专利名称：一种植物促生菌及其菌剂与其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物促生菌剂，具体地说是一种植物促生菌及其菌剂、及其制备 方法和应用，属于生物肥料领域。
背景技术：
氮和磷作为植物必需的矿质元素，是植物活细胞内蛋白质、核酸、磷脂、酶、植物激 素等多种结构和功能物质的重要组成成分，在植物能量代谢、有机物合成与代谢、物质运 转、基因表达与调控及细胞信号转导等过程中起重要作用。氮素和磷素的缺乏、将使植物的 生长发育受抑，引起作物产量和品质的下降。长期大量施用化肥不但提高了农业生产成本， 而且造成了土壤中某些元素的选择性积累和土壤理化性质的恶化，对环境造成污染。因此 以微生物肥料替代或部分替代化肥是维持农业持续发展的必然趋势。存在于植物根际的土 壤细菌可以通过根际固氮、产生生长素、溶解土壤中大量存的难溶性磷供植物吸收来促进 作物的生长，达到促生促产的目的。
由于同时具有多种高效促生作用的菌种较难获得、因此目前投入生产的溶磷固氮 植物促生菌剂多为多菌种混合菌剂，存在菌种间拮抗，菌剂内营养需求和代谢不平衡等问题。发明内容
本发明的目的在于，针对上述问题，本发明提供了一种以集溶磷、固氮和产生长素 多种促生能力为一体的固氮溶磷菌，制备成固氮溶磷菌剂，具有促生性能全面，肥效高、造 价低廉的特点，适用于氮磷缺乏，土壤瘠薄的区域，有良好的发展前景。
本发明的技术方案为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，其微生物保藏 单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰 西路1号院，保藏日期2010年8月31日，保藏号为=CGMCC No. 4128 ；所述肺炎克雷伯氏菌 的形态学特征为直杆菌，直径0. 5 0. 8 μ m，长3. 2 5. 0 μ m，单个分布、有荚膜，革兰氏 染色阴性，不运动、生长在YMA培养基上产生圆形半透明菌落并分泌大量多糖，有固氮、溶 解无机磷的作用，可以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘露醇为唯一碳源。
肺炎克雷伯氏菌(Z/e/wieWa / ^腫，微生物保藏号为CGMCC No. 4128， 在作为植物促生菌剂中的应用。
—种植物促生菌剂的制备方法，于按照下列步骤进行(1)肺炎克雷伯氏菌{Klebsiellapneumoniae) RSN19接种于YMA固体培养基中，在 26°C 28°C 活化 18 24h ；(2)活化后的ZZd1SiWhpneumoniae RSN19接种于液体培养基中进行发酵培养，温 度为25。C ，培养至每毫升发酵液中的Klebsiella pneumoniae RSN19菌数为4 6 10ι。个.(3)将上述步骤(2)中的Z/e/wiWhpneumoniae RSN19的发酵菌液、无菌液体培养基和浓度为10%的pH 7.0无菌磷酸缓冲液按照体积比为4 8 2 4 1的比例混合；以 无菌铝箔袋或无菌聚丙烯袋封装，制成单菌种液体菌剂；
(4)将述步骤(3)中制备的液体菌剂与无菌泥炭粉按照体积比为1 4 8的比例混 合，制成固体微生物菌剂。所述促生菌剂的液体培养基组成为，按照重量分数比由0. 5 1份的KH2PO4,1 2 份的酵母粉，5 10份的葡萄糖，0. 2 0. 4份的MgSO4,0. 05 0. 1份的NaCl，900 1000 份的水组成，其中液体培养基的PH值为6. 4 7. 4。所述步骤(3)中发酵菌液、无菌液体培养基和无菌磷酸缓冲液按照体积比为 6:3:1的比例混合。所述步骤(4)中液体菌剂与无菌泥炭粉体积比为1 6。跟据上述制备方法制备而成的一种植物促生菌剂，在固氮溶磷中的应用。本发明的优点在于提供了一种以集溶磷、固氮和产生长素多种促生能力为一体 的固氮溶磷菌，制备成固氮溶磷菌剂，具有促生性能全面，肥效高、造价低廉的特点，适用于 氮磷缺乏，土壤瘠薄的区域，制备工艺简便，固氮溶磷肥效高，有良好的发展前景。本发明菌剂为具备固氮、溶无机磷和产生长素能力的单菌种植物促生菌剂，能够 充分利用土壤中含量最为丰富的难溶性无机磷酸盐，在具备多种促生能力的同时解决了多 菌种菌剂中存在的菌种间拮抗和营养需求不一致的问题；菌种单一，制备工艺简便，对生产 和封装设备的要求较低；对苜蓿、燕麦、红豆草幼苗的促生作用显著，较同等肥效的多菌种 菌剂产品造价低廉，易于推广应用。
具体实施例方式以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用 于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1
肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的分离、鉴定和纯化RSN19菌株以无氮 固体培养基和PKO溶无机磷培养基自表面灭菌的红豆草、Onbrychis viciaefoliacv.)根 瘤中分离，纯化后的菌株经形态学鉴定符合肠杆菌科的一般定义。菌株纯培养物于2010 年经中国科学院微生物鉴定保藏中心鉴定为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae) (2010微检字第084号)；该菌株对80mg/L卡那霉素和200mg/L氨苄青霉素有耐受性。 RSN19菌株固氮酶活性达6695 士 174 nmol C2H2 d_l，4d的溶磷量(磷酸钙)为15. 29 士 0.46!^/1，6(1的生长素产量为8.38 mg/L。在无氮，仅提供磷酸钙条件下的沙培试验中， 施用RSW9菌液60d后的苜蓿幼苗比不施菌液的空白对照植株生物量增加119%，株高增加 53%，叶片数增加95%，用于浸种，能显著加快胚根的伸长。在氮磷缺乏的条件下对植物有很 明显的促生作用。实施例2
一种植物促生菌剂的制备方法，于按照下列步骤进行
(1)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae) RSN19接种于YMA (酵母甘露醇-琼 脂)固体培养基中，在26°C 28°C活化18 24h ；
(2)活化后的Z/i^sidhpneumoniae RSN19接种于液体培养基中进行发酵培养，温度为25°C 29°C，培养至每毫升发酵液中的Klebsiella pneumoniae RSN19菌数为4 6 10ι。个.
(3)将上述步骤(2)中的Z/e/wiWhpneumoniae RSN19的发酵菌液、无菌液体培养基 和浓度为10%的pH 7.0无菌磷酸缓冲液按照体积比为6 3 1的比例混合；以无菌铝箔 袋或无菌聚丙烯袋封装，制成单菌种液体菌剂；
(4)将述步骤(3)中制备的液体菌剂与无菌泥炭粉按照体积比为1 6的比例混合，制 成固体微生物菌剂。所述促生菌剂的液体培养基组成为，按照重量分数比由0. 5 1份的KH2PO4,1 2 份的酵母粉，5 10份的葡萄糖，0. 2 0. 4份的MgSO4,0. 05 0. 1份的NaCl，900 1000 份的水组成，其中液体培养基的PH值为6. 4 7. 4。实施例3
本发明菌剂在控制氮、磷营养条件下的沙培促生作用 一、实验材料 1. 1试验材料
本发明的液体菌剂肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella /^mM^iae)，其微生物保藏号为 CGMCC No. 4128。1.2植物材料
紫花苜猜陇东(Medicogosativa. cv. LongDong)禾口皇后(Medicogo. sativa. cv. Queen)的种子，甘肃红豆草(Qnobrychisspp. cv. Gansu)禾口燕麦(Calibre) (Avena. sativa L. Calibre)种子由草业生态系统教育部重点实验室提供，种子净度98%，种子以 70%乙醇溶液消毒5min。为消除种带根瘤菌和固氮菌对实验结果的影响，种子经无菌水浸 泡催芽，去除种皮，最后经无菌去离子水冲洗5 8遍后播种。1. 3沙培营养液
Hoagland's 完全营养液大量元素Ca(N03) 2 · 4H20 1417mg/L ； KN03 607mg/L ； MgS04 493mg/L ； (NH4) 3P04 115mg/L ；微量元素H3B03 2. 86mg/L ；MnCl2 ·4Η20 1. 81mg/L ； ZnS04 · 7H20 0. 22mg/L ；CuS04 · 5H20 0. 08mg/L ；H2Mo04 · H20 0. 02mg/L ；FeS04 50mg/L。 营养液以无菌去离子水稀释至1/4浓度后用NaOH (lmol/L)或HCl (lmol/L)调节pH值为 7. 0 士 0. 2。Hoagland's无氮无磷营养液以Hoagland’ s完全营养液为基础，将配方中的KN03 607mg/L改为KCl 582mg/L，并去除(NH4) 3P04后配制，并调节溶液pH值至7. 0 士 0.1。二、实验方法 2.1.试验设计
试验于2010年4月于甘肃农业大学草业学院培养室内进行，栽培基质使用清洁河砂， 经HCl浸泡48h后，冲洗6次，最后以蒸馏水冲洗3次，150°C烘干并干热灭菌6h备用。在 直径7cm、容积400ml的塑料培养杯中装入280g干燥河沙，将沙面整平，用镊子挑选10粒 大小一致的饱满种子均勻摆放于细沙表面，覆沙20g。对各处理幼苗浇灌以无菌水稀释100 倍的本产品液体菌剂(活菌数>106cfu/ml)，在栽培用的砂基质中添加20g/kg的磷酸钙， 以l/ffloagland’ s无氮无磷营养液浇灌。对不接菌液处理，仅以l/ffloagland’ s无氮无磷 营养液浇灌的处理作为空白对照(CKl)；以l/4H0agland’S完全营养液浇灌的处理作为充足营养对照(CK2)。每处理4次重复。处理过程中以称量法测定各盆栽水分含量，并以无菌 水补充水分至沙基质最大持水量的70%。处理50d后进行生长和形态指标的测定。
