专利名称：环二肽类化合物的生物制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及已知环二肽类化合物的生物制备方法及用途。
背景技术：
环二肽类化合物在人、动物、植物、真菌和细菌中均有发现，结构不同的环二肽，其生物功能差异显著，具体包括有抑制杂草、调节钙离子通道、抗菌、专一催化立体构型和作为细菌生理调控的信号分子等生物活性。因此，环二肽类化合物在药物、抗生素和农用生物除草剂的研制等方面具有巨大的开发潜力。
国内有几家科研院所在进行环二肽类化合物的研究开发，中山大学周世宁等从南海红树林真菌和海洋细菌发酵液中分离提纯到环二肽化合物；中国科学院昆明植物化学开放研究实验室汪有初等从北五味子果实中分离得到3个环二肽即环(亮-脯)、环(苯丙-异亮)和环(苯丙-亮)；蚌埠医学院陶林等用化学方法合成环L-苯丙-L-脯；中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源国家重点实验室熊江等从多蕊商陆根的乙醇提取物中分离到环二肽类化合物。
国外对环二肽类化合物的研究比较活跃，主要集中在对生物活性的探讨上，Yasuo kimura等从penicillium sp.中分离得到环(L-色-L-苯丙)，研究表明其在100ml/l下能强烈抑制水芹种子萌发，促进莴苣根的生长；Milne，P.J.等研究了4个环二肽化合物环(L-苯丙-L-脯)、环(L-酪-L-脯)、环(L-色-L-脯)和环(L-色-L-色)，结果表明这4个环二肽化合物均具有潜在的抗肌肉紧张、抗瘤和抗生素活性；Holden，Matthew T.G.等从假单胞菌发酵液中分离得到2个环二肽化合物环(D-丙-L-缬)、环(L-酪-L-脯)，研究表明对生物发光起信号调节作用。
从上世纪90年代开始，对环二肽类化合物研究开始转向细菌，但是从野油菜黄单胞菌反枝苋致病变种发酵液中提取分离纯化得到环二肽类化合物在国内外尚属首次；而且从该发酵液中提取环二肽类化合物方法简便可行，较化学合成成本低。
发明内容
本发明的目的在于以微生物学原理为基础，以从根际土壤或植物组织上分离得的野油菜黄单胞菌反枝苋致病变种为菌种，经发酵、分离、提纯，得到环二肽类化合物；进一步的生物活性试验表明该类化合物对部分杂草及水稻有较强抑制作用。因此，本发明的着眼点在于以新筛选的植物致病细菌为菌种用生物的方法制备具有广泛生物活性的环二肽类化合物及其在杂草防除中的应用。
本发明的环二肽类化合物(式1)的生物制备方法，cyclo-(-A1-A2-)(式1)其中，A1为Pro、Phe、Leu、一种脂肪族氨基酸或一种芳香族氨基酸；A2为Try、Phe、Ile、一种脂肪族氨基酸或一种芳香族氨基酸；其特征是包括以下步骤1)以保藏编号为CGMCC NO.0902的高效生物除草菌野油菜黄单胞菌反枝苋致病变种(Xanthomonas campestris pv.retroflexus)为菌种，在常规固体培养基中对该菌种进行斜面培养，复壮，25-30℃培养9-24h；然后进行种子培养，在400ml三角瓶中盛2/3体积的液体培养基，液体培养基的配方为牛肉膏0.5-2.2％，蛋白胨0.2-4％，葡萄糖0.2-4％，NH4H2PO40.05-0.5％，NaCl0.1-2.0％，以水补足体积；调初始PH6.0-7.4，在121-125℃下灭菌20-30min，冷却后以1％的接种量接种，25-30℃培养12-32h。
2)发酵罐中盛2/3体积的液体培养基，液体培养基的配方同上述种子液体培养基的配方，以6-12％的接种量接种，通气量按体积比为1∶0.6-1.5，25-30℃培养54-120h，得发酵液；3)发酵液离心得上清液减压浓缩，用丙酮多次沉淀去除多糖，减压蒸去丙酮，将剩留液pH调至3-7，用等体积的乙酸乙酯提取数次，然后合并乙酸乙酯提取液，将其减压蒸馏浓缩至干，用1-5毫升的甲醇溶解，用硅胶柱分离，以石油醚∶乙酸乙酯按体积比从10∶1到4∶6梯度洗脱；再将盐酸水解后茚三酮显色的部分用硅胶柱分离，薄层层析法分析后将性质相同的组分合并，制得环二肽类化合物。
