。
10.权利要求1所述的重组质粒PF质粒用于筛选正交性琥珀抑制tRNA，包括以下步骤(1)pFPl-tRNA质粒构建根据tRNA序列设计引物，采用重叠PCR(overlappingPCR)法扩增，回收PCR产物，插入用双酶切的质粒pFPl中，转化大肠杆菌，既得pFPl-tRNA质粒；(2)将pFPl-tRNA转化大肠杆菌，涂布于含有终浓度为ImMIPTG的LB琼脂培养基， 37 °C培养20小时；(3)挑取存活的单菌落，提取质粒，内含的tRNA因未被内源性氨酰tRNA合成酶识别得以存活，为正交性tRNA。
全文摘要
本发明涉及一种通过诱导增加拷贝数的质粒载体及其构建方法，该重组质粒，包括载体及基因片段，所述的载体含有两个复制起始点，分别为F因子复制起始点和噬菌体P1裂解复制起始点；所述的基因片段包括含有启动子和终止子的反密码子为琥珀突变(TAG)，非保守区为随机突变，来源为詹氏甲烷球菌属或酵母属的tRNA。本发明中所述的重组质粒可应用于筛选正交性琥珀抑制性tRNA分子，该方法与现有技术相比，更快速，更高效，更直观，更适合大容量的tRNA突变文库筛选。
文档编号C12N15/10GK102443599SQ20111034190
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月3日 优先权日2011年11月3日
发明者刘静娴, 姚文兵, 田浤, 高向东 申请人:中国药科大学