肥效试验的测定指标和方法活苗率将各处理盆栽洗出苗后统计活苗数，计算活苗率。
株高和主根长各处理盆栽中随机选取4株幼苗测定株高和主根长度。将洗净植 株平铺于在玻璃平板上，用直尺测出苗的自然高度，后再用镊子将植株根系拉直，测定主根 长度。
单叶面积和单株叶片数取单株记录叶片数目，单叶面积采用描形称重法。
植株单株体积与单株根体积将所选苗置于滤纸上，将水吸干，采用量筒排水法测 定植株体积和根体积。
植株生物量积累取整植株于烘箱中，80°C烘至恒重，用电子天平称出植株单株干重。
2. 2数据分析试验数据用SPSS16. 0软件以LSD法进行统计分析。
三.试验结果3. 1本发明菌剂对低有效磷条件下幼苗存活率的影响处理50d后，施用本发明菌剂可显著提高供试作物的幼苗存活率。陇东和皇后苜蓿幼 苗存活率比CKl分别提高3 和28%，比CK2分别提高8%和12%，使红豆草和燕麦的幼苗存 活率比CKl分别提高27% 44%表1本发明菌剂对苜蓿、燕麦和红豆草幼苗存活率的影响(%)
权利要求
1.肺炎克雷伯氏菌(Z/e/wieWa/wewMwiae)，其微生物保藏号为CGMCC No. 4128 ； 所述肺炎克雷伯氏菌的形态学特征为直杆菌，直径0. 5 0. 8 μ m，长3. 2 5. 0 μ m，单 个分布、有荚膜，革兰氏染色阴性，不运动、生长在YMA培养基上产生圆形半透明菌落并分 泌大量多糖，有固氮、溶解无机磷的作用，可以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉和甘露醇为唯一碳 源。
2.肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella/wewso/jiae)，微生物保藏号为CGMCC No. 4128，在 作为植物促生菌剂中的应用。
3.一种植物促生菌剂的制备方法，其特征在于按照下列步骤进行(1)肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae) RSN19接种培养基中，在 活化18 Mh ；(2)活化后的ZZd1SiWhpneumoniae RSN19接种于液体培养基中进行发酵培养，温 度为25。C ，培养至每毫升发酵液中的Klebsiella pneumoniae RSN19菌数为4 6 10ι。个.(3)将上述步骤(2)中的Z/e/wiWhpneumoniae RSN19的发酵菌液、无菌液体培养基 和无菌磷酸缓冲液按照体积比为4 8 2 4 1的比例混合，封装，制成单菌种液体菌 剂；(4)将述步骤(3)中制备的液体菌剂与无菌泥炭粉按照体积比为1 4 8的比例混 合，制成固体微生物菌剂。
4.根据权利要求3所述的一种植物促生菌剂，其特征在于所述促生菌剂的液体培养基 组成为，按照重量分数比由0. 5 1份的KH2PO4,1 2份的酵母粉，5 10份的葡萄糖， 0. 2 0. 4份的MgSO4,0. 05 0. 1份的NaCl，900 1000份的水组成，其中液体培养基的 PH值为6. 4 7. 4。
5.根据权利要求3所述的一种植物促生菌剂，其特征在于所述步骤(3)中发酵菌液、无 菌液体培养基和无菌磷酸缓冲液按照体积比为631的比例混合。
6.根据权利要求3所述的一种植物促生菌剂，其特征在于所述步骤(4)中液体菌剂与 无菌泥炭粉体积比为1 6。
7.根据权利要求3制备而成的一种植物促生菌剂，在固氮溶磷中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种植物促生菌及其菌剂与其制备方法和应用，即肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)及以其作为活性成分的菌剂，该菌剂的制备方法，以及在溶磷、固氮方面的应用。本发明的优点在于提供了一种以集溶磷、固氮和产生长素多种促生能力为一体的固氮溶磷菌，制备成固氮溶磷菌剂，具有促生性能全面，肥效高、造价低廉的特点，适用于氮磷缺乏，土壤瘠薄的区域，制备工艺简便，固氮溶磷肥效高，有良好的发展前景。
文档编号C12N1/20GK102031231SQ20101052929
公开日2011年4月27日 申请日期2010年11月3日 优先权日2010年11月3日
发明者师尚礼, 张淑卿, 李剑峰, 霍平慧 申请人:甘肃农业大学