本发明具有以下优点1.用生物的方法从菌发酵液中分离提纯到环二肽类化合物，相对于化学合成，其方法简便可行，对环境没有污染；2.用生物的方法从菌发酵液中分离提纯到环二肽类化合物，相对于化学合成，其周期短(一般为5-7天一个循环)；所用原料廉价，易于形成大规模批量生产，生产成本低；
3.用高效生物除草菌野油菜黄单胞菌反枝苋致病变种(Xanthomonascampestris pv.retroflexus)为菌种发酵生产环二肽类化合物，部分环二肽产率较高；该环二肽类化合物表现有较强的生物活性，可用于开发成为生物除草剂。
图1是环二肽类化合物的生物制备工艺流程图；图2是环(-脯-苯丙-)对植物根的生物抑制活性测定图；图3是环(-脯-苯丙-)对植物茎的生物抑制活性测定图；图4是环(-异亮-苯丙-)对植物根的生物抑制活性测定图；图5是环(-异亮-苯丙-)对植物茎的生物抑制活性测定图；图6是环(-色-苯丙-)对植物根的生物抑制活性测定图；图7是环(-色-苯丙-)对植物茎的生物抑制活性测定图。
具体实施例方式
实施例1环二肽类化合物的生物制备1)将高效生物除草菌野油菜黄单胞菌反枝苋致病变种(Xanthomonascampestris pv.retroflexus)菌种，在常规固体培养基中进行斜面培养，复壮，25℃培养24h；然后进行种子培养，在400ml三角瓶中盛2/3体积的液体培养基，液体培养基的配方为(按质量/体积比)牛肉膏2.2％，蛋白胨0.4％，葡萄糖0.2％，NH4H2PO40.5％，NaCl2.0％，以水补足体积；调初始PH值为6.0，在121℃下灭菌20min，冷却后以1％的接种量接种，25℃培养32h。
2)发酵罐中盛2/3体积的液体培养基，液体培养基的配方同上述种子液体培养基的配方，以10％的接种量接种，通气量按体积比为1∶1.5，27℃培养120h，得发酵液；3)发酵液离心得上清液，减压浓缩，丙酮多次沉淀去除多糖，减压蒸去丙酮，将剩留液pH调至7，用等体积的乙酸乙酯提取三次，最后减压蒸馏浓缩至干，用4毫升的甲醇溶解，用硅胶柱分离，以石油醚∶乙酸乙酯按体积比从10∶2到4∶6梯度洗脱；再按常规方法将盐酸水解后茚三酮显色的部分用硅胶柱分离纯化，薄层层析法分析后将性质相同的组分合并，得8个组分，经气、液色谱，质谱，核磁共振分析证实为环(-脯-苯丙-)、环(-异亮-苯丙-)、环(-色-苯丙-)、环(-脯-色-)、环(-脯-亮-)、环(-苯丙-苯丙-)、环(-脯-酪-)、环(-色-色)，其中环(-脯-苯丙-)、环(-异亮-苯丙-)的含量分别达200mgL-1和100mgL-1。以10吨的发酵罐为例，发酵一次，经分离纯化可分别得纯环(-脯-苯丙-)和环(-异亮-苯丙-)各1.5kg和0.8kg。
实施例2环二肽类化合物的生物制备1)将高效生物除草菌野油菜黄单胞菌反枝苋致病变种(Xanthomonascampestris pv.retroflexus)菌种，在常规固体培养基中进行斜面培养，复壮，25℃培养24h；然后进行种子培养，在400ml三角瓶中盛2/3体积的液体培养基，液体培养基的配方为牛肉膏0.5％，蛋白胨0.2％，葡萄糖0.5％，NH4H2PO40.05％，NaCl0.5％，以水补足体积；调初始PH值为6.0，在121℃下灭菌20min，冷却后以1％的接种量接种，25℃培养28h。
2)发酵罐中盛2/3体积的液体培养基，液体培养基的配方同上述种子液体培养基的配方，以6％的接种量接种，通气量按体积比为1∶0.6，25℃培养100h，得发酵液；3)发酵液离心得上清液，减压浓缩，丙酮多次沉淀去除多糖，减压蒸去丙酮，将剩留液pH调至7，用等体积的乙酸乙酯提取三次，最后减压蒸馏浓缩至干，用5毫升的甲醇溶解，用硅胶柱分离，以石油醚∶乙酸乙酯按体积比从9∶2到5∶5梯度洗脱；再按常规方法将盐酸水解后茚三酮显色的部分用硅胶柱分离纯化，薄层层析法分析后将性质相同的组分合并，得8个组分，经气、液色谱，质谱，核磁共振分析证实为环(-脯-苯丙-)、环(-异亮-苯丙-)、环(-色-苯丙-)、环(-脯-色-)、环(-脯-亮-)、环(-苯丙-苯丙-)、环(-脯-酪-)、环(-色-色)，其中环(-脯-苯丙-)、环(-异亮-苯丙-)的含量分别达100mgL-1和50mgL-1。以10吨的发酵罐为例，发酵一次，经分离纯化可分别得纯环(-脯-苯丙-)和环(-异亮-苯丙-)各0.8kg和0.4kg。
实施例3环(-脯-苯丙-)的植物生长抑制活性测定将反枝苋、早熟禾等杂草和水稻种子催芽，选饱实露白种子各10粒置培养皿内，将环(-脯-苯丙-)化合物配成5、50、500mgL-1三个浓度梯度，每皿加液10ml，各设三个重复，置于人工气候箱内，在温度25、湿度75％、12小时光照条件下培养6天，测根茎长度，与清水对照对比，求出抑制率，见图2，图3。试验表明，环(-脯-苯丙-)对所测三种植株的根茎均有抑制作用，其中对根的抑制明显高于对茎的抑制，而不同植物又呈现差异，其中对反枝苋杂草的抑制又明显高过其它两种植物。
实施例4环(-异亮-苯丙-)的植物生长抑制活性测定将反枝苋、早熟禾等杂草和水稻种子催芽，选饱实露白种子各10粒置培养皿内，将环(-异亮-苯丙-)化合物配成5、50、500mgL-1三个浓度梯度，每皿加液10ml，各设三个重复，置于人工气候箱内，在温度25、湿度75％、12小时光照条件下培养6天，测根茎长度，与清水对照对比，求出抑制率，见图4，图5。试验表明，环(-异亮-苯丙-)对所测三种植株的根茎均有抑制作用，其中对根的抑制明显高于对茎的抑制，但总体活性要低于环(-脯-苯丙-)。
实施例5环(-色-苯丙-)的植物生长抑制活性测定将反枝苋、早熟禾等杂草和水稻种子催芽，选饱实露白种子各10粒置培养皿内，将环(-色-苯丙-)化合物配成5、50、500mgL-1三个浓度梯度，每皿加液10ml，各设三个重复，置于人工气候箱内，在温度25、湿度75％、12小时光照条件下培养6天，测根茎长度，与清水对照对比，求出抑制率，见图6，图7。试验表明，环(-色-苯丙-)对所测三种植株的根茎均有抑制作用，其中对根的抑制要高于对茎的抑制，不同植物抑制率不同，其中对早熟禾杂草根的抑制明显高过其它两种植物。
权利要求
1.环二肽类化合物(式1)的生物制备方法，cyclo-(-A1-A2-)(式1)其中，A1为Pro、Phe、Leu、一种脂肪族氨基酸或一种芳香族氨基酸；A2为Try、Phe、Ile、一种脂肪族氨基酸或一种芳香族氨基酸；其特征是包括以下步骤1)以保藏编号为CGMCC NO.0902的高效生物除草菌野油菜黄单胞菌反枝苋致病变种(Xanthomonas campestris pv.retroflexus)为菌种，在常规固体培养基中对该菌种进行斜面培养，复壮，25-30℃培养9-24h；然后进行种子培养，在400ml三角瓶中盛2/3体积的液体培养基，液体培养基的配方为牛肉膏0.5-2.2％，蛋白胨0.2-4％，葡萄糖0.2-4％，NH4H2PO40.05-0.5％，NaCl0.1-2.0％，以水补足体积；调初始PH值为6.0-7.4，在121-125℃下灭菌20-30min，冷却后以1％的接种量接种，25-30℃培养12-32h。2)发酵罐中盛2/3体积的液体培养基，液体培养基的配方同上述种子液体培养基的配方，以6-12％的接种量接种，通气量按体积比为1∶0.6-1.5，25-30℃培养54-120h，得发酵液；3)发酵液离心得上清液，减压浓缩，用丙酮多次沉淀去除多糖，减压蒸去丙酮，将剩留液pH调至3-7，用等体积的乙酸乙酯提取数次，然后合并乙酸乙酯提取液，将其减压蒸馏浓缩至干，用1-5毫升的甲醇溶解，用硅胶柱分离，以石油醚∶乙酸乙酯按体积比从10∶1到4∶6梯度洗脱；再将盐酸水解后茚三酮显色的部分用硅胶柱分离，薄层层析法分析后将性质相同的组分合并，制得环二肽类化合物。
2.根据权利要求1所述的环二肽类化合物的用途，其特征在于该环二肽类化合物用于防除反枝苋、藜、决明、早熟禾和马唐杂草。
全文摘要
本发明的环二肽类化合物的生物制备方法是以保藏编号为CGMCC NO.0902的高效生物除草菌野油菜黄单胞菌反枝苋致病变种为菌种，经发酵、分离、提纯得多个环二肽类化合物，本发明方法简便可行，对环境没有污染；所用原料廉价，易于形成大规模批量生产，生产成本低，产率较高。经测定，本发明方法制得的环二肽类化合物对反枝苋、藜、决明、早熟禾、马唐等杂草表现出较好的生物除草活性。
文档编号C12P21/02GK1557961SQ200410015840
公开日2004年12月29日 申请日期2004年1月13日 优先权日2004年1月13日
发明者李永泉, 李明智, 庄晓峰, 孙自玲, 徐凌 申请人:浙江大学